基于網絡藥理學和分子對接探討壯骨強筋片治療老年性骨質疏松癥的作用機制

鄔裕 ，周澤霖 ，歐陽帥 ，陳松海 ，葉林強 ，張志剛 ，王志強 ，盧國樑

1.廣州中醫藥大學東莞醫院，廣東 東莞 523000；2.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東 廣州 510405

骨質疏松癥（osteoporosis，OP）是一種以骨骼脆性增加、骨微結構破壞為特征的全身性疾病[1]，其中老年性骨質疏松（senile osteoporosis，SOP）多發于70歲以上人群[2]，隨著人口老齡化社會的到來，SOP患病率呈逐年上升趨勢[3]。目前臨床多應用鈣劑、雙磷酸鹽類、抗骨吸收劑等藥物防治SOP，但由于較高的醫療費用和不良反應限制了其長期應用[4-5]。中醫藥治療OP療效顯著，且不良反應較少，適合長期應用，可為SOP的防治提供思路。

壯骨強筋片是由廣州中醫藥大學東莞醫院葉偉洪教授團隊研發的院內中藥復方制劑，已廣泛用于各類骨傷疾病的臨床治療，具有維持骨量、提升骨密度的作用，臨床療效較好[6-9]。研究表明，壯骨強筋片可促進老年模型大鼠骨髓基質干細胞增殖與成骨分化[10]，但其作用機制尚未明確。因此，探索壯骨強筋片潛在的藥物活性成分和相關作用靶點，分析其作用機制，對于闡述壯骨強筋片臨床應用的科學性有重要意義。本研究基于網絡藥理學和分子對接技術，分析壯骨強筋片治療SOP的活性成分、相關靶點與信號通路，探討其治療SOP的作用機制。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分及靶點獲取

檢索TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）中壯骨強筋片組方藥物杜仲、千斤拔、淫羊藿、肉蓯蓉、牛膝、黨參、當歸、地骨皮、羌活、獨活的化學成分，并獲取其靶點。以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為條件，篩選活性成分。通過UniProt數據庫（https://www.uniprot.org/）查詢并轉換為靶點對應的人類基因名。

五加皮、鹿角膠、何首烏、龜甲未收錄于TCMSP，故利用中藥高通量實驗和參考數據庫（HERB，http://herb.ac.cn/）[11]查找其化學成分，以OB≥30%、DL≥0.18為條件篩選活性成分。由于HERB數據庫中龜甲無符合條件的成分，通過PubChem數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得龜甲化學成分的SMILE號，再通過SwissTargetPrediction數據庫（http://new.swisstargetprediction.ch/），設置物種為“Homo Sapiens”、Probability＞0，篩選龜甲活性成分。利用UniProt數據庫中的UniprotKB對靶點名稱進行規范化處理，得到龜甲活性成分作用靶點。

1.2 篩選疾病藥物交集靶點

以“Senile Osteoporosis”為關鍵詞，檢索DisGeNet數據庫（www.disgenet.org）、GeneCards數據庫（https://www.genecards.org/）和OMIM數據庫（https://www.omim.org）中SOP相關靶點，其中，DisGeNet數據庫設置score≥0.3，GeneCards數據庫設置score≥5，刪除重復項，獲得SOP相關靶點。利用R4.2.0中的VennDiagram包，將SOP靶點與壯骨強筋片藥物活性成分靶點進行映射，得到交集靶點。

1.3 “疾病-藥物-成分-交集靶點”網絡構建

將交集靶點及其對應的藥物成分、靶點基因數據導入Cytoscape3.8.0，采用Network功能構建“疾病-藥物-成分-交集靶點”網絡，并進行網絡特征分析，以度值排名前10位的活性成分為核心成分。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用網絡構建

將交集靶點導入STRING數據庫（https://stringdb.org/），隱藏孤立蛋白靶點后獲得蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）數據，導入Cytoscape3.8.0中構建PPI網絡，利用CytoNCA插件進行網絡拓撲分析，以節點度值前10位的靶點作為核心靶點。

1.5 生物信息學分析

將交集靶點導入DAVID數據庫（http://david.ncifcrf.gov/），限制物種條件為“Homo Sapiens”，設定閾值為P＜0.05，對交集靶點進行GO功能與KEGG通路富集分析，采用R4.2.0中的“ggplot”程序包，設置P-value與Q-value的Cutoff值為0.05，將GO生物過程、細胞組分、分子功能及KEGG信號通路中顯著性前10位的富集結果進行可視化展示。將KEGG信號通路富集結果CSV數據導入Cytoscape3.8.0，構建“核心靶點-信號通路”網絡。

1.6 分子對接

選取“疾病-藥物-成分-交集靶點”網絡中度值排名靠前的核心成分與PPI網絡中度值排名靠前的核心靶點蛋白進行分子對接驗證。分別從RSCB PDB數據庫（https://www.rcsb.org/）獲取靶點蛋白的晶體結構文件，從PubChem數據庫獲取核心成分的結構文件，使用AutoDockTools軟件計算核心成分與靶點蛋白間的最低結合能，并將分子對接模式進行可視化。

2 結果

2.1 壯骨強筋片活性成分及作用靶點

檢索TCMSP和HERB數據庫，獲得壯骨強筋片組方藥物杜仲28個、羌活15個、獨活9個、地骨皮13個、千斤拔1個、五加皮4個、淫羊藿23個、鹿角膠2個、肉蓯蓉5個、牛膝15個、何首烏8個、黨參15個、當歸2個活性成分。通過檢索SwissTargetPrediction數據庫，得到龜甲活性成分15個。獲得壯骨強筋片活性成分作用靶點270個。

2.2 壯骨強筋片治療老年性骨質疏松潛在靶點預測

檢索DisGeNet、GeneCards、OMIM數據庫，分別獲得73、1 133、45個靶點，去重后得到433個SOP相關靶點。將疾病靶點與藥物靶點相映射，得到61個交集靶點。

2.3 “疾病-藥物-成分-交集靶點”網絡分析

將中藥、活性成分、疾病及交集靶點導入Cytoscape3.8.0，構建“疾病-藥物-成分-交集靶點”網絡，見圖1。該網絡包括171個節點和509條邊，節點之間的連線表示疾病-交集靶點、藥物-成分、成分-交集靶點具有相互關系。

圖1 壯骨強筋片治療SOP“疾病-藥物-成分-交集靶點”網絡

根據度值排序，以前10位的活性成分為核心成分，包括槲皮素、木犀草素、山柰酚、漢黃芩素、黃芩素等，見表1。

表1 壯骨強筋片治療SOP核心成分

2.4 蛋白質-蛋白質相互作用網絡分析

將交集靶點導入STRING數據庫，獲得PPI關系信息，導入Cytoscape3.8.0構建PPI網絡，見圖2。網絡包括60個節點、349條邊。網絡中節點顏色深淺代表度值大小，顏色越深度值越大，顏色越淺度值越小。度值排名前10位的靶點蛋白分別為TNF（度值32）、IL6（度值29）、AKT1（度值27）、VEGFA（度值25）、TP53（度值24）、IL1B（度值24）、MMP9（度值23）、IL10（度值21）、CCL2（度值20）、CTNNB1（度值20），可能為壯骨強筋片治療SOP的核心靶點。

圖2 壯骨強筋片治療SOP靶點PPI網絡

2.5 GO功能富集分析

使用R4.2.0對61個交集靶點進行GO功能富集分析，得到生物過程1 717個條目，細胞組分22個條目、分子功能84個條目。其中生物過程主要富集于氧化應激反應、生殖結構發育、生殖系統發育、凋亡信號通路的調控、細胞對脂多糖的反應、平滑肌細胞增殖的調控、平滑肌細胞增殖等方面。細胞組分主要涉及轉錄調節器復合體、胞質囊腔、細胞膜筏、囊腔、膜微域等部位。分子功能主要涉及信號受體激活物活性、受體配體活性、細胞因子活性、細胞因子受體結合程度、轉錄輔助調節因子結合、生長因子受體結合程度等方面，見圖3～圖5。

圖3 壯骨強筋片治療SOP靶點GO生物過程富集分析氣泡圖

圖4 壯骨強筋片治療SOP靶點GO細胞組分富集分析氣泡圖

圖5 壯骨強筋片治療SOP靶點GO分子功能富集分析氣泡圖

2.6 KEGG通路富集分析

使用R4.2.0對61個交集靶點進行KEGG通路富集分析，得到123條通路，包括AGE-RAGE信號通路、脂質和動脈粥樣硬化、流體剪切應力和動脈粥樣硬化等，見圖6。運用Cytoscape3.8.0構建“核心靶點-信號通路”網絡，見圖7。

圖6 壯骨強筋片治療SOP靶點KEGG通路富集分析氣泡圖

圖7 壯骨強筋片治療SOP“核心靶點-信號通路”網絡

2.7 分子對接驗證

將“疾病-藥物-成分-交集靶點”網絡中度值前5位的核心成分（槲皮素、木犀草素、山柰酚、漢黃芩素、黃芩素）與PPI網絡中度值排名前6位的靶點（TNF、AKT1、TP53、IL6、VEGTA、MMP9）進行分子對接，得到核心成分與靶點蛋白間的結合能結果，見圖8。圖中縱坐標代表靶點蛋白，橫坐標為壯骨強筋片的核心成分，顏色越深紅代表結合能越高。結果顯示，大部分核心成分和靶點均有較優的對接活性（Total Score≤-5.0 kcal/mol），表明壯骨強筋片核心成分與靶點結合作用良好。將具有最低結合能的4對配體和受體分子對接模式進行可視化處理，見圖9。

圖8 壯骨強筋片治療SOP核心成分與靶點分子對接結合能熱圖

圖9 壯骨強筋片治療SOP核心成分與靶點分子對接構象圖

3 討論

SOP屬中醫學“骨枯”“骨痿”等范疇?！饵S帝內經》提到“骨痿”其標在骨，其本在腎，因此“骨痿者，補腎法治之”正是治病求本的體現。壯骨強筋片方中杜仲、五加皮、淫羊藿、肉蓯蓉、鹿角膠、千斤拔、牛膝等補腎陽，強筋骨；羌活、獨活祛風濕，止痹痛；黨參、當歸補脾肺，養氣血；龜甲、何首烏、黃柏、地骨皮滋腎陰，除骨蒸。全方共奏滋補肝腎、強筋壯骨、益氣養血之效。

本研究基于網絡藥理學和分子對接技術分析了壯骨強筋片治療SOP的活性成分、潛在作用靶點與作用通路，結果顯示，壯骨強筋片治療SOP的核心成分為槲皮素、木犀草素、山柰酚等。研究發現，槲皮素可促進骨髓間充質干細胞增殖和成骨分化，進而對骨損傷具有保護作用[12]；木犀草素可減輕氧化應激，促進成骨細胞分化，從而促進細胞增殖，減輕糖皮質激素誘導的OP[13]；山柰酚可通過抑制脂肪生成、炎癥、氧化應激、破骨細胞自噬和成骨細胞凋亡，達到骨保護作用[14]。因此，壯骨強筋片可能主要通過槲皮素、木犀草素、山柰酚等活性成分發揮治療SOP作用。

通過靶點預測得到61個交集靶點，PPI網絡分析結果表明，壯骨強筋片作用于SOP的核心靶點包括TNF、IL6、AKT1、VEGFA等。其中，TNF度值排序第一，可能是壯骨強筋片治療SOP的關鍵靶點。TNF為促炎性細胞因子，主要由巨噬細胞分泌，可參與調控多種生物過程，如細胞增殖、分化、凋亡等。研究發現，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）可直接增強骨細胞中核因子κB受體活化因子配體（RANKL）表達，促進破骨細胞形成[15]。同時，機械力可誘導TNF-α，使其表達骨硬化蛋白，進而引起破骨細胞形成[16]。此外，TNF-α可通過獨立于RANKL的其他信號通路介導破骨細胞的形成，進而導致骨吸收[16-17]。在成骨方面，TNF-α可通過核因子κB（NF-κB）通路靶向Runx2基因，抑制成骨細胞分化[17]。因此，推測TNF上調是SOP發生的重要因素，壯骨強筋片可能通過下調TNF治療SOP。度值排名第二的靶點為IL6，也是一種促炎性細胞因子，具有調節免疫系統的作用。白細胞介素（IL）-6可間接通過RANKL促進破骨細胞生成，并增強骨吸收，與TNF-α具有共同增強成骨細胞自噬的作用，TNF-α在TNFR1的調控下通過各種信號通路介導細胞自噬，IL-6在此過程中扮演重要角色[18]。AKT1是AKT家族成員，可被PI3K活化后發揮作用，并可調節細胞增殖、代謝及血管生成等過程。AKT1是成骨細胞的負向調控因子，其下調可促進成骨細胞生成，并可降低破骨細胞特異性的mRNA，減少破骨細胞生成[19]。VEGFA是血管內皮生長因子（VEGF）家族成員，成骨細胞源性VEGF可調控成骨細胞分化，并且VEGF也調控成脂分化與成骨分化之間的平衡，這種平衡的破壞是發生OP的潛在機制[20]。由“疾病-藥物-成分-交集靶點”網絡可見，壯骨強筋片治療SOP是通過多靶點、多途徑較為復雜的機制下實現。

GO功能富集分析結果顯示，主要的生物過程包括氧化應激反應、生殖結構發育、生殖系統發育、調節自噬相關的信號通路等。其中氧化應激反應和自噬相關信號通路與免疫應答密切相關，因此其過程會受到TNF-α、IL-6等炎癥因子的調控，進而推進OP的病理過程。另外，壯骨強筋片治療SOP的相關靶作用點可富集于生殖發育相關的生物過程。雌激素、雄激素等性激素的調控可直接或間接地導致SOP[21]，這也與中醫學中“腎藏先天之精”“精生髓”“髓生骨”等理論對應。

KEGG通路富集結果顯示，與糖尿病并發癥相關的AGE-RAGE信號通路、脂質和動脈粥樣硬化、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、炎癥反應和細胞的糖脂代謝有緊密聯系，故與GO功能富集結果和PPI網絡分析的規律相同。長期持續性的高糖高脂狀態可破壞骨質的細微結構、礦物沉積及骨的生物力學強度[22-23]。晚期糖基化終末產物（AGEs）主要來源于高糖血癥，并可驅使氧化應激反應及異常骨重建[24]。AGEs上調可促進活性氧產生，并通過AGEs受體（RAGE）激活，導致NF-κB染色體移位并繼發促進組織蛋白酶K表達，最終導致骨吸收[25-26]。壯骨強筋片可能通過清除AGEs方式降低氧化應激反應，進而減少骨吸收，達到治療SOP的目的。根據KEGG富集結果可見，信號通路排序二、三的通路均與動脈粥樣硬化相關，動脈粥樣硬化常繼發于糖尿病之后，且與骨量減少具有相關性[27]。不同程度下的炎癥狀態均會引發OP與動脈粥樣硬化，因此TNF-α、IL-6、IL-17等炎癥因子對動脈粥樣硬化與OP的發病具有共同的作用[28]。此外，脂肪分泌因子如脂聯素、瘦素、抵抗素和趨化素亦與動脈粥樣硬化和OP具有相關性[29]。因此，從核心信號通路可推測壯骨強筋片是通過調節免疫與糖脂代謝方式治療SOP。

綜上，壯骨強筋片治療SOP主要通過槲皮素、木犀草素、山柰酚等活性成分，作用于TNF、IL6、AKT1、VEGFA等關鍵靶點，進而通過調控免疫與細胞代謝治療SOP，表明壯骨強筋片發揮多成分、多靶點、多網絡的藥理作用。本研究結果可為既往壯骨強筋片的臨床療效提供分子層面的支撐，亦為后續相關藥理機制研究和實驗提供數據支持。