子癇前期患者胎盤組織中抑微管裝配蛋白1表達對滋養層細胞的影響及其機制

歐曼穎, 胡春霞, 李躍萍,2

（1. 海南醫學院第一附屬醫院產科，海南 ?？?570100； 2. 海南醫學院組織學與胚胎學教研室，海南 ?？?570100）

子癇前期（pre-eclampsia，PE）是一種妊娠期特有的疾病，以妊娠20 周后出現高血壓和蛋白尿為主要特征［1］。胎盤作為維持胎兒生長發育的重要器官，不僅為胎兒提供營養，還可合成并分泌多種激素、酶、神經遞質和細胞因子等物質促進胚胎的發育。研究［2-3］顯示：PE 是胎盤源性疾病，終止妊娠并娩出胎盤是治療病情持續進展患者的唯一有效措施。因此，進一步了解胎盤功能障礙的分子機制對PE 的防治具有重要意義?！皟呻A段”模型是描述PE 病因和發病機制的理論假說，該模型認為滋養層細胞是胎盤中最重要的功能細胞，其入侵不足是導致胎盤發育異常的主要原因［4］。上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition， EMT） 在調控細胞遷移和侵襲中起重要作用，其標志是E-鈣黏蛋白 （E-cadherin） 和 N- 鈣黏蛋白（N-cadherin）等非上皮鈣黏蛋白的表達變化和再平衡［5］。妊娠期間，EMT 的異常調節可導致滋養層細胞侵襲不足和胎盤血管重鑄異常，并會進一步誘導PE 的產生和胎兒生長受限等情況發生［6］。

抑微管裝配蛋白1（stathmin 1，STMN1） 是由位于人類1 號染色體上STMN1 基因編碼的蛋白分子。STMN1 是一種重要的胞質磷酸蛋白，可通過阻滯微管蛋白的聚合和增加微管的突變促進微管去穩態，并參與調節微管的動力學［7］。STMN1 廣泛參與多種腫瘤細胞的分化、增殖、侵襲和遷移，如細胞中STMN1 功能障礙可導致微管的重組裝和細胞周期的紊亂，從而誘導細胞的癌變和腫瘤形成［8］。研究［9-10］顯示：STMN1 在嚙齒動物和人類胎盤組織中的表達水平較高，而STMN1 表達的降低可能通過抑制滋養層細胞的增殖和侵襲功能參與復發性流產的發生。但在PE 患者中，STMN1 在胎盤組織中的表達及其相關作用機制尚未完全闡明。因此，本研究探討STMN1 在正常妊娠者與PE 患者胎盤組織中的表達差異，并闡明其對滋養細胞功能的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 一般資料選取2020 年10 月—2022 年6 月于海南醫學院第一附屬醫院產科采集并保存的17 名健康妊娠孕產婦（對照組）和15例PE患者（PE 組）的胎盤組織。納入標準：①PE 的診斷標準參考第9 版《婦產科學》［11］的診療標準；②2 組研究對象均為自然單胎受孕，未并發胎盤早剝和前置胎盤等妊娠并發癥，且無早產、宮內死胎和胎兒染色體異常等不良分娩史；③2 組研究對象均經陰道分娩，且孕期未使用避孕藥、免疫調節劑或其他激素類藥物，臨床資料完整。排除標準：①研究對象年齡<20 歲或>35 歲；②并發原發性高血壓、肝腎疾病、心臟疾病、糖尿病、甲狀腺疾病和自身免疫性疾病者；③患者或家屬拒絕簽署知情同意告知書者。本研究經海南醫學院第一附屬醫院倫理委員會審批，倫理審批號：K202009-12。

1.2 細胞、主要試劑和儀器人滋養層細胞系HTR-8/SVneo（HTR-8） 購自中國科學院上海細胞庫。RPMI-1640 培養基、胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）和Lipofectamine 2000 轉染試劑（美國Invitrogen 公司），沉默STMN1 的小干擾RNA（small interfering RNA， siRNA） （siRNASTMN1）、 陰性對照序列 （siRNA-NC） 和STMN1 的過表達質粒（pcDNA3.1-STMN1） 及陰性對照序列（pcDNA3.1-NC）（上海吉瑪制藥技術有限公司），TRIzol 試劑和BCA 蛋白定量試劑盒（美國Life Technologies 公司），逆轉錄試劑盒SYBR Premix Ex Taq 和實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）試劑盒SYBR Premix Ex Taq （日本TaKaRa 公司），基質膠（美國BD 公司），大鼠抗STMN1 、E-cadherin 和 N-cadherin 抗體（美國Abcam 公司），CCK-8 試劑盒（美國Sigma 公司），大鼠抗GAPDH 抗體、辣根過氧化物酶標記的兔抗大鼠免疫球蛋白G （immunoglobulin G，IgG） 抗體和RIPA 裂解緩沖液（上海碧云天生物技術有限公司）， 免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）染色試劑盒（美國Cell Signaling Technology公司），RT-qPCR 引物［生工生物工程（上海）股份有限公司］。光學顯微鏡（Axio 型，德國ZEISS公司），超凈工作臺（美國Thermo 公司）。

1.3 HTR-8 細胞轉染和分組采用含10%FBS 的RPMI-1640 完全培養基于37 ℃、5%CO2的培養箱中培養HTR-8 細胞。按照Lipofectamine 2000 轉染試劑使用說明書方法將 siRNA-STMN1 和pcDNA3.1-STMN1 及其陰性對照序列siRNA-NC和pcDNA3.1-NC 轉染入細胞中。將HTR-8 細胞分為 siRNA-STMN1 組 （轉染 siRNA-STMN1）、siRNA-NC 組（轉染陰性對照序列siRNA-NC）、pcDNA3.1-STMN1 組（轉染pcDNA3.1-STMN1）和 pcDNA3.1-NC 組 （轉染陰性對照序列pcDNA3.1-NC）。

1.4 IHC 染色法觀察2 組研究對象胎盤組織中STMN1 和EMT 相關蛋白表達強度將胎盤組織樣本于4% 甲醛溶液固定24 h，石蠟包埋并切片后，經二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，高壓下置于pH 值為9.0 的Tris-EDTA 緩沖液中進行抗原修復，3%過氧化氫溶液阻斷內源性過氧化物酶，5%山羊血清進行抗體封閉后，加入STMN1（1∶100）、N-cadherin （1∶300） 和E-cadherin （1∶300） 抗體，4 ℃下孵育過夜，充分洗滌后，加入生物素標記的二抗（1∶500），室溫下孵育2 h，DAB 染色，蘇木精復染后，再次進行梯度酒精脫水和二甲苯透明，中性樹膠封片后倒置顯微鏡觀察并拍照，觀察STMN1 和EMT 相關蛋白表達強度。

1.5 CCK-8 法檢測各組HTR-8 細胞增殖率取各組HTR-8 細胞，按每孔2×103個細胞的密度接種于96 孔細胞培養板中，加入CCK-8 試劑，接種0、24、48 和72 h 后于酶標儀450 nm 波長處檢測各孔吸光度（A）值，以各組細胞接種0 h 時A 值為對照組A 值，計算細胞增殖率。細胞增殖率=（實驗組A 值—對照組A 值）/對照組A 值×100%。每組每個時間點設置5 個復孔。實驗單獨重復3 次。

1.6 細胞劃痕實驗檢測各組HTR-8 細胞遷移率將各組HTR-8 細胞按每孔1×106個細胞的密度接種于6 孔細胞培養板中，使用完全培養基培養細胞，待細胞生長融合至95%時，采用200 μL 無菌移液器槍頭垂直于培養板底部劃出間隔為1 cm 的平行線，刮除線內細胞，拍照，計為0 h 劃痕寬度（W0）。改用無血清培養基進行培養24 h 后，再次拍照，作為24 h 的劃痕寬度（W24）。采用Image J 軟件分析，計算各組細胞遷移率。細胞遷移率= （W0—W24）/W0×100%。實驗單獨重復3 次。

1.7 Transwell 小室實驗檢測各組HTR-8 細胞侵襲能力取各組HTR-8 細胞，按每孔2×105個細胞的密度接種于預先包被BD 基質膠的Transwell小室（孔徑為8 μm）中，并加入200 μL 的無血清培養基，下室為600 μL 含10% FBS 的完全培養基，于37 ℃、5% CO2培養箱中孵育24 h 后，采用4%多聚甲醛溶液在室溫下固定進入下室的細胞30 min，0.1%結晶紫溶液在室溫下染色20 min 后，倒置顯微鏡下每組隨機選取5 個視野進行拍照，并計數進入下室的細胞數量，以侵襲細胞數代表細胞侵襲能力。實驗單獨重復3 次。

1.8 RT-qPCR 法檢測2 組研究對象和各組HTR-8細胞中STMN1 mRNA 表達水平采用TRIzol 試劑提取2 組研究對象胎盤組織和各組HTR-8 細胞中總RNA。 根據試劑盒說明書方法采用SYBR PreMix Ex Taq 試劑盒將RNA 反向轉錄為cDNA，采用SYBR PreMix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒進行RT-qPCR反應。引物序列：STMN1上游引物5′-AGAACCGAGAGGCACAAATG-3′， STMN1 下游引 物 5′-AGTCAGCAGGGTCTTTGGATT-3′；GAPDH 上游引物5′-AGAAGGTGGTGAAGCAGGCGTC-3′，GAPDH 下游引物 5′-AAAGGTGGAGGAGTGGGTGTCG3′，以GAPDH 為內參，采用2—??Ct法計算2 組研究對象胎盤組織和各組HTR-8 細胞中STMN1 mRNA 表達水平。

1.9 Western blotting 檢測2 組研究對象和各組HTR-8 細胞中STMN1、E-cadherin 和N-cadherin蛋白表達水平采用RIPA 裂解緩沖液提取2 組研究對象胎盤組織和各組HTR-8 細胞總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。取約30 μg 等量蛋白樣品于10% SDS-PAGE 凝膠中電泳分離，將蛋白條帶轉移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉在室溫下封閉抗體2 h 后，4 ℃下加入一抗：STMN1 （1∶500）、E-cadherin （1∶800）、 N-cadherin （1∶800） 和GADPH（1∶1 000），4 ℃下孵育過夜，然后加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶2 000），室溫下孵育2 h，最后加入ECL 試劑盒在凝膠成像系統中顯示蛋白條帶。以GAPDH為內參，采用FusionCapt Advance Fx5 軟件采集圖像，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值。實驗單獨重復3 次。

1.10 統計學分析采用GraphPad Prism 7.0 統計軟件進行統計學分析。2 組研究對象胎盤組織中STMN1 mRNA 和蛋白表達水平、各組HTR-8 細胞中STMN1 mRNA 和蛋白表達水平、細胞增殖率、細胞遷移率、侵襲細胞數和細胞中E-cadherin和N-cadherin 蛋白表達水平均符合正態分布，以xˉ±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用Dunnett’s 事后檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 2 組研究對象一般資料與對照組比較，PE 組患者收縮壓、舒張壓和尿蛋白水平均明顯升高（P<0.01），新生兒體質量增加（P<0.05）。見表1。

表1 2 組研究對象一般資料Tab. 1 General data of subjects in two groups(±s）

表1 2 組研究對象一般資料Tab. 1 General data of subjects in two groups(±s）

*P<0.05,**P<0.01 vs control group.

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2.2 2 組研究對象胎盤組織中STMN1 和EMT 相關蛋白表達強度與對照組比較，PE 組患者胎盤絨毛組織中 STMN1 蛋白表達強度增大，E-cadherin 蛋白表達強度增大，N-cadherin 蛋白表達強度減小。見圖1 和2。

圖1 IHC 染色觀察2 組研究對象胎盤組織中STMN1 蛋白表達強度（×400）Fig. 1 Expression intensities of STMN1 protein in placenta tissue of subjects in two groups observed by IHC staining (×400)

圖2 IHC 染色觀察2 組研究對象胎盤組織中E-cadherin 和N-cadherin 蛋白表達情況（×400）Fig. 2 Expressions of E-cadherin and N-cadherin proteins in placenta tissue of subjects in two groups observed by IHC staining (×400)

2.3 各組HTR-8 細胞增殖率與siRNA-NC 組比較，接種48 和72 h 時，siRNA-STMN1 組HTR-8細胞增殖率降低（P<0.05）。與pcDNA3.1-NC 組比較，接種48 和72 h 時，pcDNA3.1-STMN1 組HTR-8 細胞增殖率升高（P<0.05）。見圖3。

圖3 CCK-8 法檢測各組HTR-8 細胞增殖率Fig. 3 Proliferation rates of HTR-8 cells in various groups detected by CCK-8 method

2.4 各組HTR-8 細胞遷移率與siRNA-NC 組（22.23%±7.41%） 比 較， siRNA-STMN1 組HTR-8 細胞遷移率（10.05%±4.82%）降低（P<0.05）。與pcDNA3.1-NC組（24.07%±6.68%）比較， pcDNA3.1-STMN1 組HTR-8 細胞遷移率（38.88%±11.59%）升高（P<0.05）。見圖4。

圖4 細胞劃痕實驗檢測各組HTR-8 細胞遷移能力（×100）Fig. 4 Migration abilities of HTR-8 cells in various groups observed by cell scratch healing assay（×100）

2.5 各組HTR-8細胞侵襲細胞數與siRNA-NC組（98.67 個±21.11 個）比較，siRNA-STMN1 組侵襲細胞數（45.00 個±17.90 個） 明顯減少（P<0.01）。與pcDNA3.1-NC組（109.35個±26.75 個）比 較， pcDNA3.1-STMN1 組 侵 襲 細 胞 數（244.00 個±32.33 個） 明顯增加（P<0.01）。見圖5。

圖5 Transwell 小室實驗檢測各組HTR-8 細胞侵襲能力（結晶紫，×200）Fig. 5 Invasion abilities of HTR-8 cells in various groups detected by Transwell chamber experiment (Crystal violet,×200)

2.6 2 組研究對象胎盤組織和各組HTR-8 細胞中STMN1 mRNA 表達水平與對照組（1.03±0.09） 比較， PE 組患者胎盤組織中STMN1 mRNA 表達水平 （0.33±0.14） 降低（P<0.05）。與siRNA-NC 組比較，siRNA-STMN1 組HTR-8 細胞中STMN1 mRNA 表達水平明顯降低（P<0.01）。與pcDNA3.1-NC 組比較，pcDNA3.1-STMN1 組HTR8 細胞中STMN1 mRNA 表達水平明顯升高（P<0.01）。siRNA-NC 組和pcDNA3.1-NC 組HTR-8 細胞中STMN1 mRNA 表達水平比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖6。

圖6 RT-qPCR 法檢測各組HTR-8 細胞中STMN1 mRNA 表達水平Fig. 6 Expression levels of STMN1 mRNA in HTR-8 cells in various groups detected by RT-qPCR method

2.7 2 組研究對象胎盤組織和各組HTR-8 細胞中STMN1、E-cadherin 和N-cadherin 蛋白表達水平與對照組（0.78±0.12） 比較，PE 組患者胎盤組織中STMN1 蛋白表達水平（0.21±0.09）降低（P<0.05）。 與siRNA-NC 組比較， siRNASTMN1 組 HTR-8 細 胞 中 STMN1 和N-cadherin 蛋白表達水平降低 （P<0.05），E-cadherin 蛋白表達水平升高（P<0.05）。 與pcDNA3.1-NC 組比較，pcDNA3.1-STMN1 組HTR-8 細胞中STMN1 和N-cadherin 蛋白表達水平升高（P<0.05），E-cadherin 蛋白表達水平降低（P<0.05）。見圖7 和8。

圖7 Western blotting 法檢測2 組研究對象胎盤組織中STMN1 蛋白表達電泳圖Fig. 7 Electrophoregram of expression of STMN1 protein in placenta tissue of patients in two groups detected by Western blotting method

圖8 Western blotting 法檢測各組HTR-8 細胞中STMN1、E-cadherin 和N-cadherin 蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig. 8 Electrophoregram(A) and histogram(B) of expressions of STMN1, E-cadherin， and N-cadherin proteins in HTR-8 cells in various groups detected by Western blotting method

3 討 論

PE 嚴重影響母嬰健康，是妊娠女性和胎兒死亡的主要原因［1］。而在PE 發生發展的多種因素中，滋養層細胞侵襲功能的不足被認為是PE 發病機制的根本原因［1-2，12］。STMN1 是一種可調節微管動力學的胞質磷酸蛋白，研究［8］顯示：STMN1 可廣泛參與腫瘤的發生發展，STMN1 在肝癌組織中的表達水平明顯高于癌旁正常組織。研究［13］顯示：在肝癌HepG2 和SNU-398 細胞中，上調STMN1表達可通過激活Yes 相關蛋白1 信號通路促進細胞增殖和侵襲。在卵巢癌組織中，STMN1 表達呈異常上調，且STMN1 表達水平與患者國際婦產科聯合會（Federation International of Gynecology and Obstetrics，FIGO） 分期和腫瘤的分化程度有關。STMN1 還可促進卵巢癌細胞的增殖和遷移，提示STMN1 可能是卵巢癌治療的生物靶點［14］。本研究結果顯示：與對照組比較，PE 組患者胎盤組織中STMN1 表達水平明顯降低，且在滋養層細胞中敲低或過表達STMN1 可抑制或促進細胞的增殖和侵襲，提示STMN1 可能通過調節滋養層細胞的EMT 過程中E-cadherin 與N-cadherin 表達參與影響滋養層細胞的遷移和侵襲。

EMT 是胚胎發育與胎盤的形成過程中的關鍵環節。在EMT 過程中，絨毛滋養細胞進一步分化為絨毛外細胞滋養細胞，并獲得細胞遷移和侵襲能力［15-17］。在膀胱癌組織中，STMN1參與了長鏈非編碼RNA （long non-coding RNA， lncRNA） ST6 GALNAC6/微小RNA（micro RNA，miR）-200a-3p軸調控的腫瘤細胞EMT 和轉移過程［18］。在間變性甲狀腺癌組織中，血液和神經系統表達1（hematological and neurological expressed 1，HN1）蛋白的高表達可通過上調STMN1 mRNA 表達水平，降低α-微管蛋白的乙?；源龠M腫瘤細胞和裸鼠移植瘤的EMT 進程［19］。本研究結果顯示：滋養層細胞STMN1 可影響細胞中EMT 特異性標志物E-cadherin 和N-cadherin 的表達，進而調控滋養層細胞的遷移和侵襲。這與上述研究［18-19］結果一致，提示STMN1 可通過參與調控EMT 過程而影響細胞遷移和侵襲。此外，本研究結果顯示：PE 患者胎盤組織中STMN1 表達下調與滋養層細胞中E-cadherin 和N-cadherin 表達下調有關聯，表明STMN1 通過調節EMT 過程而在細胞遷移和侵襲中發揮重要作用。

然而，關于STMN1 在妊娠早期胎盤形成過程中的作用，GOU 等［20］發現：STMN1 表達在假妊娠中無明顯變化，但胚胎著床的激活或蛻膜化的誘導可使其表達明顯增加，而沉默STMN1 明顯抑制細胞蛻膜化，提示STMN1 可能是參與胚胎植入的潛在調控因子，其可能在細胞蛻膜化中起關鍵作用。

綜上所述，STMN1 可能在調節滋養層侵襲過程中起關鍵作用，STMN1 可能通過調控細胞的EMT 進程進而參與PE 的發生發展。