基于網絡藥理學與分子對接探討山茱萸-菟絲子治療認知障礙的作用機制

徐潔 ，陳競緯

1.南京中醫藥大學，江蘇 南京 210023；2.南京中醫藥大學附屬蘇州市中醫醫院，江蘇 蘇州 215009

認知障礙指各種原因導致的各種程度的認知功能損害，患者大腦中與學習記憶及思維判斷有關的高級智能加工過程出現異常，從而引起學習、記憶障礙，同時伴有失語、失認、失行等改變[1]。其機制可能與腦灌注減少、動脈粥樣硬化、淀粉樣蛋白沉積及腦白質改變等多種機制有關[2]。古代醫家多認為腎精虧虛、髓海不足為其主要病因，臨床治療以補腎填精益髓為主要原則。山茱萸-菟絲子是歷代醫家治療認知障礙的常用補腎填精藥對之一，山茱萸在《神農本草經》中被列為中品，藥味酸、澀，微溫，入肝、腎經?，F代研究表明，山茱萸提取物可通過對大鼠海馬神經元的保護作用改善認知障礙[3]。菟絲子具有補益肝腎、固精縮尿、明目、安胎、止瀉等功效?！独坠谥怂幮越狻氛J為該藥“入腎精……久服強陰堅骨，駐顏明目輕身，令人多子”。劉海云等[4]研究表明，菟絲子提取物能顯著提高腦和肝組織中ATP酶活力和過氧化氫酶活性，降低其過氧化脂質含量，從而改善衰老小鼠模型的學習記憶能力。課題組前期研究表明，含此藥對的膏方可有效改善海馬體齒狀回區神經元數目下降，提高學習記憶功能中神經元突觸長時程增強相關蛋白表達水平，從而改善老年自發性高血壓大鼠的學習記憶功能[5]，但其更深一步的作用機制尚不清楚。

目前網絡藥理學在中藥研究方面成果顯著，通過構建網絡預測藥物潛在靶點與作用機制。因此，本研究采用網絡藥理學方法探討山茱萸-菟絲子活性成分治療認知障礙的作用機制，為后續研究提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 認知功能障礙疾病靶點獲取

以“cognitive impairment”“mild cognitive impairment”“dementia”“Alzheimer's disease”為檢索詞，檢索TTD數據庫（http://db.idrblab.net/ttd/）、GeneCards數據庫（https://www.genecards.org/）、OMIM數據庫（https://omim.org/），設置屬性為“Homo sapiens”，刪除重復靶點，獲得認知功能障礙疾病相關靶點。

1.2 山茱萸-菟絲子化學成分及對應靶點收集

檢索TCMSP數據庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php）檢索山茱萸、菟絲子的化學成分，以口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18為條件，篩選活性成分。利用UniProt數據庫（https://www.uniprot.org/）將活性成分作用靶點名稱進行規范化處理。

1.3 作用靶點預測

使用R4.2.2軟件將山茱萸-菟絲子活性成分靶點與認知功能障礙疾病靶點相映射，交集靶點即為山茱萸-菟絲子干預認知功能障礙的預測靶點。

1.4 “藥物-活性成分-靶點”網絡構建

運用perl5.36.0軟件將山茱萸-菟絲子靶點與疾病靶點相映射，采用Cytoscape3.7.2軟件將相關數據進行可視化處理，構建“藥物-活性成分-靶點”網絡。

1.5 蛋白相互作用網絡構建

將交集靶點導入STRING11.5數據庫（https://string-db.org/），設定生物種類為“Homo sapiens”且交互分數＞0.9，隱藏游離節點，構建靶點蛋白相互作用（PPI）網絡，并下載.tsv格式文件。

1.6 核心靶點篩選

將“1.5”項下.tsv格式文件導入Cytoscape3.7.2軟件，采用Network Analyzer工具進行網絡拓撲分析，計算度中心性（DC）、中介中心性（BC）、緊密中心性（CC）、特征向量中心性（EC）、網絡中心性（NC）和局部平均連通性（LAC）。根據度值由高到低排序，篩選數值大于中位數的節點，從而獲得山茱萸-菟絲子治療認知功能障礙的核心靶點。

1.7 GO功能和KEGG通路富集分析

運用R語言org.Hs.eg.db軟件包對交集靶點進行基因ID轉換，利用R語言clusterProfiler、org.Hs.eg.db、enrichplot、ggplot2、Pathview軟件包進行GO功能和KEGG通路富集分析。

1.8 分子對接

根據獲得的關鍵活性成分相關信息，通過PubChem數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取活性成分結構。在UniProt數據庫獲取核心靶點的相關信息，通過PDB數據庫（http://www.rcsb.org/）下載大分子受體蛋白即核心靶點結構。采用PyMoL2.4.0軟件將其去水、去雜質、去除配體后，保存為pdb格式文件，導入AutoDock1.5.6軟件進行加氫、計算電荷等操作，導出為pdbqt格式。對配體分子進行位置調整，同時設定蛋白活性口袋。使用Vina1.1.2軟件進行分子對接，并計算結合能。利用PyMoL2.4.0軟件對分子對接結果進行結構處理和可視化，使用Ligplot+2.2.5軟件進行相互作用力分析。

2 結果

2.1 認知功能障礙疾病靶點

經整合、去重后得到認知功能障礙疾病靶點12 187個。

2.2 山茱萸-菟絲子活性成分及對應靶點

獲得山茱萸-菟絲子活性成分30個，其中山茱萸20個，菟絲子11個，β-谷甾醇為共有成分，見表1。獲得202個活性成分作用靶點。

表1 山茱萸、菟絲子活性成分

2.3 山茱萸-菟絲子治療認知功能障礙靶點預測

將202個山茱萸-菟絲子活性成分靶點與12 187個認知障礙靶點取交集，共得到184個山茱萸-菟絲子治療認知障礙的潛在靶點。

2.4 “藥物-活性成分-靶點”網絡

采用Cytoscape3.7.2軟件構建“藥物-活性成分-靶點”網絡，見圖1，其中左側節點表示中藥成分，右側節點表示靶點，節點越大，則與其他節點聯系越緊密；邊表示兩節點間存在相互作用。山茱萸-菟絲子22個活性成分作用于184個靶點，其中quercetin（槲皮素）、tetrahydroalstonine（四氫鴨腳木堿）、kaempferol（山柰酚）等與靶點連線多，為關鍵核心成分。

圖1 山茱萸-菟絲子治療認知障礙“藥物-活性成分-靶點”網絡

2.5 靶點蛋白相互作用網絡

山茱萸-菟絲子治療認知障礙靶點PPI網絡見圖2，節點代表靶點蛋白，邊代表靶點蛋白的關系，線條越多表示蛋白越重要，網絡有145個節點，604條關系。

圖2 山茱萸-菟絲子治療認知障礙靶點PPI網絡

2.6 核心靶點篩選

選擇DC≥11（2倍中位數值）的節點作為候選靶點，對其網絡進行提取分析，以BC≥20.18、CC≥0.57、EC≥0.15、LAC≥4.43、NC≥5.33為標準篩選出核心靶點13個（MAPK1、TP53、HSP90AA1、FOS、HIF1A等），見圖3、表2。這些靶點可能是山茱萸-菟絲子治療認知障礙的關鍵靶點。

表2 山茱萸-菟絲子治療認知障礙核心靶點

2.7 GO功能和KEGG通路富集分析結果

以校正后P＜0.05為條件，得到GO條目2 678個，生物過程主要涉及對外來生物刺激的反應、對營養水平的反應、對脂多糖的反應、細胞對化學壓力的反應、對氧化應激的反應等；細胞組分主要涉及膜筏、膜微域、膜小凹等；分子功能涉及核受體活性、配體激活的轉錄因子活性、DNA結合轉錄因子結合等。對P值最小的前10個條目進行可視化展示，見圖4。

圖4 山茱萸-菟絲子治療認知障礙靶點GO富集分析

KEGG通路富集分析共得到179條（P＜0.05）信號通路，P值最小的前20條通路包括：脂質與動脈粥樣硬化、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、PI3K-Akt通路、HIF-1信號通路等，見圖5。

圖5 山茱萸-菟絲子治療認知障礙靶點KEGG富集分析

2.8 分子對接結果

選擇PPI網絡中DC值較高，且與疾病關系密切的靶點MAPK1（PDB-ID：2DKZ）、TP53（PDB-ID：1GZH）、HSP90AA1（PDB-ID：7DHG）、RELA（PDB-ID：2VGE）、FOS（PDB-ID：1A02）、MAPK14（PDB-ID：1KWP）、ESR1（PDB-ID：1ERE）、MYC（PDB-ID：1A93）、EGFR（PDB-ID：1IVO）、AKT1（PDB-ID：1H10）、NR3C1（PDB-ID：1M2Z）、HIF1A（PDB-ID：1H2K）、STAT1（PDB-ID：1BF5）作為受體，與其對應的活性成分作為配體，進行分子對接，對接后得到其結合能與結合位點。結合能越低則配體與受體結合活性越高，結合能力越強，結合能≤-5.0 kcal/mol時則成分與靶點有較好活性，結合能≤-7.0 kcal/mol時則結合活性強烈[6]。結果顯示，關鍵活性成分與靶點結合能均≤-5.0 kcal/mol，其中結合能≤-7.0 kcal/mol的對接結果占53.8%，見表3。將分子對接結果導入Ligplot+軟件，生成睫毛圖，見圖6。

圖6 山茱萸-菟絲子關鍵活性成分與靶點蛋白分子對接模式

表3 山茱萸-菟絲子治療認知障礙核心靶點與關鍵活性成分分子對接結合能

3 討論

認知障礙可歸屬中醫學“癡呆”“善忘”等范疇，其病變雖在腦，但從臟腑辨證來說，定位在腎。腎為先天之本，主骨生髓，腎精虧虛，腦髓不足，腦失所養是認知障礙的發病基礎[7]。認知障礙病因復雜，預后不佳，受到越來越多的關注。山茱萸-菟絲子作為補腎填精的藥對之一，廣泛用于包括認知障礙在內的多個系統的疾病。丁月霞等[8]對物理性切斷穹隆海馬傘的大鼠進行研究，發現山茱萸可抑制腦內凋亡信號進一步激活，其效果與上調細胞凋亡抑制因子并下調細胞凋亡促進因子有關；趙倩等[9]研究表明，菟絲子可通過抑制淀粉樣前體蛋白過度裂解、毒性β淀粉樣蛋白過度堆積、Tau蛋白異常磷酸化，減少炎癥因子表達、調節雌激素等方面干預認知障礙。

認知障礙涵蓋輕度認知損害至癡呆的各個階段[10]。本研究篩選山茱萸-菟絲子中關鍵活性成分及認知障礙的核心靶點，并進行分子對接。研究結果表明，作用靶點較多的活性成分為槲皮素、山柰酚、異鼠李素、四氫鴨腳木堿，山茱萸-菟絲子多從抗氧化應激、抗炎及免疫調節、糖脂調節等途徑發揮神經保護作用，以治療認知障礙。

與認知障礙相關的核心靶點中，MAPK1（絲裂原激活化蛋白激酶）、TP53（腫瘤蛋白p53）、HSP90AA1（熱休克蛋白）、FOS、HIF1A（缺氧誘導因子）影響認知障礙的發生發展。

隨著生物年齡的增長，腦部神經元數量逐年減少，根本原因為細胞凋亡反應的發生。MAPK通路是潛在的分子治療靶點，其被廣泛應用于神經系統疾病的機制研究。Deng等[11]研究發現，抑制MAPK1可有效減少海馬細胞凋亡，改善認知功能障礙。研究顯示，菟絲子總黃酮以時間和劑量依賴性活化MAPK通路，下調p-ERK和p-p38的同時上調雌二醇水平，從而減少氧化應激損傷[12]。陳晶晶[13]在人成骨肉瘤細胞MG63的實驗中發現，雌二醇可促進成骨細胞HIF1A基因表達。TP53是目前發現的重要抑癌基因，主要參與細胞應激損傷后的應激反應，影響細胞增殖、分化和凋亡過程[14-15]。p53是細胞衰老的負性調節因子，與細胞周期、細胞凋亡、細胞衰老、細胞增殖分化、線粒體功能障礙、DNA結合和轉錄等重要的生物學功能密切相關，p53的激活可誘導細胞衰老，是細胞衰老的生物學標志[16]。近年研究發現，菟絲子提取物能依賴性抑制凋亡相關蛋白p53、Bax表達，對去血清和活性氧損傷等因素造成的細胞損傷有一定保護作用，并調節細胞氧化還原狀態[17]。在利用山茱萸活性成分5-羥甲基糠醛對體外培養的海馬神經細胞抗氧化作用及機制研究發現，5-羥甲基糠醛能夠發揮抗氧化作用，抑制H2O2誘導的大鼠海馬神經元凋亡，可能與其增加Bcl-2基因表達，降低p53、Bax和caspase-3基因表達有關[18]。氧化應激是導致衰老和認知障礙等多種神經退行性疾病發展的重要因素[19]，缺氧誘導因子（HIF-1）是一種對缺氧環境較為敏感，參與機體缺氧后信號調節通路的轉錄因子[20]。HIF-1由誘導型亞基（HIF-1α）和組成型亞基（HIF-1β）組成。HIF-1活性主要受HIF-1α亞基控制，當腦內缺血缺氧時，細胞內HIF-1α含量增加，從而激活下游有關缺氧耐受的調節通路[21]?，F有研究表明，在缺血性腦卒中的梗死區及其周圍可發現血管新生相關因子表達增高，新生血管增多，從而有助于機體產生內源性代償及側支循環，增加大腦缺血部位的血流灌注[22]。熱休克蛋白也稱熱應激蛋白，在細胞生長、發育、分化、基因轉錄等方面發揮重要作用，主要是在應激狀態下保護細胞生命活動所必需的蛋白質，維持細胞生存。Hu等[23]研究表明，HSP90AA1在病毒感染早期調節Akt-mTOR分子級聯途徑以激活自噬的機制。Park等[24]研究發現，HSP90AA1可激活VEGF信號通路，釋放多種生長因子和細胞因子，刺激血管內皮細胞的增殖和遷移，促進血管生成，改善組織缺血缺氧。本研究預測山茱萸-菟絲子通過促進HSP90AA1，從而促進海馬區新生血管生成，改善認知功能。研究表明，菟絲子水提取物可明顯提高骨質疏松骨折大鼠組織中骨生長因子VEGF等表達水平[25]，但其對HSP90AA1的作用尚未見相關研究。來麗娜等[26]發現，山茱萸多糖可誘導熱休克蛋白的產生，從而使心肌細胞耐受缺氧復氧損傷。張慧丹等[27]亦通過細胞實驗發現，山茱萸多糖血清可通過調節HSP表達減輕細胞DNA損傷，從而發揮抗人胚肺二倍體成纖維細胞衰老的作用。FOS存在于海馬組織，可對外界刺激迅速作出反應，Yap等[28]研究表明，FOS激活可能是鞏固記憶的必要功能，促使神經元可以微調來自抑制性神經元的輸入，從而形成具有協調活動的持久記憶網絡。FOS蛋白表達與學習記憶有密切關系，正常情況下神經元細胞表達極低，缺氧缺血性腦損傷可誘導FOS蛋白表達，使FOS積累，說明缺血后神經元蛋白合成能力得到快速恢復[29]。范慧晗等[30]實驗表明，山茱萸多糖及水煎劑可上調FOS mRNA水平，提高癡呆模型大鼠的學習記憶能力。

由此推論，山茱萸-菟絲子可通過調節MAPK1、TP53、HSP90AA1、FOS、HIF1A等基因表達治療認知障礙。

通過KEGG通路富集分析和GO富集分析，山茱萸-菟絲子通過參與多種生物過程和調控多條信號通路影響認知障礙的進展，其中PI3K-Akt通路、HIF-1α/VEGF通路與認知障礙密切相關。PI3K-Akt信號通路廣泛存在于各種細胞中，是神經存活信號轉導的主要途徑之一，是經典的抗凋亡、促存活的信號轉導通路，也是調節大腦認知功能的關鍵信號通路。劉玥欣[31]通過對相關文獻進行綜述，發現多數輕度認知功能障礙患者因腦內PI3K-Akt信號通路受到抑制，進而引發神經細胞凋亡，影響記憶功能，通過激活PI3K-Akt信號通路，抑制神經細胞凋亡、改善能量代謝、促進神經功能恢復，有效保護大腦正常生理功能。缺血缺氧是導致認知障礙的主要原因，缺血缺氧通過破壞神經生長發育甚至使其凋亡壞死而改變海馬區的功能，最終導致認知能力持續性下降。HIF1可激活VEGF/VEGFR-2通路，使血管通透性升高，誘導內皮細胞遷移增殖，為血管再生及滲透做準備。通過對HIF-1α/VEGF信號通路的促進，可促使血管新生及脈管網絡成熟，改善腦內微循環，抑制神經元凋亡，進而起到神經保護的作用。

分子對接結果顯示，結合能均＜-5.0 kcal/mol，表明活性成分與蛋白有較好的結合活性。其中槲皮素與HSP90AA1、FOS、EGFR、HIF1A，山柰酚與HSP90AA1，異鼠李素與HSP90AA1、MAPK14、ESR1，四氫鴨腳木堿與NR3C1，β-谷甾醇與HSP90AA1之間結合能≤-7.0 kcal/mol，表明這些活性成分在治療認知障礙中具有重要的藥理作用，可對其進行深入研究。

本研究尚存在一定局限性：僅從網絡藥理學角度發掘山茱萸-菟絲子治療認知障礙的機制，缺少實驗驗證；山茱萸-菟絲子在不同復方中作用和功效不同，藥對有效成分并不能完全代表復方的有效成分和作用。

綜上所述，本研究利用網絡藥理學及分子對接技術，探討了山茱萸-菟絲子治療認知障礙的活性成分、核心靶點及分子作用機制。山茱萸-菟絲子治療認知障礙通過槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、異鼠李素、豆甾醇、四氫鴨腳木堿等多種成分作用于MAPK1、TP53、HSP90AA1、FOS、HIF1A等多個靶點，從而影響PI3K-Akt通路、HIF-1α/VEGF通路等多條相關通路發揮作用，為進一步研究中藥治療認知障礙的機制提供了分子基礎。