甲狀腺結節良惡性的分子分型研究

李浩榕， 韓如來， 郁丹燕， 葉 蕾

（上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院內分泌代謝科 上海市內分泌代謝病研究所國家代謝性疾病臨床醫學研究中心（上海） 國家衛健委內分泌代謝病重點實驗室上海市內分泌腫瘤重點實驗室，上海 200025）

甲狀腺結節（thyroid nodules）是指甲狀腺內可觸及的或在超聲檢查中與周邊甲狀腺組織回聲不同的病灶。 絕大多數甲狀腺結節為良性，僅有少數最終診斷為惡性結節， 即甲狀腺癌 （thyroid cancer）。 甲狀腺癌按分化水平分為分化型甲狀腺癌、低分化癌和未分化癌。分化型甲狀腺癌整體預后較好， 甲狀腺乳頭狀癌 （papillary thyroid carcinoma，PTC）是其最常見的類型，也是最常見的甲狀腺癌病理類型，占全部甲狀腺癌的85%～90%[1]。 而低分化癌和未分化癌患者預后差。絕大部分穿刺細胞學良性的甲狀腺結節不會惡變[2]。因此，甲狀腺結節的良惡性鑒別和甲狀腺癌的風險分層非常重要。

分子分型可協助甲狀腺結節良惡性鑒別和甲狀腺癌的風險分層。甲狀腺癌的驅動基因主要涉及絲裂原激活的蛋白激酶 （mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路和磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）-AKT 通路， 腫瘤進展與端粒酶逆轉錄酶 （telomerase reverse transcriptase,TERT）、TP53、PIK3CA和AKT1等基因的突變累積相關[3-5]。 2022 年，世界衛生組織（World Health Organization，WHO）更新了甲狀腺腫瘤分類，對濾泡起源的惡性腫瘤根據分子特征和侵襲性進行了分類，分為BRAF類（BRAF-like）和RAS類（RASlike）[1]。BRAF類為經典乳頭狀形態，MAPK 信號通路高水平激活；RAS類多為濾泡性包裹性生長模式，MAPK 信號通路低水平激活。 目前許多RAS類的PTC 被重新分類于惡性伴有乳頭狀核特征的非浸潤性濾泡腫瘤和惡性潛能未定的高分化腫瘤。甲狀腺良性結節特有Zeste 同源物增強子1（enhancer of Zeste homolog 1，EZH1）、 斑點型BTB/POZ 蛋白（speckle type BTB/POZ protein,SPOP）、 鋅指蛋白148（zinc finger protein 148，ZNF148）基因突變，占比20%左右， 與甲狀腺癌基因組突變類型不同，兩者遺傳進化路徑迥異，具有獨立起源[6]。 另外，促甲狀腺激素 （thyroid stimulating hormone，TSH） 受體（TSH receptor，TSHR）和GNAS變異可引起甲狀腺高功能腺瘤； 甲狀腺激素合成通路胚系基因突變，可導致結節性甲狀腺腫形成[7-8]。

二代靶向測序技術可對目標基因區域進行靶向高通量測序， 可實現測序范圍的個性化定制，并且極大節約測序成本。上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院（瑞金醫院）內分泌團隊自建甲結Panel, 可完成112 個基因的靶向檢測，包括甲狀腺良性結節相關基因、甲狀腺癌相關基因、甲狀腺發育和功能相關基因、 細胞來源鑒定基因和內參基因5 類基因。 可檢測目的基因的堿基替換、插入缺失、拷貝數變異和融合突變以及基因表達水平。

本研究擬對甲狀腺結節進行分子分型，開展甲狀腺良惡性結節的分子分型研究。

材料與方法

一、樣本采集

納入2009 年至2022 年在瑞金醫院接受甲狀腺手術和2020 年至2022 年期間接受甲狀腺細針穿刺（fine needle aspiration, FNA）的患者，排除血清TSH 異?；颊?。 于入組患者術后組織中直徑＞0.5 cm 的實性部分取材，并將樣本于液氮中速凍保存； 入組患者的甲狀腺結節FNA 樣本則于獲得樣本后2 h 內進行核酸抽提；對罕見甲狀腺腫瘤亞型如甲狀腺髓樣癌等補充了福爾馬林固定石蠟包埋（Formalin-fixed paraffin-embedding，FFPE）樣本。 術后組織病理學診斷根據第5 版WHO 甲狀腺腫瘤分類[1]完成。 腫瘤分期根據美國癌癥聯合委員會（American Journal of Critical Care, AJCC） 第七版TNM 分類系統進行。 本研究獲得瑞金醫院倫理委員會批準，所有入組患者均知情同意。

二、核酸抽提

使用AllPrep DNA/RNA micro kit （QIAGEN）試劑盒對液氮凍存組織和FNA 樣本進行DNA 和RNA 提取，使用GeneReadTMDNA FFPE kit（QIAGEN）和QIAGEN RNeasy?FFPE kit 分別對FFPE 樣本進行DNA 和RNA 提取。 使用NanoDropTM2000 和QubitTM4.0（InvitrogenTM）評估核酸質量和濃度。

三、靶向測序和生信分析

甲結Panel 使用Integrated DNA Technologies（IDT） 公司的xGenTM定制雜交捕獲探針組對目標基因區域實現靶向富集， 使用Illumina NextSeq CN500 高通量測序儀對甲結Panel 靶向富集的文庫進行測序。

由Illumina bcl2fastq 軟件生成FastQ 文件；使用GATK 和HISAT2 軟件完成gDNA 和cDNA 序列與參考基因組的比對；Mutect2 和VarDict 軟件用于變異讀??；Arriba 和STAR-Fusion 軟件用于檢測融合變異；CNVkit 軟件用于分析拷貝數變異；基因表達使用TMM 標準化方法。

四、變異解讀

變異解讀參照美國醫學遺傳學和基因組學學會 （American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG）2017 年體細胞變異解讀指南進行。按ACMG 體細胞變異解讀指南， 體細胞變異分類中僅Ⅰ～Ⅱ類變異（強臨床意義和潛在臨床意義）納入研究分析。

結果

一、甲狀腺結節分子分型

本研究總計完成856 例甲狀腺結節樣本的分子分型，入組患者平均年齡為（43.09±13.70）歲，女性占比75.0%（n=642）。 其中有678 例液氮速凍組織、133 例FNA 樣本和45 例FFPE 樣本。79.0%（n=676）甲狀腺結節檢出至少1 個突變。 最常見的突變檢出基因為BRAF（n=426）；其次是RET（n=68），包括38 例RET融合基因和30 例RET基因的點突變或插入缺失變異；還有TERT（n=35）、HRAS（n=24）、NRAS（n=23）、神經營養酪氨酸受體激酶(neurotrophin receptor kinase,NTRK3） 融合基因 （n=19）、DICER1（n=19）、真核翻譯起始因子1A, X 染色體 （eukaryotic translation initiation factor 1A，Xchromosomal，EIF1AX）（n=11）、BRAF融合（n=10）、SPOP（n=10）、KRAS（n=8）、細胞周期檢測點激酶2（checkpoint kinase 2,CHEK2）（n=7）、 胰島素樣生長因子2 mRNA 結合蛋白3（insulinlike growth factor 2 mRNA binding protein 3,IGF2BP3） 融合基因（n=7）、EZH1（n=6）、TP53（n=36）、TSHR（n=5）、ALK融合基因（n=4）、ATM（n=4）、NTRK1（n=3）、PIK3CA（n=3）等。

FNA 樣本中有106 例存在TG基因表達，可判斷為甲狀腺濾泡細胞來源甲狀腺結節， 其中44 例（41.5%）檢出變異，變異基因分別為BRAF、NRAS、KRAS、HRAS、BRAF融合基因、RET融合基因、DICER1、EIF1AX、NTRK3融合基因、SPOP、TSHR等。

二、甲狀腺結節分子分型與病理類型

627 例甲狀腺結節病理類型結果明確。其中惡性結節中經典型乳頭狀癌最為常見，有285 例（45.5%）；其次是乳頭狀微癌96 例 （15.3%）； 髓樣癌91 例（14.5%）；濾泡亞型乳頭狀癌32 例（5.1%）；高柱細胞亞型乳頭狀癌13 例 （2.1%）， 彌漫硬化亞型9 例（1.4%），濾泡癌4 例，占比0.6%。97 例（15.5%）病理診斷為良性；惡性潛能未定的濾泡性腫瘤1 例（0.2%）。

經典型乳頭狀癌與乳頭狀微癌以BRAF基因變異為主， 占比80.1%（305 例）， 融合基因占比12.9%（56/435），其中75.0%（42 例）為RET融合和NTRK融合基因。髓樣癌以RET基因變異為主，占比72.5%（66 例）， 其次是HRAS和KRAS， 占比19.8%（18 例）， 另外， 在髓樣癌中檢出1 例BRAFT599dup 和2 例BRAFN486_P490del。 濾泡亞型乳頭狀癌最常見變異基因為BRAF，占比43.8%（14 例），遠低于BRAF基因變異在經典型乳頭狀癌與乳頭狀微癌的檢出。而在9 例彌漫硬化亞型中檢出5 例BRAF變異，3 例RET融合變異。

三、突變惡性百分比

對其中503 例濾泡細胞來源的甲狀腺結節的分子分型結果和病理結果進行分析，變異惡性百分比如表1，總數小于3 例的分子分型不作統計。 發現BRAF類變異（BRAFV600E、RET融合）整體惡性百分比為97.3%；RAS類（NRAS、HRAS、KRAS、DICER1、EIF1AX、IGF2BP3融合） 變異整體惡性百分比為18.9%；良性結節相關基因整體惡性百分比為0。

表1 甲結Panel 檢出突變的惡性百分比[n（%）]

討論

本研究對856 例甲狀腺結節完成了分子分型。PTC 是最常見的甲狀腺腫瘤病理類型，BRAFV600E 是最常見的基因變異。甲狀腺髓樣癌以RET基因變異和RAS基因變異為主。 在甲狀腺髓樣癌中還檢出1 例BRAFT599dup 和2 例BRAFN486_P490del 突變。 2023 年有研究首次報道了BRAF是甲狀腺髓樣癌驅動基因[9]。 良性甲狀腺結節59.8%檢出變異， 相關基因包括SPOP、EZH1、TSHR。 因此，甲狀腺良性、惡性結節具有特異的分子分型，并可被檢出。

甲狀腺結節的良惡性鑒別是甲狀腺結節診療的關鍵。本研究發現BRAF類變異整體惡性百分比為97.3%，而RAS類變異整體惡性百分比為18.9%?？梢奟AS類變異在作為標志物進行良惡性鑒別時需慎重。 在鑒別甲狀腺結節良惡性時，RAS變異如何作為分子標志物應用仍然存在爭議。有研究認為檢出RAS突變的甲狀腺結節提示低風險甲狀腺癌，建議手術[10]；RAS突變合并TERT 啟動子突變或EIF1AX基因突變時，則與高惡性度的甲狀腺癌有關[11]，而FNA 細胞學不確定的樣本中最常見的分子改變也是RAS突變[12]。 因此，RAS類甲狀腺結節的良惡性鑒別是甲狀腺結節分子診斷的重點和難點，未來可能需要聯合轉錄或表觀遺傳特征進行判定。

基因融合變異在甲狀腺癌的發生和發展中起著重要作用， 已有涉及RET、NTRK融合基因靶向治療藥物獲得泛癌或多癌批準[13-15]。 美國癌癥基因組圖譜（the Cancer Genome Atlas，TCGA）研究發現15.3%的PTC 存在融合基因變異[16]。 本研究完成mRNA 檢測的435 例PTC 中，12.9%的PTC 檢出融合基因變異，其中75.0%為RET、NTRK融合基因，可指導晚期進展甲狀腺癌患者的靶向治療藥物選擇。

對甲狀腺結節進行分子分型，能輔助甲狀腺結節的良惡性鑒別，并指導晚期甲狀腺癌患者靶向治療藥物的確定[17]。 甲結Panel 可有效進行甲狀腺結節的分子分型。