靈武長棗葉阿拉伯半乳糖蛋白分布及光合特性

陶珊珊， 章英才， 王 靜

（寧夏大學 生命科學學院，寧夏 銀川 750021）

阿拉伯半乳糖蛋白（AGPs）為廣泛分布于植物各器官細胞中的糖蛋白，由阿拉伯糖和半乳糖構成多糖支鏈和蛋白質核心鏈組成結構復雜的大分子[1-3]。作為植物細胞壁的一種結構蛋白，AGPs 與植物適應逆境有關[4]。葉是植物對環境變化比較敏感且可塑性較大的器官，葉的AGPs 分布性狀直接影響到葉的功能。研究表明，棗葉中有豐富的黃酮類[5-6]、三萜類[7]、糖類和皂苷等[8]，不同發育時期靈武長棗（Ziziphus jujubaMill ‘Lingwuchangzao’）葉營養成分含量與果實營養成分和果實品質間存在明顯的相關性[8]；AGPs 參與了靈武長棗果實維管束發育過程的形態建成、細胞分裂和體積增大，并為果實發育提供營養支持及保護[2，9]，因此葉的AGPs 分布與葉的干旱適應特征相關，并有可能對果實品質的形成發揮重要的影響。采用分子生物學等技術對植物細胞中AGPs 糖蛋白的研究表明，AGPs 在生殖發育過程，包括花粉發育、花粉管生長、自交不親和、大孢子母細胞形成，果實的成熟和衰老過程[9-11]，以及根和莖等營養器官的發生與發育等方面起著重要作用[2，12]。研究表明，寧夏枸杞多糖及果實的細胞壁多糖是阿拉伯半乳聚糖AGPs 糖蛋白，是枸杞子中具有免疫調節功能的藥用有效成分[10-11]；番茄LeAGP-1基因過量表達的植株株高減少、分枝增多、種子數量減少、果實減小，表明此AGPs 參與了營養生長和生殖發育[13]；過量表達黃瓜（Cucumis sativus）CsAGP1 基因的煙草植株株高增加，說明AGPs 促進了莖的生長[14]；擬南芥AtAGP30 對種子萌發和根的發育起重要的調控作用[15]，AtFLA1 促進根的發育和細胞分化[16]，AtFLA11、AtFLA12參與次生細胞壁的發育[17-19]，與木質素形成基因同源的AtXYP1、AtXYP2與維管束的發育密切相關[20]，AtAGP31 參與維管束的發育與逆境應答[21-22]，AtAGP19基因在細胞分裂與生長、葉的發育以及生殖發育過程中起著重要作用[23]?；贏GPs 相關基因的表達模式證實了多種類型的AGPs 基因在不同組織部位的特異性表達，在植物營養器官和繁殖器官發育中起非常重要的作用，因此探明AGPs 在不同組織部位分布的特征尤其重要[2-3]。AGPs 存在于植物各器官中，利用AGPs的特異性抗體進行識別，是研究不同植物中不同部位AGPs 分布與特性的重要手段，已在枸杞果實AGPs 免疫定位[9-11]，低溫引起雛菊（Bellis perennis）胚珠和花藥發育過程中AGPs 分布的變化[4]，利用AGPs 單克隆抗體JIM8、JIM13、MAC207、LM2 對擬南芥有性生殖過程中AGPs 進行定位的研究中取得了成果[2-3，24]。在營養器官方面，JIM4 識別的AGPs 與胡蘿卜根早期維管組織的發育有關，JIM14 識別的AGPs 與根次生加厚的篩管有關[25]，JIM13 識別的AGPs 定位在幼嫩的木質部和根冠[26]，LM2、LM14 識別的AGPs 定位在野生型大麥根毛的細胞壁和細胞質中[27]。由此說明，不同的單克隆抗體識別的AGPs 在根組織發育中有著特定的分布，但目前對葉發育中AGPs 分布的研究較少。通過針對性抗體對AGPs 進行定位的免疫學方法具有較高的特異性，因此成為研究不同植物中不同部位AGPs分布的較好的研究途徑[2-3]。靈武長棗是鼠李科棗屬的鮮食棗品種，原產于寧夏靈武市，耐干旱和鹽堿環境，果實具有優良的藥用品質和食用品質。近年來，對靈武長棗果實的研究取得了豐富的成果[2-3，9]，而有關靈武長棗葉的AGPs 糖蛋白分布及其干旱適應特征以及對果實品質的影響尚不明了。本試驗以不同發育時期靈武長棗葉為材料，應用免疫熒光定位技術，較系統地研究不同時期葉的AGPs糖蛋白分布、光合特性及其干旱適應特征，旨在為進一步研究葉AGPs 在靈武長棗生長發育及果實品質方面的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料采自寧夏靈武市寧夏紅棗工程技術研究中心試驗基地6年生靈武長棗樹。試驗采用隨機設計，設3 次重復，每次重復選擇生長發育良好、樹勢適中、長勢相近、栽培管理水平一致的5～10 株植株[2-3，9]，使用3種不同顏色的毛線于6月10日標記同一天開放的花朵，每個重復標記花朵3 000 朵，分別在謝花后30、60、90、110 d，即分別在果實膨大前期（7 月10 日）、快速膨大期（8 月9 日）、著色期（9 月8日）、完熟期（9月28日）取樣，共取樣4次。每次取樣均在09：00—11：00進行。在試驗植株樹冠的東、西、南、北4個方位及上、中、下、里、外各個方向選擇棗吊中部果柄附近的葉[2-3，9]。同時測定光合速率及可溶性糖含量等指標。

AGPs 單克隆抗體JIM8 購自美國喬治亞大學，堿性磷酸酶標記的山羊抗小鼠IgG 二抗購自Sigma-Aldrich公司[3，9]。

1.2 試驗方法

參照Bao等[11]、王瑩瑩[28]的方法，略有改動。

1.2.1石蠟切片的制作 選取各個不同發育時期的葉，用鋒利的刀片將葉片分割成含有3 條主脈的約長0.6 cm×寬1 cm 的小片，立即放入含有φ（甲醛）=3.7%的2F4 固定液中，蓋緊瓶蓋后用注射器抽氣至樣品下沉瓶底，室溫固定4 h。更換固定液3次，每次30 min。用PBS 磷酸緩沖液（10 mmol/L，pH=7.0）清洗3 次，每次15 min。樣品在4 ℃下用φ=0.05% Toluidine blue 染色15 min，在4 ℃下依次在φ=30%、50%、70%、90%的乙醇梯度下脫水，每次60 min，φ（乙醇）=100%脫水3～4 次，60 min/次。在37 ℃恒溫箱中將樣品用φ（乙醇）∶φ（Steedman’s wax）=1∶1滲透過夜，次日更換φ（乙醇）∶φ（Steedman’s wax）=1∶3 在37 ℃下滲透2.5 h，再用純Steedman’s wax 在37 ℃下滲透3 次，每次2 h。將樣品用純Steedman’s wax 在牛皮紙盒中包埋，凝固即可。后期蠟塊的固著、整修、切片、貼片和展片等步驟參考王靜等[2-3，9]的方法。

1.2.2糖蛋白免疫熒光定位 切片脫蠟、復水、PBS淋洗浸泡、封閉液處理等參考王靜等[2-3，9]的方法。用PBS（φBSA=1%）以1∶100 比例稀釋后的AGPs 單克隆抗體JIM8，4 ℃下孵育過夜，次日用PBS淋洗浸泡3 次，每次10 min，以去除多余抗體，再用PBS（φBSA=1%）以1∶300 比例稀釋后的堿性磷酸酶標記的山羊抗小鼠IgG 二抗在36 ℃、黑暗條件下孵育1 h。標記后，用PBS 淋洗浸泡除去未標記的二抗，φ=0.01%Toluidine blue染色去除植物本身的自發熒光，經PBS淋洗浸泡后封片[2-3，9]。在Leica STELLARIS 5 激光共聚焦顯微鏡下觀察切片并拍照。

1.2.3葉光合速率等指標的測定 利用CIRAS-1型光合測定儀測定果柄附近葉片的凈光合速率（Pn，μmol·m-2·s-1）、蒸騰速率（Tr，mmol·m-2·s-1）、氣孔導度（Gs，mmol·m-2·s-1）、胞間CO2濃度（Ci，μmol·mol-1）等光合參數。葉片光合色素葉綠素質量比按常規方法進行測定。

1.2.4可溶性糖的提取和質量比測定 參考鄭國琦等[29]的方法，分別稱取不同發育時期的多個葉片在45 ℃烘干粉碎后的混合樣品，加提取液（V乙醇∶V氯仿∶V水=12∶5∶3），再勻漿3～5 min，5 000 g 離心15 min，取上清液，重復3 次。合并提取液，轉入分液漏斗，加水使之分層，5 000 g 離心10 min 去除氯仿層，用c（NaOH）=0.1 mol·L-1調pH 至7.0，在45 ℃真空中干燥，用蒸餾水定容。使用高效液相色譜儀（LC-20AT）測定葡萄糖、果糖和蔗糖的質量比，色譜條件：流動相（V乙腈∶V重蒸水=85∶15），流速1.0 mL·min-1，氨基柱，柱溫30 ℃，RID-10A 示差檢測器，LC solution數據處理系統。

利用SPSS 22.0 和Excel 2010 軟件進行數據統計處理。

2 結果與分析

2.1 花后30 d葉AGPs的分布特征

1）表皮。葉上表皮細胞較大，近長方形，下表皮細胞較小，方形，垂直于葉片方向的細胞壁較薄，抗體所識別的抗原熒光AGPs 分布較少，而表皮細胞外切向壁較厚，抗體所識別的抗原熒光AGPs 分布較多，形成了較厚的角質層；氣孔僅分布于下表皮，保衛細胞中分布著少量AGPs（圖1A—圖1D）。

圖1 花后30 d葉AGPs免疫熒光分布

2）葉肉?？拷媳砥さ娜~肉組織由3層垂直于上表皮的長柱狀柵欄組織細胞組成，排列很緊密；近下表皮的葉肉組織由3～4層短柱狀的柵欄組織細胞組成，排列也較緊密，為典型的等面葉，具有較典型的旱生結構特征，柵欄組織細胞壁和細胞內部均密集分布著抗體所識別的抗原熒光AGPs（圖1A—圖1D）。

3）葉脈。葉具有3 條發達的主脈，主脈維管束木質部導管和薄壁組織細胞的細胞壁上密集分布著大量抗體所識別的抗原熒光AGPs，在近形成層的木質部中AGPs 尤其豐富（圖1A—圖1B）；形成層和韌皮部排列緊密的細胞壁和細胞內部均密集分布著抗體所識別的抗原熒光AGPs。維管束外由一圈卵圓形的分泌細胞形成維管束鞘，細胞中基本沒有抗原熒光AGPs分布（圖1A—圖1B）。

主脈處的表皮之下為多層厚角組織，細胞壁分布著較多抗體所識別的抗原熒光AGPs，厚角組織內部圓形或卵圓形較大的薄壁細胞壁上也分布著較多抗體所識別的抗原熒光AGPs，其中分布有數個分泌道，內部沒有AGPs熒光分布（圖1A—圖1B）。

葉肉中分布著橫切或縱切比較小的結構簡單的側脈和細脈。外面是一圈含分泌物的薄壁細胞組成的維管束鞘，細胞中沒有抗原熒光AGPs 分布，內部木質部和韌皮部細胞的細胞壁和細胞內部均密集分布著抗體所識別的抗原熒光AGPs（圖1C—圖1D）?？梢?，葉肉是葉AGPs分布的主要部位。

2.2 花后60 d葉AGPs的分布特征

1）表皮。表皮細胞外切向壁較厚，抗體所識別的抗原熒光AGPs 分布較多，形成較厚的角質層；垂直于葉片方向的表皮細胞壁較薄，抗體所識別的抗原熒光AGPs 分布較少，氣孔保衛細胞中分布著少量AGPs（圖2A—圖2D）。

圖2 花后60 d葉AGPs免疫熒光分布

2）葉肉。葉肉柵欄組織細胞的細胞壁和細胞內部均密集分布著抗體所識別的抗原熒光AGPs，AGPs分布特征與花后30 d的葉相似，葉肉柵欄組織是葉AGPs分布的主要部位（圖2A—圖2D）。

3）葉脈。主脈維管束在木質部導管和薄壁組織細胞的細胞壁上分布著大量抗體所識別的抗原熒光AGPs，形成層、韌皮部細胞壁和細胞內部分布著較多抗體所識別的抗原熒光AGPs；與花后30 d的葉相似，維管束外由分泌細胞形成的維管束鞘細胞中基本沒有抗原熒光AGPs分布（圖2A）。

主脈的上下表皮之內的厚角組織細胞壁和細胞內部，以及緊鄰其內的圓形或卵圓形較大薄壁細胞的細胞壁和細胞內部均分布著抗體所識別的抗原熒光AGPs，但相比花后30 d 的葉略有減少（圖2A）；上下表皮厚角組織內部薄壁細胞中分布的分泌道中均沒有AGPs熒光（圖2A）。

與花后30 d 的葉相似，葉肉中間部位分布的結構簡單的側脈和細脈，外面含分泌物的維管束鞘薄壁細胞中沒有抗原熒光AGPs，內部木質部和韌皮部細胞的細胞壁和細胞內部均密集分布著抗體所識別的抗原熒光AGPs（圖2B—圖2D）。

2.3 花后90 d葉AGPs的分布特征

1）表皮?；ê?0 d 葉上、下表皮細胞壁上抗體所識別的抗原熒光AGPs 分布情況與花后60 d 葉相似，表皮細胞外切向壁較厚，抗體所識別的抗原熒光AGPs 分布較多，形成了較厚的角質層（圖3A—圖3D）。

圖3 花后90 d葉AGPs免疫熒光分布

2）葉肉。與之前時期的葉略有不同，花后90 d葉的葉肉組織細胞排列更加密集，甚至鄰近下表皮處的柵欄組織細胞排列也非常緊密，而且葉肉柵欄組織細胞的細胞壁和細胞內部均密集分布著大量抗體所識別的抗原熒光AGPs（圖3A—圖3D）。

3）葉脈。主脈AGPs 的分布特征與之前時期的葉相似，側脈和細脈維管束木質部和韌皮部細胞的細胞壁和細胞內部均密集分布著抗體所識別的抗原熒光AGPs（圖3A—圖3D）；維管束外的維管束鞘細胞中基本沒有抗原熒光AGPs 分布（圖3A—圖3D）。

2.4 花后110 d葉AGPs的分布特征

1）表皮?；ê?10 d 葉上、下表皮細胞壁上抗體所識別的抗原熒光AGPs 的分布情況與之前時期的葉相似，表皮細胞外切向壁抗體所識別的抗原熒光AGPs 分布較多，形成了較厚的角質層（圖4A—圖4D）。

圖4 花后110 d葉AGPs免疫熒光分布

2）葉肉?；ê?10 d 葉肉柵欄組織細胞與花后90 d 的葉相比排列更加緊密，柵欄組織細胞的細胞壁和細胞內部均密集分布著大量抗體所識別的抗原熒光AGPs（圖4A—圖4D）。

3）葉脈。與花后90 d 的葉相似，主脈維管束木質部導管和薄壁組織細胞的細胞壁上密集分布著大量抗體所識別的抗原熒光AGPs，而韌皮部細胞壁和細胞內部分布著較多抗體所識別的抗原熒光AGPs（圖4A）。主脈厚角組織、薄壁細胞及分泌道AGPs 分布特征與花后90 d 的葉相似（圖4A）。側脈和細脈維管束木質部和韌皮部細胞的細胞壁和細胞內部均密集分布著抗體所識別的抗原熒光AGPs（圖4B—圖4D）。各葉脈維管束鞘細胞中均沒有抗原熒光AGPs分布（圖4A—圖4D）。

2.5 不同發育時期葉的光合特性及可溶性糖質量比的變化

1）葉的凈光合速率基本呈高低交替的變化趨勢，花后30 d處于較高水平，之后有所下降，花后90 d達到最高水平，再次呈現峰值，至花后110 d 有一定下降，果實發育成熟（圖5A）。

圖5 不同發育時期葉光合特性及可溶性糖質量比的變化

2）葉的蒸騰速率在花后30 d 處于相對較低的水平，在花后60 d 達到最高值，花后90～110 d 逐漸降低，這與氣溫的變化規律相適應（圖5B）。

3）葉的氣孔導度呈現高低交替的變化特征，與凈光合速率的變化趨勢相似，但氣孔導度在花后30 d處于最高水平，在花后90 d再次出現峰值（圖5C）。

4）葉的胞間CO2濃度在花后30 d 相對較高，花后60 d 降至最低，而后升高，至花后110 d 出現峰值，這與蒸騰速率的變化趨勢相反（圖5D）。

5）葉中葉綠素質量比始終處于較高水平，在花后30～90 d，葉綠素質量比逐漸上升到最大值，在花后110 d葉綠素質量比略有下降（圖5E）。

6）葉中葡萄糖、果糖和蔗糖的質量比分別呈現出不同的變化趨勢，在生長發育過程中，葡萄糖和果糖的質量比變化趨勢相似，均為逐漸上升，且葡萄糖的質量比始終高于果糖，2 種糖的積累總量較為平緩，在花后110 d 質量比出現峰值。蔗糖的質量比隨著葉的發育呈先下降后逐漸上升的趨勢，在花后30～60 d 逐漸下降，花后60 d 以后蔗糖質量比不斷升高，至花后110 d 質量比出現峰值，蔗糖質量比的增長速度和凈增長量始終遠高于葡萄糖和果糖，可見葉片以積累蔗糖為主（圖5F）。

3 討論與結論

AGPs 是一類高度糖基化的蛋白質[2-3]，作為植物細胞壁的一種結構蛋白，AGPs與植物適應逆境有關[4]，在植物抗冷害機制中發揮著重要作用，與植物冷害存在重要相互關系，被證明在脅迫下參與信號傳導和細胞壁代謝[30]。研究表明，棉花根部組織中的1 個AGPs 基因GhAGP31 在冷脅迫下表達量顯著上升，表明AGPs 參與了植物的抗寒過程[31]；香蕉中的AGPs 基因MaFLA2-1、MaFLA17-3、MaFLA2-2 的表達量可能與香蕉的抗冷性密切相關，AGPs抗原可能參與了香蕉的抗冷過程，這揭示了AGPs 與植物冷害的關系，為香蕉抗冷育種提供了參考[28]。近年來還發現，AGPs 在植物應對生物[32]及鹽脅迫等非生物脅迫過程中也扮演著重要角色[33]，Lamport 等[33]利用鹽脅迫分析AGPs 功能認為，鹽脅迫使煙草BY-2細胞中AGPs 大量上調，AGPs 通過高度多孔的果膠網絡參與了細胞擴張，AGPs含量和細胞擴張速率可能存在相關性。不僅如此，低溫可能導致“生理性干旱”脅迫的產生[34]，并可能影響AGPs 在植物體中的分布[30]。Leszczuk 等[4]在低溫對雛菊（Bellis perennis）胚珠和花藥發育過程中AGPs 分布變化的影響研究中，利用識別AGPs 的特異性抗體揭示了低溫脅迫條件下AGPs 在雛菊雌性和雄性生殖結構中的分布發生了顯著變化，AGPs 在胚囊壁中完全消失，AGPs定位于小孢子的公共壁和成熟花粉粒，以及在殘余的絨氈層細胞中積累；Yan 等[35]采用免疫熒光標記技術研究了人工低溫脅迫下多種AGPs 在香蕉幼苗葉片中的分布及含量變化規律；王瑩瑩[28]發現，JIM8等抗體所識別的AGPs 抗原在香蕉葉表皮、保衛細胞均有分布，既具有保護作用，又抵御低溫脅迫?？梢?，低溫等非生物脅迫影響AGPs 在植物體中的分布，AGPs 在植物應對低溫、鹽堿脅迫導致的生理干旱等非生物脅迫過程中發揮了重要作用。

靈武長棗是干旱鹽堿地和沙荒地種植的先鋒樹種，葉表皮具有較厚的角質層，分布了大量的AGPs，這減少了植物體內水分的過量蒸騰，有助于葉片的光合作用。葉高度發達的柵欄組織維持了較高的光合作用能力。研究表明，低溫脅迫下，香蕉葉片組織細胞內的可溶性總糖、還原糖、甘油及可溶性蛋白質的含量均隨著溫度的降低而升高，并且淀粉與糖之間的轉化與植物的抗冷性存在密切關系[36]；煙草AGPs 從引導組織向花粉管轉移，為花粉管的生長提供營養支持[37]。本試驗表明，靈武長棗4個時期葉柵欄組織細胞的細胞壁和細胞內部都分布著大量JIM8抗體所識別的抗原，基本沒有明顯的變化，葉肉始終是葉AGPs 分布的主要部位，并且后期隨著葉片的發育，柵欄組織排列更加緊密，AGPs分布有所增強。本試驗還發現，由于靈武長棗發育早期花后30 d 氣溫相對較低，蒸騰速率較小，水分條件相對較好，較高的氣孔導度和胞間CO2濃度保證了較高的凈光合速率，滿足了早期果實對營養物質較高的需求；而花后60 d 氣溫高，蒸騰速率增大，其他光合指標及可溶性糖質量比均下降；花后30～60 d，蔗糖質量比逐漸下降至最低，這可能與葉片分解類酶活性的增長較高有關，促進了葉片中蔗糖的降解；在花后90 d，氣孔導度和胞間CO2濃度再次增高，凈光合速率明顯提高，葉可溶性糖尤其是蔗糖質量比也大幅增長，這更有利于蔗糖從源葉向果實庫的運輸，以適應干旱環境下果實發育后期對營養的大量需求。葉肉柵欄組織細胞是植物進行光合作用的主要場所，光合作用受外界生態因子和內部因素的綜合影響，柵欄組織細胞中大量的AGPs可能既參與了葉營養物質的合成，又作為營養物質來源，為干旱條件下植物的生長發育和后期果實營養物質的積累提供了保障和營養支持。而主脈和側脈維管束木質部和韌皮部細胞的細胞壁和細胞內部分布的AGPs，為干旱條件下水分和養分的高效運輸提供了保障[2，9]。因此，干旱條件下葉結構的適應性與各部位AGPs 的分布有關，AGPs 被認為有助于植物應對生物和非生物脅迫的反應[38]。