小麥Glu-1D位點HMW-GS近等基因系創制及對品質的影響

蔣 云，張連全，郝 明，范超蘭，甯順腙，姜 博，楊苗苗，張 潔，呂季娟，劉登才*

（1.四川省農業科學院生物技術核技術研究所，成都 610061；2.四川農業大學小麥研究所，成都 611130；3.四川省種子站，成都 610041）

小麥胚乳中含有的貯藏蛋白賦予了小麥面團彈性和延伸性，因而極大地豐富了小麥加工終產品的多樣性。谷蛋白是小麥貯藏蛋白的主要組成部分之一，根據十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），可將谷蛋白分為高分子量麥谷蛋白亞基（HMW-GS）和低分子量麥谷蛋白亞基（LMW-GS）。其中，編碼小麥HMW-GS 的基因位于小麥染色體1A、1B 和1D 長臂的Glu-1的位點上，分別被稱為Glu-1A、Glu-1B和Glu-1D位點。每個位點由2個緊密連鎖的基因組成，分別編碼一個分子量較大的x型亞基和一個分子量較小的y型亞基。大量研究證實，HMW-GS 的組成和數量對谷蛋白聚合體的數量和質量有重要作用，與小麥面團加工品質關系密切[1-2]。

研究表明，Glu-1D對加工品質的影響效應大于Glu-1A和Glu-1B。Glu-1D的等位基因中最重要的是5+10 和2+12[3]，雖然針對5+10 和2+12 品質效應的評價較多，但大多數研究以分離群體、自然群體或姊妹系為材料，遺傳背景的差異影響了結果準確性。而近等基因系排除了遺傳背景對加工品質的干擾，能夠更加準確地評價單個HMW-GS亞基或亞基組合對面團品質參數和終端產品品質的影響。利用HMW-GS 近等基因系，國內外學者對5+10 和2+12 的品質效應開展了一系列研究。上述研究表明，大多數情況下5+10 和2+12 亞基對籽粒蛋白質含量[4-16]、Zel 沉降值[10-13]及面團形成時間[7,10-11]的影響不明顯，5+10 對谷蛋白大聚體的合成[4-6,17]、面團穩定時間[8-7,14-15,18]、拉伸面積[10-11,14-15]、最大拉伸阻力[7,10-11,14-16]及面包評分[7,10-14]有正向影響，對終端產品品質的研究主要集中于面包烘焙品質，饅頭、面條研究比較缺乏[19-20]，而餃子、餅干未見相關報道。

目前，四川優質小麥品種缺乏，發掘優良育種基因仍是四川小麥品質育種的重要基礎工作[21-22]。但目前尚不清楚在四川寡日照、多陰雨等特殊生態條件下，5+10 和2+12 亞基在小麥品質育種上的利用價值。本研究創制了HMW-GS 近等基因系蜀麥1764A 和蜀麥1764B，其Glu-A1和Glu-B1位點亞基類型為1和20，Glu-D1位點分別為5+10和2+12，代表了四川省絕大多數小麥品種（系）Glu-D1位點的類型[3]。進一步，評價了二者在四川省多點試驗和區域試驗中的綜合農藝性狀、產量、品質參數和終產品品質，為四川寡日照生態條件下小麥加工品質改良提供了參考。

1 材料和方法

1.1 研究材料

新品系蜀麥1764 來自雜交組合Syn-SAU-43/030080//N07-361/3/川麥42（圖1），其中Syn-SAU-43 為人工合成六倍體小麥，其他為四川小麥品種（系）。Syn-SAU-43 來自于栽培二粒小麥PI113961與節節麥AS2404 遠緣雜種的染色體自動加倍[23]。中國春（chinese spring，CS）用作高分子量谷蛋白亞基分析的對照材料。

圖1 蜀麥1764選育過程Figure 1 Breeding process of Shumai 1764

1.2 研究方法

1.2.1 SDS-PAGE檢測

利用SDS-PAGE 在蜀麥1764（F7代）的混收種子中檢測HMW-GS 剩余變異。SDS-PAGE 檢測參考鄭柯等[24]的方法。

1.2.2 SNP芯片檢測

55K SNP 芯片檢測委托中玉金標記(北京)生物技術股份有限公司進行，數據處理參考Hao M.等[25]的方法，用Microsoft Excel 365 和Python 3.9 軟件進行數據處理，用R 3.0.4軟件作圖。

1.2.3 農藝及品質性狀調查

2018—2019年度，近等基因系蜀麥1764A 和1764B 在四川省5 個試驗點進行多點品比試驗（綿陽、郫都區、廣漢、內江、射洪）；2019—2020年度，二者參加了四川省小麥區域試驗，共8 個試點（綿陽、新都、內江、射洪、南充、廣元、雙流、樂山），2年共13點次。各試點的試驗設計、田間管理和調查規范按照四川省區域試驗要求進行。隨機區組設計，3次重復，小區面積13.34 m2。調查的農藝性狀包括產量、全生育期、單株分蘗數、單株有效穗、株高、有效穗、千粒重、穗粒數和粒質。單株分蘗數=最高苗/基本苗，單株有效穗=有效穗/基本苗。

品質性狀測試，從各個試點的3 次重復中取等量籽粒，分別形成蜀麥1764A和蜀麥1764B的混樣，委托農業農村部谷物及制品質量監督檢驗測試中心（哈爾濱）進行測試。測試指標及測試方法，包括容重（GB/T 5498-2013）、出粉率（NY/T1094.1-2006）、粗蛋白（干基）（NY/T 3-1982）、降落數值（GB/T 10361-2008）、濕面筋（14% 水分）（GB/T 5506.2-2008）、沉淀指數（GB/T 2119-2007）、粉質儀指標（吸水量、面團形成時間、面團穩定時間、弱化度、粉質質量指數、評價值GB/T14614-2019）、拉伸儀指標（最大拉伸阻力、延伸性、能量、R/E比值 GB/T14615-2019）、硬度（GB/T 21304-2007）、面包（GB/T14611-2008）、餃子（LS/T3203-1993）、面條（GB/T17320-2013）、饅頭（GB/T17320-2013）、酥性餅干（LS/T3206-1993）總評分及分項評分。計算蜀麥1764A高于或低于1764B的百分比。

數據處理和統計分析用Microsoft Excel 365 和DPS 7.55完成。

2 結果與分析

2.1 近等基因系創制與鑒定

2016年秋播前，隨機選取蜀麥1764 的F7代種子，通過SDS-PAGE 進行HMW-GS 檢測，發現由3 種HMW-GS 亞基組成，分別為A 型（1、20、5+10）、B 型（1、20、2+12）和H 型，H 型為A 型和B 型的雜合（1、20、2+12/5+10）。在分析的384 粒種子中，篩選出雜合種子共3粒，雜合種子的頻率為0.86%。3種類型的單株收獲后，分別隨機檢測90 粒種子，發現A、B兩種類型的HMW-GS組成不分離。但是，H型仍能分離出A 型、B 型和H 型（圖2），將分離出的A 型和B 型植株分別擴繁成系，命名為蜀麥1764A（含5+10亞基）和蜀麥1764B（含2+12亞基）。

圖2 蜀麥1764 Glu-D1位點雜合型單株后代HMW-GS分離情況Figure 2 HMW-GS isolation from a heterozygous single plant at Glu-D1 locus of Shumai 1764

SNP 數據用于近等基因系蜀麥1764A 和蜀麥1764B的遺傳背景分析。結果表明，99.82%（37878/37947）的標記在蜀麥1764A和1764B間的分型結果一致，說明二者遺傳背景高度一致。分型結果不一致的69 個位點中，有58 個位點集中于1D 染色體403-414 MB 區間（圖3），表明二者的差異主要在該區間。根據中國春參考基因組序列IWGSC_Ref-Seq_v1注釋，Glu-1D位點位于1D染色體412-413 MB之間。由此從遺傳上證明了蜀麥1764A 和蜀麥1764B為Glu-1D位點有差異的近等基因系。

圖3 蜀麥1764A和1764B基因組差異對比Figure 3 The genomic differences between Shumai 1764A and 1764B

農藝性狀和產量方面。2018—2019年度的多點品比試驗和2019—2020年度的四川省區域試驗中，二者在所有農藝性狀及產量上無顯著差異（圖4，表1）。這表明，源自1D 染色體的403～414 MB 區間差異，對農藝性狀和產量影響小。從四川省小麥區域試驗資料可知，近等基因系蜀麥1764A和蜀麥1764B綜合性狀表現優良，比區域試驗對照品種綿麥367分別增產2.2%和1.9%，千粒重分別增加了15.5%和17.5%，有效穗分別增加了26.2%和7.4%，但穗粒數比對照分別降低了13.1%和16.6%，二者均屬穗數型品系。

表1 蜀麥1764A和1764B 2年多點農藝性狀統計分析Table 1 Statistical analysis of the agronomic traits of Shumai 1764A and B in two-year multi-point experiment

圖4 蜀麥1764A(左)和蜀麥1764B(右)單株Figure 4 Single plants of Shumai 1764A (left) and Shumai 1764B (right)

2.2 品質性狀分析

農業農村部谷物及制品質量監督檢驗測試中心（哈爾濱）測試結果表明，有的參數在年度之間變動很大，有的參數年度間表現一致穩定（表2）。相比蜀麥1764B，蜀麥1764A 2年均表現較高的品質參數有容重、出粉率、穩定時間、粉質質量指數、最大拉伸阻力（Rm,135）、能量、R/E比值(拉伸比)和硬度。其中，有5個參數的差異十分明顯，差異大小依次為：①R/E比值(拉伸比)，蜀麥1764A 比1764B 兩年平均高139.3%；② 最大拉伸阻力（Rm,135），蜀麥1764A 比1764B 高123.0%；③ 面團穩定時間，蜀麥1764A 比1764B 長103.5%；④ 能量，蜀麥1764A 比1764B 高97.88%；⑤ 粉質質量指數，蜀麥1764A 比1764B 長45.9%。連續2年蜀麥1764A均比蜀麥1764B降低的參數有粗蛋白、吸水量、弱化度和延伸性（E,135）。其中，弱化度的降低最大，其次為延伸性。

表2 蜀麥1764A和1764B 2年試驗品質參數比較Table 2 Comparison of quality parameters between Shumai 1764A and B in two-years

終產品品質上，2年資料均表明蜀麥1764A 比蜀麥1764B 有更高的面包總評分和饅頭總評分，但面條總評分較低（表3）。餃子和餅干總評分在年度間高低不一致。進一步分析單項評分發現，對于面包，蜀麥1764A的面包體積2年均比蜀麥1764B高，而其余單項年度間高低不一致。對于饅頭，比容、高度、表面色澤、表面結構、表面形狀、芯結構和黏性的2年平均數均是1764A 更高，而重量和體積則是1764B更高，彈性、韌性和口感二者一致。對于面條，1764B 的色澤、黏彈性比1764A 更出色，而表觀狀態、硬度則1764A 較高，光滑性和食味二者均表現一致。

表3 蜀麥1764A和1764B加工產品評分Table 3 Total and itemized score of end-use products of Shumai 1764A and B

3 討論

HMW-GS近等基因系的培育方法上，目前報道的多是回交法獲得[12-15]。該方法通過輪回親本和供體親本雜交、回交，后代通過分子標記或SDS-PAGE檢測，從而創制基于輪回親本遺傳背景的HMW-GS近等基因系。該方法創制的近等基因系，其綜合農藝性狀類似于輪回親本。本研究則利用高世代株系的剩余雜合體篩選創制HMW-GS近等基因系，從F7代品系中篩查剩余雜合變異，獲得了HMW-GS近等基因系蜀麥1764A 和1764B。這2 個系主要的遺傳差異在于包含HMW-GS 位點的1D 染色體403～414 MB 區間。2年田間農藝性狀分析未發現二者有顯著差異，因此盡可能地排除了遺傳背景對品質分析帶來的影響。對于易受環境和遺傳背景影響的復雜性狀和數量性狀，這樣的近等基因系是遺傳研究的理想材料[26-28]。在作物遺傳育種實踐中，可以通過篩查剩余雜合體的方法創制不同的近等基因系，將特色品種選育和遺傳研究緊密結合起來。

由于歐美小麥的終產品以面包為主，因此西方學者對HMW-GS 的評價主要是針對面包的烘烤品質，并據此提出了HMW-GS 的優質亞基和劣質亞基[8-10]。大多數報道認為5+10亞基的面包加工品質優于2+12[8-11,14-18]，但也有少數研究發現某些遺傳背景下二者差異不顯著[14-17,19]或2+12 更優[18]。本研究發現亞基5+10 的面包體積和總評分均大于2+12，和國內外多數學者研究結果一致。本研究表明5+10 亞基在四川“陰雨多、寡日照”特殊氣候條件下，仍然對面包加工品質有促進作用。從具體參數看，HMW-GS 對面團品質的差異主要體現在面筋強度上。與2+12相比，5+10亞基的R/E比值(拉伸比)、最大拉伸阻力（Rm，135）分別增加了139.3%、123.0%（表2），表明具有5+10亞基的面團彈性好、韌性大、筋力強，發酵時面團膨脹會受阻，面團更堅硬不易形變。這與面團穩定時間表現一致，5+10亞基的穩定時間較2+12 延長約1 倍，說明面團穩定性好，反映5+10對剪切力降解有較強的抵抗力，也就意味著其麥谷蛋白的二硫鍵更牢固，面粉筋力越強。能量方面，5+10 比2+12 亞基高約1 倍，表示拉伸過程中所做的功越多，面筋筋力越強。有研究表明，5亞基比2 亞基多一個半胱氨酸，可增加面團中二硫鍵數量，對蛋白質2級結構影響顯著，能增強亞基間交聯度，有利于谷蛋白大聚合體（glutenin macropolymer，GMP)聚合以形成更為致密的面筋網絡，從而改善了面團品質[29]。

我國傳統蒸煮食品的加工品質與蛋白質含量和質量、淀粉品質和磨粉品質等均有關聯[30]。在我國傳統食品加工品質上，對HMW-GS的優劣評價不能簡單借用面包標準，須專門研究HMW-GS對中國傳統小麥食品品質的影響，為專用型小麥品種的選育和應用提供依據。金慧等[21]研究表明，5+10/2+12亞基的差異僅體現在饅頭表面色澤上；鄧志英等[31]認為，饅頭品質對HMW-GS 的類型要求不嚴格，主要受單個HMW-GS表達量的影響。本研究發現5+10比2+12亞基的饅頭評分有少量增加。但對于面條，本研究發現2+12 亞基組合的評分高于5+10 組合。方正武等[32]研究發現5+10 亞基顯著提高了面條質構參數中的硬度，但一些背景下5+10亞基會使面條偏硬，其效果不如2+12 亞基。在四川盆地，面條小麥可優先考慮2+12 亞基組合。具體到品質參數，2年間2+12 比5+10 的延伸性(E，135)更大，說明在發酵過程中面團的面筋網絡形成狀態好、不易破裂。前人認為5+10亞基與2+12亞基對延伸性和拉伸阻力的影響存在負相關[33-34]，在本研究中2+12 的延伸性更好，而5+10 的拉伸阻力更大，印證了前人的結果。本研究發現餃子和餅干總評分在年度間高低不一致，無法評估5+10和2+12亞基對這2種加工產品的影響。

4 結論

在小麥高代育種群體中篩選剩余雜合體，創制了HMW-GS 的5+10/2+12 近等基因系。在四川生態條件下，5+10/2+12 亞基對小麥籽粒蛋白質含量沒有顯著影響，但是前者提高了面筋強度、降低了延伸性。對于面包、饅頭品質，5+10 亞基優于2+12亞基，但對于面條品質，2+12 亞基優于5+10 亞基。5+10/2+12 亞基可能不影響餃子和餅干的加工品質。