牛源產腸毒素大腸桿菌的分離鑒定與致病性研究

張賀，潘靜，趙敏，王旭芬，趙潤濤，侯琳，張志丹，周偉光*

（1.赤峰海關綜合技術服務中心，內蒙古 赤峰 024000； 2.內蒙古農業大學獸醫學院，內蒙古 呼和浩特 010018）

大腸埃希菌（Escherichia coli，E.coli）主要存在于人和動物的腸道中，嗜熱、嗜酸，是犢牛發生細菌性腹瀉的主要病因之一[1]。其中產腸毒素大腸桿菌（enterotoxigenic E.coli，ETEC） 是引起1～7 日齡犢牛腹瀉最為常見的致病性大腸桿菌，可引起犢牛脫水及酸中毒死亡。ETEC 分布廣泛、侵襲力高，臨床上表現為高熱、食欲減退且糞便呈褐色，多為水樣、糊狀，部分犢牛消瘦死亡，給養殖場造成了重大經濟損失，同時也是牛急性腸毒血癥的病原之一[2-4]。近年來，由于我國畜牧業發展速度較快，以及牛養殖規模的不斷擴大，由ETEC 引起的犢牛腹瀉及敗血癥日益嚴重，發病率和死亡率不斷升高[5-6]。

大腸桿菌O 抗原血清型的鑒定是大腸桿菌分型最為主要的方法。O 抗原凝集反應的血清學檢測方法用時長，一些血清學交叉反應也會導致試驗結果不準確[7-9]。而PCR 鑒定方法和使用wzx/wzy 和wzm/wzt 基因組序列的BLAST 檢索方法可以精確對血清型進行鑒定。

本研究采集呼和浩特市周邊地區犢牛養殖場腹瀉犢牛肛拭子糞樣進行ETEC 分離鑒定及毒力分析，在其中篩選出2 株毒力菌株，為進一步進行疫苗制備及免疫原性研究提供參考。

1 試驗材料

1.1 主要試劑和儀器

細菌DNA 提取試劑盒購自全式金公司；500 bp DNA ladder、2 000 bp DNA ladder 和Premix Ex Taq購于TaKaRa 公司； 革蘭染色液試劑盒和瑞氏染色液購自青島海博生物。菌株編號CVCC209（血清型：O20:k101，產生ST 腸毒素）購于中國獸醫微生物菌種管理保藏中心；通用臺式離心機購自Thermo 公司；高速冷凍離心機和普通PCR 儀購自Eppendorf 公司； 定量PCR 儀購自Bio-Rad 公司；細菌恒溫培養箱購自上海?，攲嶒炘O備有限公司。

1.2 病料來源

呼和浩特市周邊地區腹瀉糞樣A 牧場14 份；B牧場8 份。

1.3 實驗動物

SPF 級4 周齡ICR 小鼠，雌雄各半，購自斯貝福北京生物技術有限公司。

2 試驗方法

2.1 病料處理及菌株純化

將腹瀉糞樣置于LB 液體培養基內，于37 ℃恒溫搖床200 r/min 增菌培養12 h，將培養后的增菌液劃線接種于MAC 培養基上，劃線后將培養基倒置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，用接種環挑取培養基上桃紅色單個菌落于LB 液體培養基進行增菌培養，并標記號碼，增菌后再次劃線接種于EMB 鑒別培養基上，培養24 h 后挑取具有黑色金屬光澤的單個菌落再次進行LB 液體培養基增菌培養，將增菌后菌液于-20 ℃甘油內保存[10]。

2.2 菌株分離鑒定

2.2.1 菌株PCR 鑒定。將2.1 分離鑒定后的菌株進行增菌培養，取增菌液進行DNA 提取，探針由實驗室提供[11]，合成引物序列見表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 ETEC 腸毒素和黏附素菌毛PCR 引物和探針

以上述DNA 為模板，對ETEC 腸毒素和黏附素菌毛進行雙重定量PCR 擴增。采用25 μL 反應體系：Premix Ex Taq 12.5 μL，引物LT-F 和LT-R 各0.6 μL，引物ST-F 和ST-R 各1.2 μL，探針LT-P 0.6 μL，探針ST-P 1.1 μL，模板2 μL，ddH2O 補加至25 μL。反應條件為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸45 s，循環45 次觀察結果。

2.2.2 菌株革蘭染色鏡檢。用接種環蘸取1 滴生理鹽水于載玻片中央，再用接種環蘸取固體培養基上的單個菌落與載玻片上的生理鹽水混合，由內及外均勻涂開，進行火焰固定；使用革蘭染液試劑盒進行染色，順序為：A 液1 min、沖洗、B 液1 min、沖洗、C 液30 s、沖洗、D 液1 min，沖洗后用吸水紙吸取多余水分，晾干后進行鏡檢。

2.3 菌株致病力測定

2.3.1 菌株篩選。將ETEC 菌株于LB 液體培養基中增菌培養，置于37 ℃恒溫搖床，200 r/min 培養12 h，取菌液3 mL 置于比色杯中測量其OD 值 （分光光度計讀數為0.08～0.13，大腸桿菌濃度為1.5×108CFU/mL），調整待測菌濃度為1×109CFU/mL，選取4 周齡ICR小鼠（體重16～22 g）作為試驗用鼠，根據菌株的數量設置組數，每組選取4 只小鼠作為研究對象，每只小鼠腹腔注射0.2 mL 菌液，同時分別設置滅菌PBS、生理鹽水對照組。小鼠攻毒后72 h 內觀察精神狀態和死亡情況，分別記錄每組小鼠的臨床癥狀及死亡情況，挑選出毒力較強的菌株進行下一步試驗。

2.3.2 LD50和LD100測定。結合致病力篩選試驗結果，選取2 株較強毒株再次進行增菌培養，置于37 ℃恒溫搖床培養12 h 至對數期，測定其吸光值。根據小鼠死亡情況，梯度調整其菌液濃度至預先測定的LD50和LD100濃度，選取4 周齡ICR 小鼠，每組選取4 只小鼠，每只小鼠腹腔注射0.2 mL 菌液，同時設置對照組，記錄每組小鼠的死亡情況，再對濃度梯度進行重復驗證。

2.3.3 小鼠臨床癥狀及病理變化觀察。攻毒后觀察72 h 內小鼠的精神狀況以及死亡情況，對死亡的小鼠進行剖檢，觀察病變部位并對病變部位進行觸片染色鏡檢。

2.3.4 血清型鑒定。參考AtsushiIguchi 大腸桿菌O抗原PCR 血清實用分型，合成牛大腸桿菌常見的血清型引物[12]，引物序列見表2，篩選出的菌株DNA 作為模板進行PCR 擴增，同時使用實驗室購買的參考菌株作為陽性對照，鑒定其是否為陽性血清型。采用25 μL 反應體系：Premix Taq 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板2 μL，ddH2O 補加至25 μL。反應條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，循環30 次；72 ℃終延伸5 min，4 ℃保存。PCR 產物經2%瓊脂糖凝膠電泳后通過紫外照射觀察結果。

3 結果與分析

3.1 菌株PCR 檢測

將22 份腹瀉糞樣分離菌株純化后得到的大腸桿菌菌株進行定量PCR 檢測。結果表明，22 份樣品中14 份樣品ETEC 呈陽性（圖1）。

3.2 革蘭染色菌體形態觀察

革蘭染色后，鏡檢可見兩端鈍圓的革蘭陰性短桿菌（圖2）。

圖2 ETEC 菌株革蘭染色鏡檢圖

3.3 菌株致病力測定

3.3.1 分離株致病力篩選結果。通過PCR 特異性鑒定，篩選出3 株ETEC 菌株D2、D7 和D8，與實驗室分離的1 株ETEC 菌株8-1 進行致病性試驗。結果如表3 所示，根據4 株分離菌株小鼠致病力初篩結果，選取2 株具有致病力毒株8-1、D2 作為后續試驗候選菌株進行下一步致病力試驗。

表3 分離菌株致病力篩選結果

3.3.2 疫苗候選株LD50和LD100測定。對2 株菌的LD50和LD100進行測定，根據致病力初篩小鼠死亡情況，調整這2 株菌的濃度至預設的LD50和LD100梯度濃度。8-1 菌株LD50和LD100第1 次驗證如結果表4所示；D2 菌株LD50和LD100第1 次驗證結果如表5 所示。得出結果后進行重復驗證，8-1 菌株重復試驗結果如表6 所示，D2 重復試驗結果如表7 所示。

表4 8-1 菌株LD50、LD100 測定

表5 D2 菌株LD50、LD100 測定

表6 重復驗證8-1 菌株LD50、LD100

表7 重復驗證D2 菌株LD50、LD100

根據分離株致病力初篩結果以及2 株菌LD50和LD100小鼠攻毒及重復驗證試驗結果，最終可知8-1 菌株LD50為5×108CFU/mL，LD100為9×108CFU/mL；D2菌株LD50為1.2×109CFU/mL，LD100為2×109CFU/mL。

3.3.3 血清型鑒定。對篩選出的8-1、D2 2 株菌使用參考文獻[12]中牛源常見的68 對大腸桿菌O 抗特異性鑒定引物對進行PCR 擴增鑒定，最終得出8-1 菌株血清型為O118，D2 菌株血清型為O2，見圖3。

圖3 2 株疫苗候選菌株血清型基因擴增條帶

4 討論

產腸毒素大腸桿菌作為引發犢牛腹瀉的主要致病菌，其致病性較強，分布范圍廣泛，侵襲力強，是危害犢牛養殖業的主要病因，常伴隨脫水、敗血癥及消化不良等癥狀。新生犢牛在1 月齡內易感，隨著年齡的增長，發病率也逐漸下降。

宋美英[13]收集并分離獲得致病性牛源大腸桿菌84 株，對其進行16 種毒力基因的PCR 檢測。結果顯示，攜帶毒力基因的致病性大腸桿菌有60 株，多種毒力基因組合以F41 和K99 為主，并結合耐藥性進行分析，為研制以毒力基因為抗原的新型疫苗、選擇敏感藥物提供了一定依據。張洋龍[14]將分離出的53 株牛源ETEC 菌株進行耐藥基因檢測，通過致病性試驗和毒力基因檢測試驗，成功構建牛源產腸毒素大腸桿菌強毒株的抑制消減基因組DNA 文庫，并對差異基因進行了分布及分析研究。張力國[15]在黑龍江不同地區糞樣中分離出88 株大腸桿菌，并進行毒素基因和黏附素基因檢測。結果顯示，黏附素類型以K88 和F18為主，大腸桿菌類型以ETEC 和EPEC 為主。

本試驗從呼和浩特市周邊的牧場犢牛腹瀉糞樣成功分離出ETEC 菌株，經分離純化、小鼠毒力篩選后得到1 株疫苗備選菌株，并與實驗室8-1 陽性菌株進行致病性試驗，得到8-1 菌株LD50為5×108CFU/mL，LD100為9×108CFU/mL；D2 菌株LD50為1.2×109CFU/mL，LD100為2×109CFU/mL。2 株菌毒力較強，在小鼠攻菌后，以小鼠死亡情況作為判斷標準的同時進行臨床觀察，在選擇梯度攻菌濃度時也進行了重復驗證，反映出2 株菌在小鼠上實際的致病作用。小鼠攻毒的最佳注射位置為腹腔。致病性試驗感染模型的建立參考文獻[16-19]的操作方法。在對大腸桿菌菌落數進行測定時，分光光度計讀數為0.08～0.13，大腸桿菌濃度為1.5×108CFU/mL。為減小試驗誤差，本試驗分光光度計讀數均為0.1 左右，這也增加了試驗的準確性。

血清型鑒定試驗參考了大腸桿菌O 抗原基因wzx/wzy 或wzm/wzt 中的片段進行PCR 擴增，鑒定分離菌株的血清型。相對于玻片凝集鑒定，PCR 擴增鑒定更加準確，避免了與其他O-抗原發生交叉反應[20]。參考文獻[12，20-21]篩選出68 對報道在犢牛和奶牛體內產生的大腸桿菌血清型特異性引物，分別對2 株菌進行PCR 鑒定，得出8-1 菌株血清型是O118，D2 菌株血清型是O2。

對本試驗分離鑒定的ETEC 菌株進一步進行致病性試驗，顯示其對小鼠有致病性，適合作為菌株進行后續疫苗免疫相關試驗。