裂解多糖單加氧酶Af LPMO7的酶學特性研究

馬 磊，婁淑慧，尹玉瑩，安姝宇，朱超強，韓 藝，高建民

（河南城建學院生命科學與工程學院，河南 平頂山 467036）

我國是農業大國，每年均會產生大量纖維素類農業廢棄物，若能將其有效利用，不僅能夠減輕生態環境的壓力，還能夠避免大量的資源浪費。纖維素是一種高分子有機聚合物，由大量單糖組成。為了有效利用纖維素，需要將其水解成為寡糖或單糖。目前，常使用糖苷水解酶催化降解纖維素［1］，但由于糖苷水解酶對纖維素結晶區的利用效率較低，需通過物理或化學方法對纖維素進行預處理［2］，以便提高糖苷水解酶對纖維素的降解效率。近年來，學者發現了裂解多糖單加氧酶（LPMO），將其歸類于輔酶家族［3］（AA家族），其能有效降低多糖底物的結晶度，且能有效提高糖苷水解酶的水解效率。關于AA家族，目前研究最多的是AA9家族［4］，其主要作用于纖維素底物。進一步研究AA9家族，將對高效水解纖維素提供一定的技術支持。

木質纖維素是重要的可再生資源，酶解法是將其降解利用的重要途徑。對AfLPMO7蛋白的深入研究，提高其降解效率，闡明其在生物質降解中的作用，更好地促進農業廢棄物的降解，進而創造較高的經濟價值，對我國農業廢棄物的資源化利用具有重要的意義。本研究圍繞AfLPMO7蛋白進行蛋白表達與純化、底物吸附、酶活力測定、氧化能力分析與底物識別等。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：大腸桿菌BL21，由平頂山市珍稀食用菌工程技術研究中心保存。

質粒：含有Tev標簽的pCold TF載體，由平頂山市珍稀食用菌工程技術研究中心保存。

商業酶：纖維素酶（cellulase）來源于Aspergillus niger。

LB培養基：蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，酵母粉5 g。

試劑：（1）平衡液。50 mmol NaH2PO4，300 mmol NaCl，10 mmol iminazole，NaOH調節pH至8.0，用0.22μmol濾膜抽濾后使用。（2）洗脫液。50 mmol NaH2PO4，300 mmol NaCl，300 mmol iminazole，NaOH調節pH至8.0，用0.22μmol濾膜抽濾后使用。（3）30%Acr－Bis（29∶1）、濃縮膠緩沖液、分離膠緩沖液、10%過硫酸銨（APS）、四甲基乙二胺（TEMED）、蛋白5×loading、預染蛋白Marker、Xylan、2，6－DMP等均購自源葉生物公司。（4）3%H2O2購自平頂山新城區藥店。（5）考馬斯亮藍染色液。0.25 g考馬斯亮藍R－250溶解于包含40%甲醇的水溶液中。（6）脫色液。10%乙酸、5%乙酸溶解于去離子水中。（7）結晶纖維素（Avicel PH101）購自Sigma公司；沒食子酸和氯化銅均購自南試公司。

供試儀器：AKTA蛋白純化儀（美國通用GE／AKTA Pufier10）。

1.2 方法

1.2.1AfLPMO7的進化樹分析

選取與AfLPMO7關系相近的22個蛋白的氨基酸序列，將其保存為fasta格式，使用MEGA（version 5.1，Mega Limited，Auckland，New Zealand）繪制進化樹。

1.2.2AfLPMO7的功能預測

將AfLPMO7的氨基酸序列錄入在線數據庫Conserved Domain Database（CDD）（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／Structure／cdd／wrpsb.cgi）上，對其功能模塊進行預測。

1.2.3AfLPMO7的表達和純化

將AfLPMO7的基因序列連接至含有Tev標簽的pCold TF載體上，通過42℃熱擊轉化方式將其導入大腸桿菌BL21中，得到轉化子，將轉化子接入LB培養基中培養，當吸光度600（OD600）達到0.5時加入500μmol的異丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG），誘導AfLPMO7蛋白的表達，并用SDS－PAGE電泳驗證蛋白是否表達。若蛋白表達，使用親和層析的方法純化AfLPMO7蛋白，并使用核酸定量儀（ND－2000，Thermo，USA）測定AfLPMO7的蛋白濃度［5］。

1.2.4AfLPMO7與PASC的吸附實驗

吸附實驗根據Manjeet的方法［6］稍作改動。底物選擇PASC，實驗分為兩組，一組為僅有AfLPMO7蛋白，另一組為AfLPMO7蛋白和PASC。AfLPMO7的蛋白濃度為0.5 mg／mL，PASC的濃度為10 mg／mL，反應緩沖液為磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4），反應溫度為50℃，轉速為200 r／min，反應時間為2 h。反應結束后，10 000 r離心2 min，固液分離，并將PASC用PBS洗滌3次。最后用50μL PBS重懸PASC，加入10μL蛋白上樣緩沖液，沸水浴10 min，10 000 r離心2 min后取上清，進行SDS－PAGE電泳，檢測吸附在底物上的AfLPMO7蛋白含量。

1.2.5AfLPMO7對PASC和Xylan的降解實驗

將AfLPMO7與過量氯化銅逐步混合，室溫靜置20 min。使用50 mmol醋酸鈉緩沖液（pH 5.0）平衡脫鹽柱G25，將混合物流經脫鹽柱，并用50 mmol醋酸鈉緩沖液沖洗脫鹽柱，收集蛋白溶液，即得到Cu2＋－AfLPMO7。以下酶活力實驗均用Cu2＋－AfLPMO7。

1 mL的反應體系包括底物PASC（1%）或者Xylan（1‰），1μmol Cu2＋－AfLPMO7，2 mmol的沒食子酸，50 mmol醋酸鈉緩沖液（pH 5.0）。反應溫度為50℃，轉速為150 r／min，反應時間為12 h。在同等條件下設置滅活的AfLPMO7蛋白作為對照（CK）。反應結束后，將樣品沸水浴5 min后，10 000 r離心10 min，取上清，加入等量DNS，沸水浴5 min，在波長540 nm處測吸光度，計算還原糖的含量［7］。

1.2.6AfLPMO7與纖維素酶對天然底物的糖化實驗

1 mL的反應體系包括1%水稻秸稈、1%小麥秸稈、1%玉米秸稈，0.05 U纖維素酶，1.0、2.0和3.0μmol Cu2＋－AfLPMO7，2 mmol沒食子酸，50 mmol醋酸鈉緩沖液（pH 5.0）。反應溫度為50℃，轉速為150 r／min，反應時間為24 h。反應結束后，計算還原糖的量。

1.2.7AfLPMO7動力學實驗

動力學實驗根據Breslmayr的方法［8］稍作改動。將2，6－DMP作為底物。1 U的酶活力定義為每分鐘產生1μmol木醋醌（coerulignone）的LPMO的量。緩沖液分別選擇50 mmol醋酸鈉緩沖液（pH 5.0）和PBS（pH 7.4），輔助因子H2O2的濃度為100μmol，反應溫度為30℃，在同等條件下設置滅活的AfLPMO7蛋白作為對照（CK）。反應結束后，在波長469 nm處測吸光度，計算coerulignone的量。

1.2.8AfLPMO7的同源建模和分子對接

AfLPMO7的同源建模采用AlphaFold2 server（https：／／colab.research.google.com／github／deepmind／alphafold／blob／main／notebooks／AlphaFold.ipynb＃scrollTo＝woIxeCPygt7K）?；钚灾行牡念A測采用在線預測網站Zhang Lab（https：／／zhanglab.ccmb.med.umich.edu／）。

用Vina［9－10］軟件進行分子對接實驗。以預測的AfLPMO7結構為受體、纖維六糖為配體，分別添加氫原子使其為質子化狀態，并計算扭轉分支中心和配體扭轉自由度。將His3、His85和Tyr163視為柔性，受體坐標分為剛性部分和柔性側鏈。最后，設置參數（包含全部可變換氨基酸的大網格）運行Vina程序。

2 結果與分析

2.1 Af LPMO7的序列分析

AfLPMO7的進化樹結果見圖1（a），由圖1（a）可知，AfLPMO7蛋白與多數AA9家族蛋白具有較近的親緣關系，其中具有最近關系的為PsAA9蛋白（PDB數據號：7PQR），它們的氨基酸相似度為33.36%，又與部分內切葡聚糖酶具有一定的親緣關系?；贑DD比對結果對AfLPMO7蛋白進行功能區預測見圖1（b）。由圖1（b）可知，AfLPMO7蛋白N端具有一個AA9家族功能模塊，中間部分為蛋白linker，起到連接蛋白質N端和C端的作用，C端為一個CBM1功能區，確認AfLPMO7蛋白為AA9家族蛋白。

2.2 Af LPMO7的表達純化和底物吸附實驗

AfLPMO7蛋白存在于大腸桿菌細胞內，將細胞破碎，經過鎳柱分離純化后得到其純化蛋白。經SDS－PAGE電泳驗證后，結果如圖2（a）所示，泳道1為純化后的AfLPMO7蛋白，其大小約為38 kDa，與理論預測值一致，表明其表達成功。

圖2 Af LPMO7的SDS－PAGE電泳及底物吸附結果

在AfLPMO7蛋白對PASC的吸附實驗中，經過2 h的結合，結果如圖2（b）所示，泳道2為不加底物的蛋白含量，泳道3為反應體系中未吸附的AfLPMO7蛋白，結果表明游離蛋白減少了較多的量。吸附在底物PASC的AfLPMO7蛋白含量如圖2（c）所示，其中泳道4～6均為吸附在PASC的AfLPMO7蛋白。結果表明AfLPMO7蛋白對PASC具有較強的吸附能力。

2.3 Af LPMO7對PASC和Xylan的直接降解及與纖維素酶對天然底物的糖化作用

PASC和Xylan分別為纖維素和半纖維素，將其作為底物研究AfLPMO7蛋白的酶活力。如圖3（a）所示，AfLPMO7作用于PASC時，產生了濃度為17.12μg／mL的還原糖，作用于Xylan時，產生了濃度為41.24μg／mL的還原糖，表明AfLPMO7能作用于纖維素和半纖維素，且對半纖維素的降解能力較強。

圖3 Af LPMO7對底物的直接作用及與纖維素酶對天然底物的糖化作用

本文主要研究AfLPMO7與纖維素酶協同降解天然底物。如圖3（b）所示，當以水稻秸稈為底物時，經過24 h反應后，與僅加入纖維素酶相比，分別添加1.0μmol、2.0μmol和3.0μmol的AfLPMO7蛋白，糖化率依次提高了37.53%、111.89%和87.69%。如圖3（c）所示，當以小麥秸稈為底物時，經過24 h反應后，與僅添加纖維素酶相比，分別添加1.0μmol、2.0μmol和3.0μmol的AfLPMO7蛋白，糖化率依次提高了20.48%、35.55%和38.82%。如圖3（d）所示，當以玉米秸稈為底物時，經過24 h反應后，與僅添加纖維素酶相比，分別添加1.0μmol、2.0μmol和3.0μmol的AfLPMO7蛋白，糖化率依次提高了29.97%、50.95%和22.05%。說明AfLPMO7蛋白能有效地協助纖維素酶降解天然底物，如水稻秸稈、小麥秸稈和玉米秸稈等。

2.4 Af LPMO7的動力學實驗分析

為了探究AfLPMO7蛋白的反應速率，選擇2，6－DMP作為底物，H2O2濃度為100μmol，測定AfLPMO7蛋白的動力學參數。在50 mmol醋酸鈉緩沖液（pH 5.0）中，AfLPMO7的Vmax值為109.99±3.91 U／g，Km值為2.82±0.33 mmol（見圖4（a））。在PBS（pH 7.4）中，AfLPMO7的Vmax值為91.07±1.28 U／g，Km值為0.52±0.05 mmol（見圖4（b））。

圖4 不同pH條件下Af LPMO7的米氏曲線

2.5 Af LPMO7的同源建模和活性中心的預測

使用AlphaFold2 server對AfLPMO7進行同源建模，生成的結構如圖5（a）所示，AfLPMO7的主體由AA9家族蛋白功能區和CBM1（紅色部分）組成。AA9家族蛋白功能區的核心由8個反向平行的β折疊（粉紅色）和3個α螺旋（紫色部分）組成。其活性中心位于蛋白平坦的表面，活性中心His3、His85和Tyr163氨基酸殘基組成了其銅離子活性中心（見圖5（b））。

圖5 Af LPMO7的三維結構圖

2.6 Af LPMO7的分子對接

采用分子對接技術探究AfLPMO7與纖維素的結合位點。模擬運算后，選取能量最小的作為對接模型，其能量為－9.2 kcal／mol。在AfLPMO7與纖維六糖的對接模型（見圖6（a））中，纖維六糖分子懸浮在AfLPMO7蛋白表面，且接近其活性中心的銅離子，此外還有4個氨基酸（Ser33、Thr36、Arg74、Gly159）與纖維六糖分子之間形成了氫鍵，并以此相互作用（見圖6（b））。圖6（c）為相互作用的二維可視化圖，結果表明AfLPMO7與纖維六糖的作用方式不僅有氫鍵，還有疏水作用（His3、Asn31、Thr73）。

圖6 Af LPMO7與纖維六糖的分子對接

3 討論與結論

AA9家族LPMOs是一類能有效協助纖維素酶降解纖維素的輔酶，可對纖維素多糖鏈進行破壞，使多糖鏈的結構變得疏松，進而促進纖維素水解酶進一步降解纖維素。在對AA9家族蛋白的研究中，著重研究其對纖維素的吸附作用，只有酶與底物結合，才能更好地發揮作用。評價AA9家族LPMOs對纖維素的吸附能力有兩種方法，一種是反應體系游離蛋白的減少，另一種是吸附于纖維素的蛋白量，均用SDS－PAGE電泳結果直接顯現。AfLPMO7具有一個CBM1模塊，表現出對纖維素具有較強的吸附能力。其他AA9家族蛋白如HjLPMO9A（來源于Hypocrea jecorina），在其蛋白C端，同樣具有一個CBM1功能區，因而也表現出對PASC具有較強的吸附能力［11］。此外，還有AA9家族蛋白攜帶名為X278的保守結構域，由4個半胱氨酸殘基和1個芳香殘基組成，可能具有與CBM相似的功能［12］。

AfLPMO7蛋白能夠作用于PASC和Xylan并產生還原糖，證明其能夠作用于纖維素和半纖維素。已有研究認為大部分AA9家族蛋白只能作用于纖維素底物，極少數能作用于半纖維素底物，同時能對木葡聚糖產生作用，如來源于Malbranchea cinnamomea的PMO9A＿MALCI［13］。AfLPMO7能與纖維素酶協同作用，提高纖維素酶對水稻秸稈、小麥秸稈、玉米秸稈的水解效率，提高幅度為20.48% ～111.89%。表明AfLPMO7能有效降解秸稈中難降解的部分，如木質素。一般認為，木質素對于纖維素的水解有著不利影響，但是由于AA9家族蛋白的特殊性，木質素反而會成為其降解纖維素的重要輔助因子，因為低分子量木質素具有二聚體和三聚體兩種主要構象，這種具有一簇pi－軌道的結構有利于未配對電子的穩定性，使木質素成為一種有效的電子供體［14］。

在對AfLPMO7蛋白的動力學參數測定中，在50 mmol的醋酸鈉緩沖液（pH 5.0）中，AfLPMO7具有最高的Vmax值，為109.99±3.91 U／g，Km值為2.82±0.33 mmol，表明AfLPMO7蛋白在此pH下，具有較高的氧化能力。AfLPMO7表現的氧化能力稍強于LPMO9F（來源于Neurospora crassa），這種差別可能與其蛋白質結構相關，尤其是銅離子活性中心的不同，這將影響AA9家族蛋白接受電子的能力［8］。AfLPMO7蛋白的Km值小于3 mmol，表明其銅離子活性中心進化為能結合2，6－DMP的結構。也有研究表明漆酶能有效地結合2，6－DMP，其Km值從15μmol到1 000μmol，盡管漆酶比AA9家族蛋白對2，6－DMP具有更強的結合能力，但是在木質素降解過程中，AA9家族蛋白的酶活力優于漆酶［15］。此外，在自動建模和分子對接實驗中，發現AfLPMO7蛋白銅離子活性中心由His3、His85和Tyr163氨基酸殘基組成，而其與纖維六糖結合的氨基酸為Ser33、Thr36、Arg74、Gly159，表明催化中心不一定為結合部分。

在本研究中，來源于Aspergillus fumigatusZ5的AfLPMO7蛋白被定性。AfLPMO7對PASC具有很強的吸附能力，能直接作用于PASC和Xylan，并釋放出可溶性產物，且對2，6－DMP具有較強的氧化能力，并能協助纖維素酶有效降解天然底物。該結果為更好地利用AA9家族蛋白提供了一定的支持。