miR-93-5p對胰島素抵抗細胞模型中HGF、GLUT4表達及GLUT4分布的影響*

周 曼, 吳 軍, 干定云, 陳 婉, 曹 萍, 李廣利, 侯以琳

武漢市第三醫院(武漢大學附屬同仁醫院)內分泌科,武漢 430060

隨著經濟發展和人們生活方式的改變,糖尿病的發病率逐年升高,已成為威脅人類健康的主要疾病[1]。2型糖尿病是糖尿病中最常見的一種,以高血糖和胰島素抵抗為特征[2]。目前,治療2型糖尿病的藥物多以降血糖為主,針對胰島素抵抗的治療方法較少[3]。由此可見,研究胰島素抵抗的發生機制對2型糖尿病的預防和治療具有重要意義。肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)是一種具有廣泛生物學效應的多肽生長因子[4]。本課題組前期研究發現,HGF在胰島素抵抗2型糖尿病患者肝組織中顯著下調,提示HGF可能與胰島素抵抗密切相關[5],但其在胰島素抵抗進展中的作用機制尚不清楚。

外泌體可將大量調控分子如蛋白質、脂質和RNAs等傳遞到靶細胞,從而調控靶細胞的生物學功能[6]。最近的研究表明,外泌體可通過跨細胞傳遞參與胰島素抵抗[7]。本課題組前期收集了胰島素抵抗2型糖尿病患者的外泌體,通過高通量測序發現miR-93-5p在胰島素抵抗指數高的患者樣本中高表達,且miR-93-5p可能靶向HGF[5],基于此我們推測外泌體來源的miR-93-5p可通過調節HGF參與胰島素抵抗。本研究構建胰島素抵抗肝細胞模型,明確miR-93-5p對肝細胞HGF表達的影響,為2型糖尿病的臨床治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

人肝癌細胞HepG2來源于中國科學院上海細胞庫。MEM培養液、胎牛血清購于美國Gibco公司,PBS、0.25%胰蛋白酶、CCK-8、抗熒光衰減封片劑(含DAPI)、Triton X-100、5%BSA封閉液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA(強)組織細胞快速裂解液購于中國Solarbio公司,葡萄糖購于阿拉丁公司,Trizol購于Ambion公司,SYBR FAST qPCR Master Mix購于KAPA Biosystems公司,逆轉錄試劑盒購于TaKaRa公司,氯仿、異丙醇、無水乙醇、甲醛購于國藥集團化學試劑有限公司,葡萄糖檢測試劑盒購于南京建成公司,PVDF轉移膜購于Millipore公司,免疫熒光GLUT4抗體購于Invitrogen公司,Western blot一抗HGF、葡萄糖轉運蛋白4(glucose transporter 4,GLUT4)、GAPDH、熒光基團594標記的山羊抗兔二抗、HRP標記的山羊抗兔IgG購于武漢Bioswamp公司。

1.2 細胞培養

HepG2細胞復蘇后,接種在含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養液中,置于37℃、5% CO2培養箱中培養。隔天換液,細胞融合率達到90%時胰酶消化,傳代,取對數生長期細胞進行實驗。

1.3 胰島素抵抗模型的構建

收集細胞,調整細胞懸液濃度,接種于6孔板中,每孔5×105個細胞,置于37℃、5% CO2培養箱中培養24 h。細胞培養達到70%～80%匯合后,PBS洗滌2次,分別用含生理濃度葡萄糖(5.5 mmol/L)或高糖(30 mmol/L)培養液孵育48 h,建立高糖誘導的胰島素抵抗細胞模型[5]。模型構建完成后取出細胞培養板,每孔加入10 μL CCK-8溶液,培養4 h后檢測450 nm處的吸光度值,以此表示細胞增殖能力,鑒定模型構建是否成功。結果顯示模型構建成功。

1.4 qPCR檢測HepG2細胞中miR-93-5p、HGF、GLUT4 mRNA的表達

收集對照組和模型組細胞,PBS洗滌3次。Trizol法提取細胞總RNA,按照逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA,進行PCR擴增。PCR引物由武漢天一華煜基因科技有限公司合成,引物序列見表1。分別以U6和GAPDH為內參,2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

表1 引物信息

1.5 miR-93-5p mimics、inhibitor構建及實驗分組

構建并合成miR-93-5p mimics、inhibitor相應對照(NC),轉染至HepG2細胞中,qPCR驗證轉染效率。將細胞分為對照組、模型組、miR-93-5p inhibitor組、inhibitor-NC組、miR-93-5p mimics組和mimics-NC組。對照組不作處理,正常培養;模型組細胞用高糖培養液培養,構建胰島素抵抗模型;其余組分別依次轉染miR-93-5p inhibitor、inhibitor-NC、miR-93-5p mimics、mimics-NC,轉染完成后再用高糖培養液培養構建胰島素抵抗模型。處理完成后繼續培養48 h,加入CCK-8溶液,檢測細胞存活率。

1.6 細胞葡萄糖消耗量檢測

設置測定孔、空白孔和標準孔,分別加入3 μL樣本、雙蒸水和標準液,每孔加入300 μL工作液,混勻,37℃孵育15 min,酶標儀檢測505 nm處的吸光度(A)值。葡萄糖含量(mmol/L)=(各組A值/標準液A值)×標準液濃度。葡萄糖消耗量(mmol/L)=原葡萄糖含量-實驗組葡萄糖含量。

1.7 qPCR和Western blot檢測miR-93-5p、HGF、GLUT4的表達

提取細胞總RNA,qPCR檢測HepG2細胞中miR-93-5p、HGF、GLUT4 mRNA的表達。提取細胞總蛋白,BCA法進行蛋白質定量,上樣電泳,轉膜,封閉過夜,加入一抗稀釋液孵育,洗膜,加入二抗稀釋液孵育,洗膜后ECL顯色。讀取條帶灰度值,目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值即為蛋白的相對表達量。

1.8 免疫熒光檢測GLUT4的表達和分布

分組處理后的細胞以4%多聚甲醛室溫固定30 min,PBS洗滌,加入0.5% Triton X-100室溫通透30 min,PBS洗滌后用5%BSA封閉1 h,加入一抗稀釋液孵育過夜,PBS洗滌后加入二抗稀釋液孵育1 h,最后加入300 μL抗熒光淬滅封片液(含DAPI),熒光顯微鏡觀察拍照。

1.9 統計學方法

用GraphPad Prism 8.0進行統計學分析,結果用平均值±標準差表示,多組間均數比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 高糖誘導的HepG2細胞中miR-93-5p、HGF、GLUT4 mRNA的表達

qPCR檢測結果顯示,與對照組相比,模型組細胞中miR-93-5p水平顯著升高(P<0.01),而HGF、GLUT4 mRNA水平顯著降低(均P<0.01)。見圖1。

**P<0.01

2.2 miR-93-5p對高糖誘導的HepG2細胞活力和葡萄糖消耗的影響

CCK-8和生化實驗結果顯示,與對照組相比,模型組細胞存活率和葡萄糖消耗量均顯著降低(均P<0.01);與inhibitor-NC組相比,miR-93-5p inhibitor組細胞存活率和葡萄糖消耗量均顯著升高(均P<0.01);與mimics-NC組相比,miR-93-5p mimics組細胞存活率和葡萄糖消耗量均顯著降低(均P<0.01)。見圖2。

1:對照組;2:模型組;3:miR-93-5p inhibitor組;4:inhibitor-NC組;5:miR-93-5p mimics組;6:mimics-NC組;**P<0.01

2.3 miR-93-5p對高糖誘導的HepG2細胞中HGF和GLUT4 mRNA表達的影響

qPCR結果顯示,與對照組相比,模型組細胞中miR-93-5p表達水平顯著升高(P<0.01),HGF和GLUT4 mRNA表達水平顯著降低(均P<0.01);與inhibitor-NC組相比,miR-93-5p inhibitor組細胞中miR-93-5p水平顯著降低(P<0.01),HGF和GLUT4 mRNA表達水平顯著升高(均P<0.01);與mimics-NC組相比,miR-93-5p mimics組細胞中miR-93-5p水平顯著升高(P<0.01),HGF和GLUT4 mRNA表達水平顯著降低(均P<0.01)。見圖3。

1:對照組;2:模型組;3:miR-93-5p inhibitor組;4:inhibitor-NC組;5:miR-93-5p mimics組;6:mimics-NC組;**P<0.01

2.4 miR-93-5p對高糖誘導的HepG2細胞中HGF和GLUT4蛋白表達的影響

Western blot結果顯示,與對照組相比,模型組細胞中HGF和GLUT4蛋白表達水平顯著降低(均P<0.01);與inhibitor-NC組相比,miR-93-5p inhibitor組細胞中HGF和GLUT4蛋白表達水平顯著升高(均P<0.01);與mimics-NC組相比,miR-93-5p mimics組細胞中HGF和GLUT4蛋白表達水平顯著降低(均P<0.05)。見圖4。

1:對照組;2:模型組;3:miR-93-5p inhibitor組;4:inhibitor-NC組;5:miR-93-5p mimics組;6:mimics-NC組;A:Western blot檢測HGF和GLUT4蛋白表達條帶圖;B:HGF蛋白表達水平的比較;C:GLUT4蛋白表達水平的比較;*P<0.05,**P<0.01

2.5 miR-93-5p對高糖誘導的HepG2細胞GLUT4分布的影響

免疫熒光結果顯示,與對照組相比,模型組GLUT4膜分布明顯減少,熒光強度也明顯減弱;與inhibitor-NC組相比,miR-93-5p inhibitor組GLUT4膜分布明顯增多,熒光強度明顯增強;與mimics-NC組相比,miR-93-5p mimics組GLUT4膜分布減少,熒光強度減弱。見圖5。

1:對照組;2:模型組;3:miR-93-5p inhibitor組;4:inhibitor-NC組;5:miR-93-5p mimics組;6:mimics-NC組

3 討論

HepG2細胞表面含有大量胰島素受體,研究表明,高水平的胰島素能夠減少HepG2細胞表面的胰島素受體,且HepG2細胞易于體外實驗操作培養,因此本研究選擇HepG2細胞為研究對象構建胰島素抵抗細胞模型,研究外泌體miR-93-5p和HGF在胰島素抵抗中的作用[8-9]。胰島素抵抗主要表現為脂肪細胞、肌肉細胞和肝細胞對胰島素的敏感性降低、胰島素信號失調以及葡萄糖、脂肪和蛋白質代謝紊亂等[10]。外泌體中的miRNAs在包括細胞增殖、凋亡、炎癥和糖脂代謝等多種與胰島素抵抗密切相關的病理生理過程中發揮重要作用[11]。本研究結果顯示,miR-93-5p在胰島素抵抗細胞模型中的表達較正常細胞顯著上調,證明miR-93-5p與胰島素抵抗密切相關。

研究表明,HGF與胰島素抵抗密切相關。高水平的HGF能夠改善小鼠胰島β細胞的功能,改善肥胖小鼠體內的葡萄糖穩態[12-13]。本課題組前期研究發現敲低HGF能夠促進胰島素抵抗HepG2細胞模型的增殖,而過表達HGF能夠促進胰島素抵抗細胞模型的凋亡[5]。本研究顯示HGF mRNA在胰島素抵抗細胞模型中的表達顯著下調,表明HGF與胰島素抵抗密切相關。Starbase V2.0數據庫預測miR-93-5p可能靶向HGF,為了進一步明確外泌體miR-93-5p對HGF表達的影響,本研究結果顯示轉染miR-93-5p inhibitor后胰島素抵抗細胞模型中HGF表達顯著上調,而轉染miR-93-5p mimics后HGF的表達顯著下調。此外,轉染miR-93-5p inhibitor后胰島素抵抗細胞模型的細胞存活率和葡萄糖消耗量均顯著升高,而轉染miR-93-5p mimics后細胞存活率和葡萄糖消耗量均顯著降低,進一步說明miR-93-5p可通過靶向抑制胰島素抵抗細胞模型中HGF的表達來抑制葡萄糖的吸收,從而導致胰島素抵抗,引起血糖失衡。

GLUT4是細胞膜上負責轉運葡萄糖的一種載體蛋白,對維持機體葡萄糖的穩態具有重要作用[14-16]。本研究結果顯示,轉染miR-93-5p mimics后胰島素抵抗細胞模型中GLUT4的表達下調,而轉染miR-93-5p inhibitor后GLUT4的表達上調,提示miR-93-5p能夠抑制GLUT4的表達,進而抑制葡萄糖的轉運。研究表明,胰島素能夠使GLUT4從細胞內轉運到細胞膜上,發揮轉運葡萄糖的作用[17-18]。周暉等[19]發現GLUT4膜轉位增加能夠改善胰島素抵抗。為了明確miR-93-5p對GLUT4分布的影響,我們又利用免疫熒光檢測了GLUT4的表達和分布,結果顯示,轉染miR-93-5p inhibitor后胞質內GLUT4膜轉位增加,熒光強度增強,而轉染miR-93-5p mimics后GLUT4的膜分布減少,熒光強度也減弱,提示miR-93-5p能抑制GLUT4的表達,并減少GLUT4的膜分布,抑制葡萄糖的轉運,進而破壞機體葡萄糖的穩態。

綜上所述,miR-93-5p能夠抑制胰島素抵抗細胞模型中HGF和GLUT4的表達,并減少GLUT4的膜分布,從而抑制葡萄糖的轉運和吸收,導致胰島素抵抗。本研究的不足之處在于只對miR-93-5p與胰島素抵抗的相關性進行了初步探索,未來還需深入研究或探討miR-93-5p參與胰島素抵抗的具體分子機制。