lncRNA GPRC5D-AS1 對地塞米松誘導小鼠成肌細胞肌萎縮的抵抗和再生作用及其機制

張瑞鵬, 李 杰

（吉林大學第一醫院干部病房，吉林 長春 130021）

肌萎縮是指肌肉的體積和質量減小及肌肉正常功能受損，其發生主要與肌肉蛋白質代謝異常、肌細胞異常凋亡和肌肉及血管再生困難等有關［1］。研究［2］顯示：肌萎縮與鐵死亡之間有密切關聯，鐵超載破壞了線粒體的功能和形態，導致肌肉萎縮。研究［3］顯示：在肌萎縮動物模型和患者的肌肉中均存在鐵積累。非必要鐵積累會引起鐵代謝或線粒體功能紊亂，與骨骼肌萎縮有關聯［4］。LU 等［5］通過高劑量地塞米松建立的骨質疏松小鼠模型進一步證實了鐵死亡與骨質疏松癥的關系。過量使用糖皮質激素也可能通過p62-Keap1-核因子-紅細胞2 相關因子2 （nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）通路引發鐵死亡［6］。因此，鐵死亡是肌萎縮發生的原因之一。

長鏈非編碼RNA （long non-codingRNA，lncRNA） 廣泛存在于動植物細胞中，能夠與DNA、RNA 或蛋白質相互作用，調控生物體的各項生理過程。研究［7］顯示：在骨骼肌和肌肉萎縮細胞模型中，lncRNA GRPC5D-AS1 可能是引起肌萎縮及衰老相關疾病的關鍵RNA。在肺癌中，lncRNA GRPC5D-AS1 在自噬、代謝、絲裂原活化蛋 白 激 酶 （mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑和Janus 激酶（Janus kinase，JAK）/信號傳導及轉錄激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT）途徑均有調控作用［8］。前期研究［9］證實：lncRNA GPRC5D-AS1可能參與骨骼肌肌肉萎縮。因此，本研究探討lncRNA GPRC5D-AS1 對地塞米松誘導的小鼠成肌細胞肌萎縮的抵抗和再生作用，并闡明其可能的作用機制，為臨床治療和新藥研發提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器小鼠成肌細胞C2C12細胞（北京北納創聯生物科技有限公司）。地塞米松（美國Med Chemexpress 生物科技公司），胎牛血清、DMEM 培養基和雙抗（美國Gibco 公司），噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）細胞增殖和細胞毒性檢測試劑盒（北京百瑞極生物有限公司），TRIzol 總RNA 提取試劑和PrimeScript?RT Master Mix 試劑盒（日本TaKaRa 公司），引物合成由湖南艾克瑞生物公司完成，鐵離子（Fe2+）試劑盒和丙二醛（malondialdehyde，MDA） 試劑盒（武漢Elabscienc 公司）， 活性氧（reactive oxygen species，ROS） 檢測試劑盒（上海翌圣生物公司）、長鏈脂酰輔酶A 合成酶（long-chain acylcoenzyme A synthetase，ACSL）4、溶質載體家族7成員 11 （solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）、谷胱甘肽過氧化酶4 （glutathione peroxidase 4， GPX4）、 甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH） 和辣根過氧化物酶 （horseradish peroxidase，HRP） 標記的山羊抗兔二抗（英國Abcam 公司），lncRNA GRPC5D-AS1-OE （廣東Ribobio 生物技術公司有限公司）。高速冷凍離心機（美國 Beckman Coulter 公司），光學顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡（日本 Olympus 公司），全波長酶標儀（美國MD 公司），電泳檢測系統（美國BioRad公司），超薄切片機（Leica UC7）（奧地利維也納徠卡儀器有限公司），透射電子顯微鏡HT7700（日本日立儀器公司）， 150 目方華膜銅網（AZH150）（北京中鏡科儀技術有限公司）。

1.2 細胞培養和肌萎縮模型構建將C2C12 細胞置于含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM 培養基中，于37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中常規培養，定期觀察，每3 d 更換1 次培養基，當細胞融合度達85% 以上時，更換為含0、25、50、75、100、 200 和400 mg·L－1地塞米松的DMEM 培養基，分別培養24、48 和72 h 后，加入0.25%胰蛋白酶消化。取對數生長期細胞，以每孔5×103個細胞的密度接種至96 孔細胞培養板中，每孔100 μL。每孔加入20 μL MTT 試劑，繼續孵育4 h?？字屑尤攵谆鶃嗧浚╠imethyl sulfoxide， DMSO），37 ℃烘箱中孵育0.5 h。采用酶標儀檢測波長490 nm 處各孔吸光度（A）值，計算細胞存活率。細胞存活率=（實驗孔A 值－空白孔A 值）/（對照孔A 值－空白孔A 值）×100%。根據不同濃度地塞米松誘導不同時間后C2C12 細胞的存活率篩選最佳作用劑量和時間。采用實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR， RT-qPCR） 法檢測C2C12 細胞中lncRNA GPRC5D-AS1 表達水平，以驗證肌萎縮模型。

1.3 細胞分組和轉染取生長狀態良好的C2C12細胞分為正常組、模型組、lncRNA GRPC5DAS1-NC 組（轉染lncRNA GRPC5D-AS1-NC） 和lncRNA GRPC5D-AS1-OE 組 （轉 染 lncRNA GRPC5D-AS1-OE）。正常組細胞常規培養，其余各組細胞采用100 mg·L－1地塞米松誘導構建肌萎縮細胞模型，出現明顯的細胞萎縮、細胞體積減小和形態改變即為造模成功［10］。lncRNA GRPC5DAS1-OE 由廣東Ribobio 生物技術公司有限公司合成。選取對數生長期C2C12細胞，以每孔1×105個細胞的密度接種至24 孔細胞培養板中，每孔1 mL。 采用 Lipofectamine 2000 分別將lncRNA GRPC5D-AS1-NC 和lncRNA GRPC5D-AS1-OE 轉染至對應組中。

1.4 RT-qPCR 法檢測各組細胞中lncRNA GRPC5D-AS1 表達水平采用TRIzol 試劑提取各組總RNA，按照試劑盒說明書操作，逆轉錄為cDNA，進行RT-qPCR 反應。反應條件： 95 ℃、5 min，95 ℃、15 s，55 ℃、15 s，72 ℃、1 min，72 ℃、5 min，共30 個循環。采用2－ΔΔCt法計算各組細胞中lncRNA GRPC5D-AS1 表達水平。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.5 流式細胞術檢測各組細胞中ROS 水平選取各組對數生長期細胞，制備為200 μL細胞懸液，接種于6 孔細胞培養板中培養。加入C11 BODIPY 581/591 染液，37 ℃、5% CO2培養箱中孵育0.5 h。棄去培養液，消化并收集細胞， 250 μL 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS） 重懸，采用流式細胞儀檢測各組細胞中ROS 水平。

1.6 酶 聯 免 疫 吸 附 試 驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測各組細胞中MDA、Fe2+和GPX4 水平各組細胞給藥處理后，消化并收集細胞，按照試劑盒操作說明書操作，采用酶標儀分別于波長532、593 和450 nm 處檢測吸光度（A） 值，以A 值代表各組細胞中MDA、Fe2+和GPX4 水平。

1.7 透射電鏡觀察各組細胞線粒體超微結構表現各組細胞置于2.5%戊二醛中固定2~4 h，磷酸漂洗液漂洗3 次，1%鋨酸4 ℃固定2 h；雙蒸水漂洗3 次后乙醇梯度脫水，環氧丙烷過渡，812 樹脂梯度滲透后包埋，60 ℃聚合，采用Leica UC7 型超薄切片機進行半薄定位和超薄切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染色，透射電鏡觀察各組細胞超微結構表現。

1.8 免疫熒光法檢測各組細胞中成肌分化蛋白（myogenic differentiation protein，MyoD）表達情況選取各組細胞，4 ℃孵育MyoD一抗（1∶100）過夜，次日Hank’s平衡鹽溶液（Hank’s balanced salt solution，HBSS）常溫洗滌3次，四甲基羅丹明異硫氰酸酯（tetramethylrhodamine isothiocyanate，TRITC）標記熒光二抗（1∶5 000） 室溫下孵育1 h，HBSS 洗滌細胞2 次，DAPI（1∶10 000） 室溫下孵育5 min，HBSS洗滌細胞3次，熒光顯微鏡下觀察并拍照，紅色代表MyoD 表達，藍色代表細胞核。

1.9 Western blotting 法檢測各組細胞中鐵死亡相關蛋白ACSL4、SLC7A11 和GPX4 蛋白表達水平收集并裂解細胞，進行蛋白定量，上樣、轉膜和封閉，4 ℃一抗孵育過夜，ACSL4、SLC7A11 和GPX4 抗體稀釋比例為1∶1 500，GAPDH 抗體稀釋比例為1∶2 000。次日二抗（1∶5 000） 孵育。采用凝膠成像儀成像，采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH 為內參，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值。

1.10 統計學分析采用SPSS 17.0 統計軟件進行統計學分析，采用 Graphpad 9.4.1 軟件繪制統計圖。各組細胞存活率，細胞中lncRNA GRPC5DAS1 表達水平，細胞中GPX4、Fe2+和MDA 水平，ACSL4、SLC7A11 和GPX4 蛋白表達水平均符合正態分布，以±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 肌萎縮模型驗證與0 mg·L－1地塞米松比較，25、50 和75 mg·L－1地塞米松誘導的C2C12 細胞存活率無明顯變化；200 和400 mg·L－1地塞米松誘導的C2C12 細胞存活率較低，無法用于后續實驗。因此，選用100 mg·L－1地塞米松進行后續實驗。與誘導0 h 比較，誘導24 h 后C2C12 細胞存活率無明顯變化；誘導72 h 后C2C12 細胞存活率較低；因此，選用誘導時間為48 h。見表2 和3。RT-qPCR 法檢測結果顯示：與正常C2C12 細胞（1.002±0.090） 比較，100 mg·L－1地塞米松誘導48 h 后C2C12 細胞中lncRNA GPRC5D-AS1表達水平（0.359±0.010）降低（P<0.05），證實lncRNA GPRC5D-AS1 在肌萎縮模型中具有調控作用。

表2 不同劑量地塞米松作用后C2C12 細胞存活率Tab. 2 Survival rates of C2C12 cells after treated with different doses of dexamethasone(n=5）

表3 作用不同時間后C2C12 細胞存活率Tab. 3 Survival rates of C2C12 cells after treated for different time(n=5）

2.2 各組細胞中lncRNA GRPC5D-AS1 表達水平與正常組比較， 模型組細胞中lncRNA GRPC5D-AS1 表達水平降低（P<0.05）。與模型組和lncRNA GRPC5D-AS1-NC 組比較，lncRNA GRPC5D-AS1-OE 組細胞中lncRNA GRPC5DAS1 表達水平升高（P<0.05）。模型組和lncRNA GRPC5D-AS1-NC 組細胞中lncRNA GRPC5DAS1 表達水平比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖1。

圖1 各組細胞中lncRNA GRPC5D-AS1 表達水平Fig. 1 Expression levels of lncRNA GRPC5D-AS1 in cells in various groups

2.3 各組細胞中ROS 水平與正常組比較，模型組細胞中ROS 水平升高（P<0.05）。與模型組和lncRNA GRPC5D-AS1-NC 組 比 較， lncRNA GRPC5D-AS1-OE 組細胞中ROS 水平降低（P<0.05）。模型組和lncRNA GRPC5D-AS1-NC 組細胞中ROS 水平比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖2。

圖2 流式細胞術檢測各組細胞中ROS 水平Fig. 2 Levels of ROS in cells in various groups detected by flow cytometry

2.4 各組細胞中GPX4、Fe2+和MDA 水平與正常組比較，模型組細胞中Fe2+和MDA 水平升高（P<0.05），GPX4 水平降低（P<0.05）。與模型組和lncRNA GRPC5D-AS1-NC 組比較，lncRNA GRPC5D-AS1-OE 組細胞中Fe2+和MDA 水平降低（P<0.05），GPX4 水平升高（P<0.05）。模型組和lncRNA GRPC5D-AS1-NC 組細胞中GPX4、Fe2+和MDA 水平比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表4。

表4 各組細胞中GPX4、Fe2+和MDA 水平Tab. 4 Levels of GPX4、Fe2+ and MDA in cells in various groups[n=3，±s，ρB/（ng·L－1）］

表4 各組細胞中GPX4、Fe2+和MDA 水平Tab. 4 Levels of GPX4、Fe2+ and MDA in cells in various groups[n=3，±s，ρB/（ng·L－1）］

*P<0.05 vs normal group； △P<0.05 vs model group；#P<0.05 vs lncRNA GPRC5D-AS1-NC group.

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2.5 透射電鏡觀察各組細胞線粒體超微結構表現正常組細胞外形圓整，大小正常，膜上絨毛豐富，線粒體細胞器形態正常；模型細胞中線粒體數量減少，胞漿顆?；?，線粒體結構模糊腫脹并出現典型鐵死亡相關現象；lncRNA GRPC5D-AS1-NC組細胞中線粒體數量和體積均增加，線粒體嵴數量增加，線粒體結構清晰；lncRNA GRPC5D-AS1-OE 組細胞中線粒體數量有所增加，胞漿顆?；F象減少，線粒體結構較清晰。見圖3。

圖3 透射電鏡觀察各組細胞中線粒體超微結構表現（×2 500 ）Fig. 3 Ultrastructure morphology of mitochondrial in cells in various groups observed by transmission electron microscope（×2 500）

2.6 各組細胞中MyoD 表達情況與正常組比較，模型組細胞中MyoD 表達量減少，細胞發生肌萎縮。與模型組和lncRNA GRPC5D-AS1-NC 組比較，lncRNA GRPC5D-AS1-OE 組細胞中MyoD 表達量明顯增加，細胞肌萎縮現象緩解，成肌細胞再生較多。見圖4。

圖4 免疫熒光法檢測各組細胞中MyoD 表達情況（×400）Fig. 4 Expression of MyoD in cells in various groups detected by immunofluorescence（×400）

2.7 各組細胞中ACSL4、SLC7A11 和GPX4 蛋白表達水平與正常組比較，模型組細胞中ACSL4蛋白表達水平升高（P<0.05）， SLC7A11 和GPX4 蛋白表達水平降低（P<0.05）。與模型組和lncRNA GRPC5D-AS1-NC 組 比 較， lncRNA GRPC5D-AS1-OE 組細胞中ACSL4 蛋白表達水平降低（P<0.05），SLC7A11 和GPX4 蛋白表達水平升高（P<0.05）。模型組和lncRNA GRPC5DAS1-NC 組細胞中ACSL4、SLC9A11 和GPX4 蛋白表達水平比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖5。

圖5 Western blotting 法檢測各組細胞中ACSL4、SLC7A11 和GPX4 蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig. 5 Electrophoregram(A) and histogram(B) of expressions of ACSL4,SLC7A11 and GPX4 proteins in cells in various groups detected by Western blotting method

3 討 論

地塞米松由于其強大的抗炎和抗休克的功能在醫學領域廣泛使用。然而長期服用地塞米松會伴隨肌肉萎縮等不良反應，且肌肉萎縮一旦發生則難以逆轉。骨骼肌質量和功能的完整性對維持肌肉骨骼系統的正常功能和代謝穩態至關重要。本課題組前期研究［7］證實：lncRNA AC004797.1、lncRNA PRKG1-AS1 和lncRNA GRPC5D-AS1 是骨骼肌衰老的關鍵 lncRNA。 lncRNA PRKG1-AS1 和lncRNA GRPC5D-AS1 可緩解地塞米松誘導的肌萎縮和細胞衰老現象［7］。

由于地塞米松的廣泛使用，鐵相關的骨骼肌疾病成為研究熱點。研究［11］顯示：肌萎縮癥與鐵死亡之間有密切關聯。研究［9，12］顯示：在去神經誘導的骨骼肌萎縮模型中可檢測到線粒體中ROS 水平升高，且在肌肉質量缺失前已有升高趨勢。提示線粒體中ROS 水平可能是影響肌萎縮發生的重要因素。鐵死亡是以鐵依賴性細胞內脂質ROS（lipid-ROS，L-ROS）積累為主要特征的細胞死亡方式，主要表現為細胞精細結構中出現較小的線粒體，線粒體膜收縮，線粒體嵴減少或消失，外膜斷裂，細胞核形態變化不明顯［13-15］。本研究結果顯示：肌萎縮模型中，線粒體數量減少，且線粒體嵴減少或消失并伴隨線粒體結構腫脹，與鐵死亡典型的精細結構變化一致；過表達lncRNA GRPC5DAS1 后，線粒體形態變化緩解。流式細胞術檢測結果顯示：與肌萎縮模型組比較，過表達lncRNA GRPC5D-AS1 后細胞中ROS 水平降低，提示lncRNA GRPC5D-AS1 可調節鐵死亡抵抗地塞米松所致的肌萎縮現象。

SLC7A11 作為鐵死亡的最關鍵的上游調節因子之一，研究［16］顯示：SLC7A11 驅動鐵死亡抗性，在多種疾病中發揮重要調控作用。SLC7A11不僅是鐵死亡的有效靶標，也可在多種疾病的治療中發揮重要作用［17-20］。SLC7A11 蛋白表達下調，通過抑制半胱氨酸代謝通路導致細胞內胱氨酸水平降低和谷胱甘肽（glutathione，GSH）生物合成耗竭，進一步抑制GPX4 蛋白活性，導致脂質過氧化物堆積，最終誘導細胞發生鐵死亡［21-24］。研究［12-13，25］顯示：鐵離子在觸發P53-SLC7A11 介導的肌肉鐵死亡中發揮關鍵作用，并表明靶向鐵積累和鐵死亡可能是治療肌少癥的治療策略。ACSL4是ACSL 家族中一員，在體內催化合成脂酰CoA作為脂肪酸分解代謝的第一步反應。ACSL4 可活化長鏈多不飽和脂肪酸以參與膜磷脂的合成。其中，ACSL4 將花生四烯酸和腎上腺酸分別合成為花生四烯酰CoA 和腎上腺酰CoA，使二者參與磷脂酰乙醇胺或磷脂酰肌醇等帶負電膜磷脂的合成。膜上的長鏈多不飽和脂肪酸在RSL3 等因素的誘導下被氧化，從而引發細胞鐵死亡［26-28］。通過抑制ACSL4 使肌肉細胞中GPX4 蛋白表達水平升高，脂質過氧化產物減少，改善橫紋肌溶解癥的發生發展［23］。

本研究結果顯示：在地塞米松誘導的肌萎縮細胞模型中，SLC7A11 蛋白表達水平降低，抑制GPX4 表達，使ACSL4 表達水平升高，造成脂代謝異常，細胞中ROS 水平升高及Fe2+和MDA 水平降低，誘發鐵死亡；過表達lncRNA GRPC5D-AS1能夠刺激SLC7A11 表達進而激活GPX4，抑制ACSL4 蛋白表達，激活脂代謝，降低細胞中ROS水平，抑制鐵死亡，提示lncRNA GRPC5D-AS1可通過SLC7A11/GPX4/ACSL4 信號軸抑制地塞米松引起的鐵死亡現象。

肌源性調節家族（myogenic regulatory family，MRF）在調節肌肉細胞中的基因轉錄、細胞生長周期和分化等方面發揮作用。MyoD 作為MRF 家族中的一員，是一種骨骼肌特異性bHLH 轉錄因子，參與肌肉分化和修復［29］。研究［30］顯示：MyoD 可嚴格控制肌肉干細胞增殖和分化間的平衡，并可作為維持肌肉生長和修復所需的細胞因子。 本研究結果顯示：地塞米松作用后，細胞鐵死亡加劇，肌萎縮細胞模型中MyoD 表達減少，造成修復再生障礙；過表達lncRNA GRPC5D-AS1可抵抗地塞米松誘導的鐵死亡，促進MyoD 表達，激活成肌細胞再生。

綜上所述，地塞米松作用C2C12 細胞后，細胞發生鐵死亡，成肌細胞再生障礙，lncRNA GPRC5D-AS1 可介導SLC7A11/GPX4/ACSL4 信號通路抑制地塞米松引起的鐵死亡，促進成肌細胞再生。