白城山新1號楊增殖培養試驗

王 利,張玉玲,包 穎,岳 龍,孫 鵬,王新波

(1.白城市林業科學研究院,吉林 白城 137000; 2.吉林省林業技術推廣站,吉林 長春 130022; 3.舒蘭市林業局,吉林 吉林 132000)

楊樹具有易栽培、好管理、生長快、適應性強等優點,是我國北方地區的主要綠化樹種[1]。但普遍存在觀賞性差、揚粉飛絮等問題,嚴重影響了城鄉綠化美化效果。白城市林業科學研究院經過20多年選育出白城山新楊系列品種(白城山新1號楊Populusdavidiana×P.bolleana‘baichengshanxinyang No.1’、貴妃楊),該品系樹干通直飽滿,樹皮光滑細膩,淡綠色,披白粉;樹冠緊湊,寬窄適中,整潔優美;密枝型,枝葉繁茂翠綠。其最突出的特性是雌株不結實、不飛絮。白城山新楊用于城市綠化可以密植,能夠降低交通噪音污染,但該品系扦插繁殖不易生根,導致常規難繁,一直沒能推向綠化苗木市場。植物組培工廠化育苗技術體系,是以植物細胞、組織、器官等為外植體,采用人工配制的培養基,在無菌及人工控制的條件下進行快速繁殖的一種現代生物技術[2,3]。此項技術能夠采用工業化管理手段,迅速批量生產優質苗木,為實現難生根樹種快繁提供技術支撐。

本試驗對白城山新1號楊增殖培養基配方進行研究,解決了其苗木擴繁難的問題。通過調整對組培苗增殖及生長發育有顯著影響的培養基組分含量、激素種類和質量濃度,使培養基更適合組培苗的生長,達到增殖更快、質量更好的目標。

1 材料與方法

1.1 材料

對白城山新1號楊1年生枝條進行初代培養,將篩選出的初代無菌芽苗作為試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計

采用正交試驗方法,以MS培養基為基礎配方,選擇與組培苗增殖密切相關的細胞分裂素6-芐氨基嘌呤(6-BA)、生長素萘乙酸(NAA)、用大量元素(KNO3、NH4NO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O)配成MS基本培養基配方20倍濃度的母液、優質食用蔗糖,其質量濃度(含量)分別設置5個水平(見表1),按L25(56)正交表進行試驗。

表1 因素水平設計

1.2.2 增殖培養

為更好地控制污染,增殖培養采用傳統組培技術體系。培養瓶采用帶有透氣膜蓋耐高溫塑料廣口瓶,灌裝培養基后經過高壓蒸汽滅菌,在超凈工作臺下無菌接種,密閉培養。

1.2.2.1 培養基配制

按配方將組分分成大量元素、微量元素、有機附加物、鐵鹽、鈣、生長調節劑等部分,將各部分分別配制成母液。大量元素配制成優化配方的20倍母液,微量元素、有機附加物、鐵鹽、鈣分別配制成200倍母液,生長調節劑配制成1 000 mg·L-1母液,低溫儲存備用。配制培養基時分別量取母液加入灌裝料桶,加入蔗糖和固化劑瓊脂粉定容混勻。瓊脂濃度決定培養基的硬度,不同批次的瓊脂粉強度不同,新啟用的瓊脂粉要進行強度試驗。培養基硬度以固定住芽苗不倒為標準,瓊脂粉用量最少為佳。經過高壓蒸汽滅菌的培養基瓊脂粉用量為6～8 g·L-1。

1.2.2.2 培養基分裝

為實現規模分裝,自行研制了培養基灌裝機。灌裝機由料桶、循環泵、微控制器、灌裝平臺和一排灌裝孔組成。由微控制器精準控制循環泵開關,實現精確灌裝,培養基厚度控制在10～12 mm,300 mL廣口塑料培養瓶灌裝30～35 mL培養基。該灌裝機采用冷灌裝工作方式,循環泵通過內循環進行料液攪拌,防止料液在料桶沉淀(主要是瓊脂粉)。灌裝時按照每瓶灌裝量調整灌裝時間,將規格一致的培養瓶在組培專用塑料周轉盤內擺放整齊,每盤6行7列。將塑料盤置于灌裝平臺上,調整周轉盤及灌裝孔使灌裝孔對準第一排培養瓶口中央,打開灌裝控制開關,灌一行推一行,完成一盤后關閉灌裝控制開關,換盤。灌裝后將培養瓶扣蓋,準備滅菌。

1.2.2.3 培養基高壓蒸汽滅菌

滅菌采用600 L功率24 kW臥式高壓蒸汽滅菌鍋,每鍋可放置18盤計750個培養瓶,溫度121 ℃,時間25～30 min。

1.2.2.4 接種

接種工作要求無菌操作,在超凈工作臺下進行。接種前芽苗培養瓶必須嚴格檢查,有雜菌污染的一律淘汰。采用增殖培養和生根培養同時接種的方法進行接種,符合生根標準的健壯芽苗接種在生根培養基上進行生根培養,剩余的芽苗轉接到增殖培養基上進行增殖培養。300 mL增殖培養瓶接種芽苗7～8棵。750 mL生根培養盒接種30棵芽苗。接種后移入培養架進行培養。

選擇健壯芽苗(苗高大于2 cm,苗徑較粗壯,葉子發育正常)接入生根培養基進行生根培養,平均培養14 d,根系即發育完成,達到出瓶煉苗的標準。

1.2.2.5 培養室培養條件控制

培養室是組培苗生長發育的場所,環境條件影響組培苗生長速度和質量。培養室溫度控制在不高于25 ℃。培養架采用LED燈帶補光,每排培養架配置1臺功率400 W直流電源為燈帶供電,定時開關控制電源,每日04:00—20:00補光16 h。每個培養室配置1臺臭氧機進行日常滅菌,時控開關控制臭氧機啟停,每日21:00—02:00設定開機40 min、停機20 min進行間歇滅菌。

1.3 數據分析

采用Minitab 17軟件進行分析。

2 結果與分析

經過32 d的培養,第11個處理中的33瓶培養基有27瓶芽苗滿瓶覆蓋度接近100 %。試驗結果見表2。

表2 試驗結果

應用Minitab 17分析軟件對數據進行方差分析和回歸處理,結果見表3?？梢钥闯?P值均小于0.05,選定的各因素對結果均有顯著影響。

表3 方差分析

得出回歸方程如下:

結果平均值=2.290 7-0.109 6-BA＿0.20+0.065 6-BA＿0.25+0.260 6-BA＿0.30-0.066 6-BA＿0.35-0.150 6-BA＿0.40+0.377 NAA＿0.05-0.287 NAA＿0.08-0.510 NAA＿0.11+0.049 NAA＿0.14+0.371 NAA＿0.17-0.702 6-BA×NAA＿1+0.810 6-BA×NAA＿2+0.467 6-BA×NAA＿3-0.331 6-BA×NAA＿4-0.244 6-BA×NAA＿5-0.096 大量元素＿12.50-0.976 大量元素＿25.00-0.235 大量元素＿37.50+0.314 大量元素＿50.00+0.993 大量元素＿62.50-0.298 蔗糖＿12.00+0.299 蔗糖＿16.00+0.399 蔗糖＿20.00+0.382 蔗糖＿24.00-0.783 蔗糖＿28.00。

回歸方程提供了每因素各水平對結果平均值的貢獻值,選擇各因素系數最大的水平值(6-BA＿0.30、NAA＿0.05、大量元素＿50.00、蔗糖＿20.00)組成新配方進行實際培養驗證,通過2代培養,此配方芽苗增殖倍數均超過3.2。

3 結論

白城山新1號楊以其優良的綠化性狀和廣泛的生態適應性,尤其是雌株不飛絮、不揚粉的環保性狀,必將成為我國北方地區廣受歡迎的優良城鄉綠化樹種。組培化育苗有效解決了白城山新1號楊扦插不易生根和苗木繁育問題,提高了苗木的擴繁效率,可促進該樹種的大面積推廣。經試驗,最終確定MS+6-BA 0.30 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1+蔗糖20.00 g·L-1為白城山新1號楊組培增殖培養基優化配方。