貝萊斯芽孢桿菌提升雪茄茄衣煙葉發酵品質機制研究

張彤彤,趙君,余君,李林瑋,黃晨奕 ,楊春雷,陳雄,姚蘭

1.湖北工業大學 生物工程與食品學院,湖北,武漢 430068;2.中國輕工武漢設計工程有限責任公司,湖北 武漢 430060;3.湖北省煙草科學研究院,湖北 武漢 430030

0 引言

雪茄煙是一種需要經過發酵的特殊煙草制品[1],按照其結構由內而外可分為茄芯、茄套和茄衣,其中茄衣是雪茄的精華部分,除對煙支有保護和美化作用外,還可提升雪茄風味。在抽吸過程中,茄衣與空氣接觸更為充分,燃燒相對猛烈,感官貢獻度較高,因此,業界對茄衣煙葉的原料和工藝要求均較高[2]。適宜的發酵可有效改善茄衣煙葉的內在和外觀品質,目前有關雪茄茄衣的發酵研究多集中于發酵工藝的優化[3],而對于添加特定菌是否會影響茄衣品質及相應影響機制的研究較少。

基于高通量測序技術的宏基因組學,能夠幫助人們了解微生物群落中的種群分布[4-6],是研究發酵過程中微生物群落演替及作用機制,挖掘核心功能微生物及關鍵功能基因的有力手段[7],有助于拓寬微生物資源的利用空間。

本實驗室前期從雪茄茄衣表面篩選出一株降解大分子物質能力較強的貝萊斯芽孢桿菌H1(BacillusvelezensisH1),該菌可同時分泌淀粉酶、蛋白酶、果膠酶、纖維素酶和木質素降解酶[8]。為了進一步探究該菌提高雪茄茄衣煙葉品質的機制,本文擬以雪茄茄衣煙葉為研究對象,分析發酵過程中添加貝萊斯芽孢桿菌H1對煙葉微生物種群結構的影響,輔以優勢菌屬的功能貢獻度分析,進一步探討主要菌屬在雪茄茄衣煙葉發酵中的作用,以期為雪茄內在和外觀品質的提升提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器

主要材料:供試煙葉(CX-012茄衣中部煙葉),2022年湖北省恩施州煙草站種植。貝萊斯芽孢桿菌H1,保藏于湖北工業大學生物工程與食品學院實驗室。

主要試劑:聚乙烯吡咯烷酮(PVP),分析純,蘭杰柯科技有限公司;Tris-HCl、EDTA-Na2、Tween-20、二氯甲烷,均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

主要儀器:AL104型電子分析天平,北京賽多利斯天平有限公司;YXQ-75SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器,上海博訊實業有限公司醫療設備廠;SPX-150D型恒溫生化培養箱,上海博訊實業有限公司醫療設備廠;PE-28型pH計,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;CJ-2D型無菌操作臺,天津市泰斯特儀器有限公司;Agilent 7890b氣相色譜-質譜聯用分析儀(GC-MS),安捷倫科技有限公司; FUTURA型連續流動分析儀,上海澤權儀器設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵方法采用裝箱發酵法,箱子長、寬、高分別為1.5 m、1.2 m和1.3 m,裝箱煙葉質量為100 kg,在溫度為30～35 ℃的發酵房進行工業發酵。煙葉發酵初始溫度為30 ℃,翻堆溫度為(50±1) ℃。FB組(實驗組)為添加14.29 kg水和20 kg貝萊斯芽孢桿菌H1菌液的發酵煙葉;NF組(對照組)為未發酵煙葉,FW組(空白組)為僅添加14.29 kg水的自然發酵煙葉,所有處理組的初始含水量均為(30±1)%。按照上層翻到下層、外層翻到內層的原則進行煙葉翻堆,發酵持續21 d。

1.2.2 常規化學成分測定參照L.Yao等[9]的方法,取烘干后的煙葉粉末0.25 g,加入25 mL萃取液(醋酸、乙醇體積分數分別為1%、2%的水溶液)振蕩1 h后,使用連續流動分析儀對過濾后的上清液進行常規化學成分測定。

1.2.3 揮發性香氣物質測定使用同時蒸餾萃取(SDE)技術處理樣品,并通過GC-MS分析揮發性香氣物質[9]。稱取10 g干燥樣品,以飽和NaCl和二氯甲烷作為提取溶劑。萃取后收集萃取液并濃縮至2 mL,再加入50 μL乙酸苯乙酯(1.202 8 mg/mL)作為內標。

1.2.4 煙葉表面微生物收集緩沖液配制:100 mmol/L Tris-HCl,50 mmol/L EDTA-Na2,20 g/L PVP,1 mL/L Tween-20,1.4 mol/L NaCl,pH值為8。取30 g煙葉樣品剪切成段,置于300 mL緩沖液中,超聲30 min,棄去煙葉,將液體于4 ℃、6000 r/min條件下離心10 min后,倒掉上清液,再將1 mL緩沖液加入離心管中,沉淀重懸后,繼續離心并棄去上清液,重復洗滌直至上清液幾乎無色,收集微生物細胞(沉淀量在200 mg以上),用液氮速凍0.5 h以上,轉入-80 ℃冰箱中保存備用。

1.2.5DNA提取、文庫構建與宏基因組測序將收集的微生物細胞送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行DNA提取、文庫構建和宏基因組測序,每個樣本均進行3次重復操作。

1.3 數據處理

根據GC-MS數據系統中的NIST參考文庫(NIST 14)鑒定揮發性香氣物質;使用 Excel 2017 軟件做進一步統計分析;發酵前后的微生物類群差異由上海美吉生物醫藥科技有限公司生物信息分析云平臺(https:∥cloud.majorbio.com/)進行處理。利用Statistica 23.0軟件(SPSS Inc.,Chicago, IL, USA)進行差異顯著性分析。

2 結果與討論

2.1 煙葉常規化學成分分析

煙葉主要化學成分包括煙堿、還原糖、總糖、氯、總氮、鉀等,其含量與煙葉吸食品質關系十分密切。糖類化合物的增加,會使煙葉在抽吸時產生令人愉快的、溫和的和不刺鼻的香氣[10]。各煙葉樣品組的常規化學成分及其相對含量見表1。由表1可知,FW組和FB組的還原糖和總糖相對含量相同且較NF組低,說明發酵會降低煙葉的糖含量,且加菌發酵與加水發酵對糖含量無顯著性影響。NF組和FW組煙堿和總氮相對含量較高,FB組煙堿和總氮相對含量較低,且總氮相對含量顯著下降,這可能是因為外源貝萊斯芽孢桿菌H1的加入有助于脫去煙葉含氮化合物的氨基,生成氨氣,而含氮化合物相對含量適中可使煙氣吃味醇和[11-14]。煙堿含量下降可能是因為貝萊斯芽孢桿菌H1具有降解煙堿的能力,還可能是因為外加菌改變了煙葉原始微生物群落組成,使降解煙堿的微生物豐度提高[15-16]。

表1 各煙葉樣品組的常規化學成分及其相對含量Table 1 Main chemical components and its relative content of cigar wrapper leaves %

2.2 煙葉揮發性香氣物質分析

發酵對各煙葉樣品組揮發性香氣物質含量的影響見表2。由表2可知,與NF組相比,發酵組的揮發性香氣物質總含量均顯著升高。FB組新增香紫蘇醇和6-甲基-5-烯-2-酮,其中香紫蘇醇具有龍涎香,香氣持久細膩;另外,香葉基丙酮和巨豆三烯酮含量較其他組明顯提高。香葉基丙酮具有花香、果香,可以增加煙氣濃度;巨豆三烯酮能使煙香豐滿,吸味津甜,且能增加煙葉的花香和清香。外源貝萊斯芽孢桿菌H1的加入可能改變了煙葉原始微生物群落結構,將煙葉中的大分子物質分解成可以改善煙葉評吸品質的揮發性香氣物質,進而改善了煙葉的整體品質。這與L.Yao等[9]的研究結果一致。

表2 發酵對各煙葉樣品組揮發性香氣物質含量的影響Table 2 Effect of fermentation on the content of volatile aroma substances in cigar wrapper leaves μg/g

2.3 煙葉表面微生物群落分析

2.3.1α-多樣性分析α-多樣性反映了單個樣品內細菌群落的豐度和多樣性。各煙葉樣品組的細菌群落α-多樣性見表3。由表3可知,發酵后,NF組和FW組的Chao1指數低于FB組,說明FB組物種豐度最高。所有樣品測序覆蓋率均接近100%,因此該研究所測數據能反映煙葉細菌群落的多樣性。綜上可知,貝萊斯芽孢桿菌H1的加入改變了細菌群落的豐度和多樣性。

表3 雪茄茄衣煙葉各個樣品的細菌群落多樣性Table 3 Bacterial community diversity of cigar wrapper leaves after fermentation

2.3.2β-多樣性分析β-多樣性主要描述樣本間的差異系數,反映不同樣本間的多樣性差異。各煙葉樣品組的細菌群落主成分分析(PCA)如圖1所示,樣品點距離的遠近代表樣品中功能微生物群落的相似度,距離越近,相似度越高。由圖1可知,各煙葉樣品組之間明顯分開,距離較遠,差異明顯,說明不同發酵方式煙葉的細菌群落組成存在明顯差異。

圖1 各煙葉樣品組的細菌群落PCA分析Fig.1 Principal component analysis of cigar bacterial community

2.3.3OTU變化分析基于OTU水平繪制的煙葉表面微生物群落韋恩(Venn)圖可用以描述微生物群落的分布情況。各煙葉樣品組的細菌Venn圖如圖2所示。由圖2可知,煙葉樣品組之間既有共性也有差異,細菌OTU共有數為537個,FB組特有OTU數(為171個)相對較多,而FW組僅有13個OTU,因此從OTU總數和特有數來看,外源貝萊斯芽孢桿菌H1的添加有利于提升煙葉原始細菌群落多樣性。相較FB組,NF組有較多的共有OTU和較少的特有OTU,說明細菌群落結構的動態變化與添加外源菌群密切相關。這與王文婷等[17]的研究結果基本一致。與NF組相比,貝萊斯芽孢桿菌H1的加入有助于增加雪茄煙葉發酵后OTU數量,這與T.T.Liu等[18]的研究結果相似。

圖2 各煙葉樣品組的細菌Venn圖Fig.2 Venn diagram of bacterial in cigar wrapper leaves

2.4 煙葉細菌群落組成及相對豐度分析

外源菌的添加可改變煙草表面微生物群落結構與優勢菌群[19-20]。煙葉在門水平和屬水平上的微生物群落組成如圖3所示。由圖3a)可知,在門水平上,主要檢出兩個門類的細菌。厚壁菌門(Firmicutes)在NF組和FW組占絕對優勢,平均相對豐度分別為93.52%和96.23%;而FB組厚壁菌門的平均相對豐度僅為43.94%。放線菌門(Actinobacteriota)在NF組和FW組中僅占小部分,平均相對豐度分別為1.96%和3.09%,而在FB中為主要優勢菌,平均相對豐度為54.42%。

圖3 煙葉在門水平和屬水平上的微生物群落組成Fig.3 Microbial community composition of cigar wrapper leaves on phylum level

由圖3b)可知,在屬水平上,NF組和FW組的優勢菌屬為葡萄球菌屬,平均相對豐度分別為90.67%和93.24%,其余菌屬相對豐度均不超過1.00%;FB組的優勢菌屬為葡萄球菌屬、閆遜初氏菌屬(Yaniella)、未命名菌屬(unclassified_f__Micrococcaceae)、藤黃微球菌屬(Micrococcus)、腸球菌屬(Enteractinococcus)和海洋芽胞桿菌屬(Oceanobacillus)。

FB組中葡萄球菌屬是發酵后期的主要優勢菌群,其他優勢菌群的豐度則在發酵過程中不斷變化。發酵后期的優勢菌群更為豐富,說明外部菌群的加入改變了原始菌落的結構,并導致發酵結束時與自然發酵菌群結構有所差異。這與L.Yao[21]等的研究結論相似。

不同微生物屬間的相關性網絡如圖4所示,其中節點的大小表示物種豐度大小,連線的顏色表示正負相關性,紅色表示物種之間正相關,綠色表示物種之間負相關。由圖4推測,在其他菌屬豐度提高的同時,葡萄球菌屬的豐度降低,這可能是因為其他菌屬或貝萊斯芽孢桿菌H1與葡萄球菌屬存在負相關性。

圖4 不同微生物屬間的相關性網絡Fig.4 Correlation network analysis among different microbiology

2.5 煙葉微生物代謝功能分析

物種功能貢獻度熱圖及KEGG代謝道路多組比較如圖5所示。由圖5可知,煙葉微生物代謝功能相對貢獻度排在前五位次的代謝途徑有:全局和總覽圖、碳水化合物代謝、氨基酸代謝、輔因子和維生素代謝及膜轉運。與雪茄風味成分形成密切相關的主要代謝活動是碳水化合物代謝[22]和氨基酸代謝[23]。NF組和FW組中葡萄球菌屬對各功能的相對貢獻度較高,而葡萄球菌屬在FB組中對各功能的貢獻度降低。不同處理之間的代謝途徑的豐度有所區別,可能是由特有菌屬在發酵期間的代謝活動不同造成的。

在煙葉發酵過程中,不同微生物群落參與了煙葉化合物的轉化[24]。葡萄球菌屬作為優勢菌屬起著關鍵作用,具有降解蛋白質、生物胺等功能,而含氮化合物的降低可減少吸煙后產生的苦味。閆遜初氏菌屬具有消耗多糖和氨基酸的能力[25]。某些微生物,如芽孢桿菌屬(Bacillus),能參與硝酸鹽呼吸、硝酸鹽還原、氮呼吸等代謝活動[8,26],可消除雪茄煙葉本身的刺激性氣味,促進香氣的形成。

由圖5b)可知,雪茄茄衣煙葉3個樣品組中,排名前五位的差異代謝途徑有:全局和總覽圖、碳水化合物代謝、氨基酸代謝、輔因子和維生素代謝、能量代謝。其中全局和總覽圖、碳水化合物代謝和氨基酸代謝是FB組的主要代謝途徑;而且在氨基酸代謝中,FB組較NF組和FW組代謝活動更強。這可能是由于貝萊斯芽孢桿菌H1的加入,使雪茄煙葉中的群落結構發生改變、氨基酸代謝的相關微生物豐度增加、氨基酸的代謝途徑增強[25]。此外,貝萊斯芽孢桿菌H1具有降解大分子物質的能力[27-28],在適宜的條件下能將煙葉香氣前體物轉化為煙葉香氣物質(如糠醛、糠醇、異戊醛、2-甲基丁醛、吡嗪、吡咯、2-乙?；秽?、3-乙?；拎さ?,進而改善煙葉香氣品質[29]。

2.6 煙葉中微生物群落與常規化學成分、揮發性香氣物質的關聯分析

為探究煙葉表面微生物群落的多樣性與常規化學成分(還原糖、總氮、總糖、煙堿、氯、鉀)及產生的揮發性香氣物質之間的關系,本研究進行了冗余分析(RDA)。微生物群落與煙葉常規化學成分的RDA分析如圖6所示。由圖6可知,第一順序軸和第二順序軸分別解釋了98.98%和0.50%的變異度,還原糖、總氮、煙堿、氯、總糖和鉀受微生物群落的影響較大,除葡萄球菌屬與鉀呈負相關外,其余常規化學成分與葡萄球菌屬均呈正相關。受NF組微生物群落影響最大的常規化學成分為總糖和還原糖,二者在NF組中的相對含量最高(見表1)。受FW組微生物群落影響最大的常規化學成分是煙堿、氯和氮,而受FB組微生物群落影響最大的常規化學成分是鉀,添加外源貝萊斯芽孢桿菌H1發酵后,鉀的相對含量較其他組顯著增加。F.Liu[30]等研究發現,總氮和煙堿最容易受微生物影響,這與本文結果有相似之處。

圖6 微生物群落與煙葉常規化學成分的RDA分析Fig.6 RDA analysis of the main chemical components of cigar wrapper leaves and the microbiology community

微生物群落與煙葉揮發性香氣物質的RDA分析如圖7所示。由圖7可知,第一順序軸和第二順序軸分別解釋了98.79%和0.49%的變異度,苯乙醇的生成與葡萄球菌屬、棒狀桿菌屬、海洋芽胞桿菌屬等有關且對FW組影響最大;香葉基丙酮的生成與藤黃微球菌屬、海洋芽胞桿菌屬和腸球菌屬密切相關并對FB組影響最大,這與表2中香葉基丙酮在FB組中含量最高的結果一致。

圖7 微生物群落與煙葉揮發性香氣物質的RDA分析Fig.7 RDA analysis of main aroma substances of cigar wrapper leaves and microbiology community

雪茄茄衣煙葉的吸食感官不僅與外源微生物的產香有關,同時還受外源微生物與原始微生物之間的相互作用的影響。外源微生物與原始微生物之間相互作用會改變原有微生物的群落結構,導致常規化學成分、揮發性香氣物質含量發生改變,最終影響雪茄茄衣煙葉的品質。本文中,FW組的微生物群落及豐度與NF組相比無顯著變化,而添加貝萊斯芽孢桿菌H1發酵后改變了雪茄茄衣煙葉微生物群落的結構,因此貝萊斯芽孢桿菌H1可能是影響雪茄茄衣煙葉品質的關鍵微生物,對特定細菌群落生態系統組成和代謝功能有重要影響[31]。

3 結論

本文在雪茄茄衣專用煙葉中添加外源貝萊斯芽孢桿菌H1進行發酵,分析了發酵后常規化學成分、揮發性香氣物質及微生物群落結構的變化及相關性,以及相應微生物代謝途徑的變化。結果表明,添加外源貝萊斯芽孢桿菌H1后,煙葉的煙堿和總糖含量呈下降趨勢,揮發性香氣物質種類增多且其含量相較于對照組提高142.26%,新增揮發性香氣物質主要有香紫蘇醇、6-甲基-5-烯-2-酮。宏基因組分析表明,茄衣煙葉發酵過程均由葡萄球菌屬主導,但隨著發酵時間的延長,貝萊斯芽孢桿菌H1發酵后的煙葉優勢菌群有所改變,在門水平上由厚壁菌門轉變為厚壁菌門和放線菌門,在屬水平上由單一的葡萄球菌屬轉變為葡萄球菌屬、閆遜初氏菌屬、未命名菌屬、藤黃微球菌屬、腸球菌屬和海洋芽胞桿菌屬,煙葉微生物多樣性升高。FB組碳水化合物代謝途徑、氨基酸代謝途徑、輔因子和維生素代謝途徑等相對貢獻度較高,由此改變了生物堿、糖類等化學組分的代謝進程,這也是煙葉揮發性香氣物質含量提高的原因之一。RDA分析結果顯示:常規化學成分還原糖、總氮、煙堿、氯、總糖、鉀受煙葉微生物群落的影響較大,苯乙醇的生成與葡萄球菌屬、棒狀桿菌屬、海洋芽胞桿菌屬等有關,香葉基丙酮的生成與藤黃微球菌屬、海洋芽胞桿菌屬和腸球菌屬密切相關。本研究可為雪茄茄衣發酵源功能微生物的篩選及茄衣理化性質的提升提供理論支撐。