化學分析方法校準曲線有關問題的探討

劉景泰,劉秀洋,曲 翊

遼寧省大連生態環境監測中心,遼寧 大連 116023

校準是化學定量分析方法的先決條件,科學準確的校準是保證檢測結果準確的核心。目前國內分析方法標準絕大多數采用線性最小二乘法回歸校準曲線,也有極少情況下采用二階或三階校準曲線。絕大多數線性校準方法只對回歸系數提出要求,對校準曲線的檢驗方式未給出明確規定。對于校準曲線,一是要確定曲線的校準范圍,曲線最低點要與定量下限相銜接;二是曲線各點經擬合曲線重新計算后,擬合值與實際值偏差不能超過一定范圍。筆者通過研究國際、國內校準相關方法,提出校準曲線使用的具體原則,以期促進國家和行業標準中關于校準內容的方法制定和修訂,完善分析方法標準中關于校準曲線的線性范圍、校準方式和合格檢驗等相關內容。

1 校準曲線范圍的確定標準

分析方法的定量工作范圍應是校準曲線的最低點和最高點之間的濃度范圍。USEPA環境測量論壇規定,校準曲線應包含所測定樣品的濃度范圍[1]?！痘瘜W分析和水狀態監測的技術規范》(歐盟委員會指令2009/90/EC)規定,成員國應確保應用的所有分析方法滿足最低性能標準,即在環境質量標準濃度水平下的測量不確定度(k=2)小于等于環境質量標準的50%,測定下限等于或低于相關環境質量標準的30%,測定下限可從校準曲線上的最低校準點獲得[2]。CAC/GL 90—2017要求分析方法必須足夠靈敏,以使每種分析物的測定下限等于或低于當前法典最大殘留限量(CXL)[3]。

《水和廢水的檢驗方法20版》(美國公共衛生協會)規定,校準曲線最低濃度點選擇在測定下限處[4]。ISO 6107-2:2006規定,測定下限可使用適當的標準品或樣品進行計算,并且可以從校準曲線上的最低校準點獲得(不包括空白樣品)[5]。ISO 8466-1:2021規定,校準范圍的最低點濃度應大于或等于測定下限[6]。ISO/TS 13530:2009中規定,方法應用范圍的最低和最高濃度是通過精度和偏差驗證得到的,不能隨意擴大方法的濃度應用范圍[7]。

《環境監測分析方法標準制訂技術導則》(HJ 168—2020)規定,測定下限應盡可能滿足生態環境質量標準、生態環境風險管控標準、污染物排放標準、國際履約等生態環境管理工作中對目標物的最低限值濃度(含量)水平的測定要求[8]。

實際工作中,對于曲線的最高點,在盡量擴大工作濃度范圍的情況下,要保證校準曲線是線性,同時,最高點分析后不會對分析系統造成污染物殘留,影響下一個樣品的檢測結果準確性。同一個污染物,環境質量標準和污染物排放標準限值差別較大(有時達到3個數量級以上),所以在制定分析方法標準時要根據不同的要求采取不同的前處理方法。對于適用環境質量標準的分析方法,可以采取樣品富集濃縮等預處理步驟,降低方法檢出限和測定下限;對于適用于污染物排放標準的分析方法,則可以采用直接進樣等不對樣品進行富集濃縮的方法,提高方法的檢出限和測定下限。

綜上,校準曲線范圍應是最低點和最高點之間的濃度范圍,最低點濃度應在測定下限附近,且大于或等于測定下限,最高點應盡量擴大工作濃度范圍,且分析后不會對分析系統造成污染物殘留。

2 校準曲線的校準方式

ISO/TS 13530:2009中規定了3種校準方式:一是純標準溶液校準,適用于樣品基體對校準曲線的斜率和截距沒有顯著影響,同時也不需進行樣品制備的分析過程;二是使用帶有樣品基體的標準溶液校準,標準溶液用不含目標物的樣品基體或人造樣品基體配制,也同樣不需進行樣品制備過程;三是全程序校準,也可以稱為工作曲線校準,校準包含所有的樣品制備步驟,標準溶液用有代表性的基體材料制備。

ISO 8466-1:2021規定了5種線性校準方法,即外標法、內標法、全程序外標法、全程序內標法和標準添加法,5種線性校準方法的應用范圍見表1。

表1 5種線性校準方法應用范圍Table 1 Application range of five linear calibration methods

綜上,校準曲線的校準方式應根據方法原理、儀器的特點和樣品基質情況進行選擇,建議參照ISO/TS 13530:2009和ISO 8466-1:2021中規定選擇適合的校準方法。

3 校準濃度級別要求

ISO 8466-1:2021規定,對于多點校準,校準點濃度應分布在整個校準范圍內,至少應有5個校準點;對于1點和2點校準,每個濃度級別至少重復測定3個樣品。ISO 8466-2:2001推薦10個濃度級別校準[9]。USEPA 600系列方法規定至少要有3個校準點,最低點接近方法檢出限,最高點在線性范圍的上限附近,第3點濃度是最低點和最高點的中間濃度。大部分方法要求有5個以上校準點。USEPA SW-846的色譜方法中,線性校準需要做至少5點校準曲線,非線性二階校準需要做6點校準曲線,非線性三階校準需要做7點校準曲線,無論采用幾點校準曲線,各校準點中都不含零點[10]。

《化學分析方法驗證確認和內部質量控制要求》(GB/T 32465—2015)中規定,應在校準曲線濃度范圍均勻設置6個或6個以上的校準標準點(包括空白或1個低濃度標準點),不同濃度點的校準標準溶液要單獨配制,不能通過稀釋同一母液獲得[11]?！逗细裨u定 化學分析方法確認和驗證指南》(GB/T 27417—2017)中規定校準曲線至少具有6個校準點(包括空白),濃度范圍盡可能覆蓋1個或多個數量級,每個校準點至少以隨機順序重復測量2次,最好是3次或更多,校準用的標準點應盡可能均勻地分布在關注的濃度范圍內并能覆蓋該范圍。在理想的情況下,不同濃度的校準溶液應獨立配制,低濃度的校準點不宜通過稀釋校準曲線中高濃度的校準點進行配制[12]?！董h境監測分析方法標準制訂技術導則》(HJ 168—2020)要求校準曲線至少有6個校準點(包括零濃度)。

綜上,線性校準應按照《環境監測分析方法標準制訂技術導則》(HJ 168—2020)要求進行6點校準(包括零濃度),非線性二階校準曲線按照USEPA SW-846要求做7點校準(包括零濃度),非線性三階校準曲線按照USEPA SW-846要求做8點校準(包括零濃度),校準點應盡可能均勻地分布在線性范圍內。

4 校準曲線及線性檢驗方式

校準曲線分為線性和非線性2種。線性回歸曲線包括線性最小二乘法回歸曲線、平均校準系數或響應系數曲線、加權最小二乘回歸曲線等。非線性校準曲線包括二階校準曲線、三階校準曲線等。

USEPA SW-846 8000D標準中色譜方法允許使用3種不同的校準曲線(平均校準系數或響應系數、線性回歸和非線性回歸校準曲線)。校準曲線的選擇可以從最簡單的方法開始,即先選用平均校準因子或響應因子曲線,達不到標準后,選擇線性曲線,最后選擇非線性曲線,直到滿足校準驗收標準為止。也可以根據以往的經驗、檢測器的物理特性或儀器制造商的建議,選擇合適的校準曲線。

USEPA SW-846 6010C(電感耦合等離子體原子發射光譜法)和6020A(電感耦合等離子體質譜法)中就指出,許多堿金屬和堿土金屬由于電離和自吸收效應而具有非線性響應曲線。

《化學分析方法驗證確認和內部質量控制實施指南 色譜分析》(GB/T 35655—2017)規定,實驗室應按照《基于標準樣品的線性校準標準》(GB/T 22554—2010)提供的方法實施校準曲線線性性能評價,通過校準曲線線性性能評價,確認校準曲線的剩余標準偏差是滿足常數剩余標準偏差的假設,還是滿足比例剩余標準偏差的假設,并得出合理的擬合校準曲線[13]。

《環境監測分析方法標準制訂技術導則》(HJ 168—2020)規定,定量方法線性回歸方程的相關系數不低于0.999;若使用平均相對響應因子進行計算,一般要求相對響應因子的相對標準偏差不超過20%。

4.1 線性回歸校準曲線及檢驗

4.1.1 采用曼德爾擬合優度檢驗

在ISO 8466-1:2021中,方差齊性一直是線性檢驗的關鍵要求。因此,在許多情況下,工作范圍被限制在一個數量級以內。曼德爾擬合優度檢驗是用校準曲線數據分別繪制線性校準曲線和二次校準曲線,檢驗線性校準曲線與二次校準曲線相比較是否具有足夠的擬合優度,是否適合于一個數量級以上的工作范圍和幾乎等距的校準濃度分布。

通過計算一次校準曲線(y=a+bx)和二次校準曲線(y=a+bx+cx2)的殘差標準差,計算一次校準曲線和二次校準曲線平方差總偏差。一次校準曲線殘差標準差(Sy1)參考公式(1),二次校準曲線殘差標準差(Sy2)參考公式(2),計算平方差總偏差(DS2)參考公式(3)。

(1)

(2)

DS2=(N-2)·Sy1-(N-3)·Sy2

(3)

通過計算用于F檢驗的Fcalc值,進行校準曲線的線性判斷。

(4)

查詢ISO 8466-2:2001中F值表,其中顯著性水平α=0.01、f1=1、f2=N-3。如果Fcalc

當曼德爾的擬合優度檢驗產生“非線性”結果,則可以剔除1個校準點,并再次進行殘差F檢驗。重復這個過程,直到根據曼德爾擬合優度檢驗后,校準曲線呈線性,確定一個更窄的線性范圍。

4.1.2 點對點的斜率檢驗

對于濃度在幾個數量級的對數尺度上的校準,曼德爾的擬合優度檢驗會導致“非線性”結果,根據ISO 8466-1:2021的規定,可通過計算點對點的斜率來估計線性范圍。

計算每相鄰2個校準點的斜率bi,然后求出bi的中位值bm。當bi的數量為偶數時,bm為中間2個bi值的算術均值。計算Δbi-m=bi-bm。如果結果在一定的工作濃度范圍內,Δbi-m在零線附近呈正態分布,則認為在這個工作濃度范圍內校準曲線呈線性。為方便判斷,在零線的上下設定Δbi-m限制線,一般上下限值設定為中位值的10%,Δbi-m在上下限之間的濃度范圍,即校準曲線的線性范圍。上下限值可以根據分析的精度要求進行調整。

4.1.3 1/x加權回歸校準曲線及檢驗

USEPA SW-846 8000D指出,未加權的回歸曲線校準曲線高濃度點的擬合效果比低濃度點好,如果關注的濃度是在較低的濃度水平,那么非加權回歸曲線往往會給出不太準確的結果。如果加權,加權系數一般為1/x或1/x2。

ISO 8466-1:2021對于校準范圍較寬的非等距校準,在低濃度范圍校準點聚集,采用1/x加權回歸與簡單的線性回歸相比,因為加權回歸使評定標準不確定度的方法偏差組成部分減少,所以能帶來更小的測量不確定度。

《基于標準樣品的線性校準標準》(GB/T 22554—2010)采用的是ISO 11096:1996標準,其特點是采用比例剩余標準偏差校準曲線,曲線中用倒數關系把大的殘差變小,把小的殘差變大,進行加權修正。這種加權修正法最直觀的作用,就是減小校準曲線2段高低含量測量值的方差。這種方法在常量分析中的好處不明顯,但是在微量、半微量分析(如色譜分析)中就比較有優勢。但《基于標準樣品的線性校準標準》(GB/T 22554—2010)要求至少分析3個濃度級別樣品,每個樣品至少測量2次,數據量、計算量大,操作復雜,某些步驟需要人工手動判定,一般實驗人員難以理解和操作,難以推廣。

4.1.4 使用平均校準因子或響應因子進行線性檢驗

USEPA SW-846 8000D標準中外標法校準因子(CF)為目標物的響應與目標物質量(濃度)的比值,內標法響應因子(RF)為目標物響應值乘以內標物濃度與內標物響應值乘以目標物濃度的比值。計算標準差(SD)和標準偏差(RSD),如果RSD≤20%,則認為曲線呈線性。這個RSD方法等價于一條強制通過原點的1/x2加權的最小二乘法線性回歸曲線。

CAC/GL 90—2017認為決定系數(r2)可能會產生誤導,因為它對濃度較高的標準品具有更大的意義。在這種情況下,應考慮使用適當的加權因子(如1/x或1/x2),以最大程度地降低低濃度范圍的潛在影響。

《環境監測分析方法標準制訂技術導則》(HJ 168—2020)中規定,若使用平均相對響應因子進行計算,一般要求相對響應因子的相對標準偏差不超過20%。

4.1.5 使用相關系數、決定系數進行線性檢驗

相關系數(r)是反映變量之間相關關系密切程度的統計指標,是按積差方法計算,同樣以兩變量與各自平均值的離差為基礎,通過2個離差相乘來反映兩變量之間的相關程度,著重研究線性的單相關系數。具體計算見公式(5)。

(5)

決定系數(r2)是評價校準曲線擬合優度的統計量,最大值為1。擬合優度是指校準曲線對測定值的擬合程度。這里的擬合可以是線性的,也可以是非線性的,即使線性的也不一定要用最小二乘法來擬合。其計算見公式(6)。

(6)

USEPA SW-846 8000D規定,在非加權線性最小二乘法的情況下,相關系數≥0.995或決定系數≥0.99。其中,SW-846 7000B(火焰原子吸收分光光度法)和7010(石墨爐原子吸收分光光度法)中要求相關系數≥0.995,6010C(電感耦合等離子體原子發射光譜法)和6020A(電感耦合等離子體質譜法)中要求相關系數≥0.998,6200(現場便攜式X射線熒光光譜法測定土壤和沉積物中的元素濃度)中要求相關系數≥0.98,《水和廢水的檢驗方法20版》(美國公共衛生協會)要求相關系數≥0.995。

《化學分析方法驗證確認和內部質量控制要求》(GB/T 32465—2015)中規定相關系數應不小于0.997,《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》(GB/T 27417—2017)規定篩選方法線性回歸方程的相關系數不低于0.98,準確定量方法線性回歸方程的相關系數不低于0.99?！董h境監測分析方法標準制訂技術導則》(HJ 168—2020)要求定量方法線性回歸方程的相關系數不低于0.999。

線性回歸校準曲線包括線性最小二乘法回歸曲線、平均校準系數或響應系數曲線等,可以根據方法原理和儀器設備狀況進行選擇。線性回歸校準曲線的檢驗方式主要包括曼德爾擬合優度檢驗、點對點的斜率檢驗、加權回歸校準曲線檢驗、平均相對響應因子和相關系數檢驗5種方式。生態環境監測分析方法常用的線性檢驗方式主要有平均相對響應因子和相關系數檢驗2種方法,其他檢驗方法應用較少。

4.2 非線性二階校準曲線及檢驗

ISO 8466-2:2001規定了非線性二階校準曲線方差齊性檢驗方法。確定線性范圍后,測定至少5個(推薦10個)濃度的標準溶液,標準溶液濃度應在線性范圍內均勻分布。重復測定各n次,計算最低點和最高點方差齊性值s1和s10,然后進行單側F檢驗,判斷曲線最高點和最低點的顯著性差別。

USEPA SW-846 8000D對非線性校準曲線的檢驗采用決定系數,要求非線性校準曲線的決定系數≥0.99。

非線性二階校準曲線的檢驗方式主要為方差齊性檢驗和決定系數檢驗,生態環境領域監測人員比較熟悉的是決定系數檢驗方式。

4.3 校準曲線的驗收標準

4.3.1 線性校準曲線的驗收標準

ISO 8466-1:2021、ISO 22104:2021、EPA SW-846 8000D和GB/T 32465—2015等國際和國內標準對線性校準曲線的驗收標準作出規定,生態環境監測分析方法《土壤和沉積物 揮發性有機物的測定 吹掃捕集/氣相色譜-質譜法》(HJ 605—2011)和《土壤和沉積物 揮發性有機物的測定 頂空/氣相色譜-質譜法》(HJ 642—2013)中線性校準曲線的驗收標準主要為將曲線最低點的響應值代入曲線計算,目標物的計算結果應為實際值的70%～130%。

4.3.2 非線性二階校準曲線的驗收標準

按照ISO 8466-2:2001建立最終工作范圍后,確定二階校準曲線為y=a+bx+cx2。測定10個濃度的標準溶液,10個濃度在工作范圍內等距分布。在工作范圍內,校準曲線不得存在有比第1個點小,比第10個點大的值。如果靈敏度(校準曲線的斜率,e)在任意點(x*)處變為零,則可以得出該校準曲線沒有明確意義,不可以使用該二階校準曲線進行校準和數據計算。

國內外標準中校準曲線的驗收標準如表2[3,6,9-11,14-16]所示。

表2 校準曲線的驗收標準Table 2 Acceptance criteria for linear functions

線性校準曲線的驗收標準不能僅考慮相關系數、相對響應因子均值和曲線中間點,還需要把曲線各點代入校準曲線重新計算,反算后與實際值誤差不能超過一定數值[17-18]。對于非線性二階校準曲線的驗收,應進行最大值與最小值檢驗。

5 校準曲線使用總結和建議

根據國內外標準的相關規定統計,校準曲線的第1個濃度點應在測定下限附近,原則上測定下限應小于相關標準最嚴限值的1/4,從技術上如果難以達到,測定下限至少要低于相關標準最嚴限值,測定上限應盡可能擴大。分析濃度最高點樣品后應進行試劑空白檢驗,試劑空白的值原則上應小于方法檢出限。

校準曲線的校準方式應根據方法原理、儀器的特點和樣品基質情況進行選擇?？梢赃x擇外標法、內標法、全程序外標法、全程序內標法和標準添加法。

對于線性校準曲線的線性檢驗,除了相關系數,還要根據不同情況,對校準曲線進行曼德爾擬合優度檢驗、點對點的斜率檢驗、平均校準因子(CF)或響應因子(RF)檢驗等;對于非線性二階校準曲線,可以采用決定系數或方差齊性進行檢驗。

校準曲線的驗收標準,除了考慮相關系數外,簡單起見,推薦采用USEPA SW-846 8000D方法,即用校準曲線重新計算校準點,校準曲線各點經校準曲線反算后,擬合值與實際值誤差不能超過30%;特殊情況下,最低濃度校準點計算結果擬合值與實際值的相對誤差可以允許在50%以內。對于非線性二階校準曲線,應進行最大值與最小值檢驗,作為校準曲線能否使用的標準。