糧食中新興真菌毒素的污染現狀及毒理學研究進展

汪 爽, 赫 丹, 韓 君, 徐劍宏,史建榮, 祭 芳, 劉 馨, Lee Yin-Won

(江蘇大學食品與生物工程學院1,鎮江 212013)

(江蘇省農業科學院農產品質量安全與營養研究所;江蘇省食品質量安全重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地;農業農村部農產品質量安全控制技術與標準重點實驗室;農業農村部農產品質量安全風險評估實驗室(南京)2,南京 210014)

(揚州大學園藝與植物保護學院3,揚州 225009)

(韓國首爾國立大學農業生物技術學院4,首爾 08826)

真菌毒素是產毒真菌侵染作物時產生的低分子量次級代謝產物,可造成多種食品和飼料產品污染[1]。液相色譜與質譜相結合的檢測方法可以監測多種農產品中真菌毒素發生。本實驗室長期監測我國糧食作物中真菌毒素污染發生,監測結果顯示,糧食作物中發生較為廣泛、污染程度較重的真菌毒素主要包括單端孢霉烯B族毒素、玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素和赭曲霉毒素等。小麥、玉米等糧食作物中脫氧雪腐鐮刀烯醇、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素等污染嚴重[1]。近年來,隨著真菌毒素研究的發展和檢測技術的更新,一些新型真菌毒素不斷被發現并在全球范圍內頻繁檢出。目前將這些在農產品中污染較為普遍,尚未被列入常規風險篩查和監管、也尚無相關限量標準的真菌毒素種類,稱為新興毒素(Emerging toxins)[2]。新興毒素和隱蔽型毒素(Modified toxins)的區別主要在于,后者更偏向于定義那些與基質結合或在寄主中、加工等過程中結構發生修飾的毒素種類[3]。針對主要污染的毒素種類,國內外已制定了限量標準[4]。糧食中新興毒素檢出率較高,污染分布也較為廣泛,主要包括由鐮刀菌(Fusariumspp.)產生的白僵菌素(Beauvericin, BEA)、恩鐮孢菌素(Enniatins, ENNs)、串珠鐮刀菌素(Moniliformin, MON)、鐮刀酸(Fusaric acid,FA)等,以及由鏈格孢屬(Alternariaspp.)產生的細交鏈孢菌酮酸(Tenuazonic acid, TeA)、鏈格孢酚(Alternariol, AOH)、交鏈孢酚甲基醚(Alternariol monomethyl ether, AME)、交鏈孢烯(Altenuene,ALT)等,見圖1。國內外真菌毒素研究者應用多種模型評估了多種新興毒素的毒理學效應。文章綜述了糧食中新興毒素污染現狀和毒理學研究進展,以期為真菌毒素污染風險全面評估及防控技術研發提供參考。

圖1 糧食中主要新興真菌毒素的化學結構式

1 新興鐮刀菌毒素

1.1 白僵菌素(BEA)和恩鐮孢菌素(ENNs)

BEA和ENNs是由多種鐮刀菌侵染小麥、玉米作物后產生的環狀肽類化合物(圖1)。BEA因最早作為抗生素分離自白僵菌Beauveriabassiana而得名,主要由層出鐮刀菌F.proliferatum、亞黏團鐮刀菌F.subglutinans、輪枝鐮刀菌F.verticillioides和尖孢鐮刀菌F.oxysporum產生。ENNs由燕麥鐮刀菌F.avenaceum、尖孢鐮刀菌F.oxysporum、梨孢鐮刀菌F.poae和三線鐮刀菌F.tricinctum等合成[5]。

1.1.1 BEA和ENNs在糧食中的污染現狀

BEA和ENNs污染在世界范圍內廣泛分布,在糧食及其制品污染程度較重(表1)。歐洲對新興鐮刀菌毒素的檢測和報道相對較多,尤其在小麥、大麥、玉米及其制品中BEA和ENNs的污染較重,檢出率高,污染程度較重的樣品中,這幾種毒素含量為每千克高達數十毫克[6-13]。相比而言,非洲和亞洲國家糧食中BEA和ENNs的相關污染報道較少,污染總體水平也較低[14-16]。我國BEA和ENNs污染主要出現在玉米、小麥粉和稻谷樣品上,總體污染水平較低,但玉米樣品中BEA檢出率較高,可達1 mg/kg[17-20]。

表1 糧食中新興真菌毒素的污染情況

1.1.2 BEA和ENNs的毒理學研究

已有報道的BEA和ENNs的毒理學數據匯總在表2。BEA作為一種離子載體,其形成的陽離子選擇性孔洞破壞了離子生理濃度,影響細胞離子穩態[21]。BEA暴露導致細胞內Ca2+濃度增加,激活細胞色素C,導致半胱天冬酶3活性增強,誘導細胞凋亡和壞死[22]。BEA刺激活性氧產生、破壞線粒體和鉀離子穩態、誘導細胞內脂質過氧化作用以及谷胱甘肽耗盡發揮細胞毒性[23]。BEA可誘導DNA損傷,造成細胞周期阻滯,BEA暴露導致染色體畸變,同源染色體交叉互換頻率增加和微核形成,引起細胞凋亡[24]。BEA還會導致卵丘細胞中孕酮合成減少,受精卵中ATP損耗,早期胚胎中線粒體活性降低和功能異常[25,26],影響豬卵細胞和早期胚胎發育,危害生殖系統。此外,BEA還有免疫毒性,通過干擾樹突狀細胞遷移,增加白細胞介素-10分泌,影響適應性免疫反應的啟動[27,28]。BEA在小鼠不同組織中分布情況不同,肝臟和脂肪組織中濃度最高[29],腹腔注射BEA并未對小鼠的體重、進食量和行為產生影響[30]。飼喂含BEA的飼料對肉雞和火雞的血生化參數及肉質無顯著影響,對肉雞和蛋雞生長、飼料攝入和產蛋量影響也不顯著[31]。ENNs的毒性作用機制與BEA相似[32,33],在不同細胞中,ENNs的毒性程度存在差異[24]。在Caco-2細胞中,ENNs暴露會引起DNA損傷,導致細胞周期停滯在G2/M期。毒代動力學研究發現,ENNB1在豬體內的絕對口服生物利用度較高,而在肉雞體內吸收較差;相對豬而言,ENNB1在肉雞體內的總清除率和分布體積都較高[34,35]。ENNs在不同物種間口服生物利用度和毒物代謝動力學參數差異可能與毒素在動物體內的生物轉化效率有關。家禽和豬血漿中可檢測到ENNB和ENNB1的羥基化、羧基化或羰基化代謝產物。ENNs或BEA暴露會誘導ABC轉運蛋白編碼基因表達上調,并誘導對化學藥物交叉耐藥性的產生[36]。此外,BEA和ENNs暴露破壞腸道屏障完整性,影響機體對外源性物質的生物利用度,造成動物更易感病且生產性能降低。肉雞中ENNB、ENNB1和BEA主要殘留在肌肉、肝臟和皮膚中,而ENNA和ENNA1僅在雞肉中有微量檢出[37]。

表2 新興鐮刀菌毒素的產生菌及其毒理學數據

1.2 串珠鐮刀菌素(MON)

串珠鐮刀菌素(Moniliformin,MON)是一種小分子水溶性化合物(圖1),是一種酸性較強的有機酸,在自然界中通常以鈉鹽和鉀鹽的形式存在[2]。 MON主要由層出鐮刀菌F.proliferatum、亞黏團鐮刀菌F.subglutinans、燕麥鐮刀菌F.avenaceum、藤倉鐮刀菌F.fujikuroi和三線鐮刀菌F.tricinctum等產生[38](表2)。

1.2.1 MON在糧食中的污染現狀

全球范圍內,小麥等谷物中MON檢出較為頻繁,飼料樣品中污染相對更重[39-41](表1)。歐洲國家小麥、玉米樣品中MON污染嚴重,意大利玉米樣品MON檢出率高達93.0%,最高質量分數2 600.00 μg/kg[7-9],非洲國家萊索托玉米樣品中MON檢出率達100%,最高質量分數1 200.00 μg/kg[15]。我國玉米主產區樣品中MON的檢出率也非常高,相比其他新興鐮刀菌毒素,MON的總體污染更重[17]。

1.2.2 MON的毒理學研究

MON通過抑制硫胺素焦磷酸依賴酶的活性、破壞三羧酸循環影響細胞能量供應,發揮毒性作用(表2)。MON影響丙酮酸和α-酮戊二酸氧化,抑制丙酮酸脫氫酶及其他以硫胺素為輔因子的多種酶活性[42]。體外研究表明,MON的細胞毒性具有細胞株特異性,體外半抑制質量濃度為24～100 μg/mL[43]。MON對人白細胞和血小板細胞增殖無顯著影響,但對人體血紅細胞有毒性[44]。MON通過干擾單核細胞分化成樹突狀細胞和巨噬細胞影響免疫系統,造成淋巴細胞裂解,并以劑量依賴性引起染色體畸變、同源染色單體交換增加[27]。MON具有較強的體內毒性,主要靶器官是心臟,會造成急性心力衰竭[45-47]。停藥14 d后,處理組動物的中性粒細胞吞噬活性仍有所下降,表明MON對于免疫系統的抑制作用延續期較長[48]。此外,MON還具有植物毒性,引起玉米和小麥細胞壞死,影響生長調節和葉片卷曲等[49]。

1.3 鐮刀酸(FA)

鐮刀酸(Fusaric acid,FA)是β受體阻斷藥丁吡考胺的前體[50],主要由尖孢鐮刀菌F.oxysporum、串珠鐮刀菌F.moniliforme、層出鐮刀菌F.proliferatum、亞黏團鐮刀菌F.subglutinans、輪枝鐮刀菌F.verticillioides和藤倉鐮刀菌F.fujikuroi等產生[51](表2)。

1.3.1 FA在糧食中的污染現狀

糧食中FA的污染報道較少(表1),但總體污染水平相對較重。加拿大和美國的干玉米、小麥及大麥樣品中的檢出率均超80.0%,每千克樣品中最高可檢出數十毫克FA,谷物為原料的豬飼料和高水分玉米樣品FA檢出濃度更高[52,53]。

1.3.2 FA的毒理學研究

FA的毒性主要包括細胞毒性和致畸性(表2)[54]。FA暴露對不同細胞系和癌細胞系均具有細胞毒性和生長抑制作用,FA(500 μmol/L)抑制WI-38成纖維細胞和大腸癌細胞增殖。在人肝癌細胞系(Hep-G2)中,FA可誘導氧化和線粒體應激反應,造成細胞凋亡及壞死[55,56]。FA暴露改變大鼠大腦和松果體神經遞質[53],具有神經化學作用。通過銅螯合作用,FA可使脊索畸形,對斑馬魚具有致畸作用[57]。FA在病原菌侵染初期作為先導分子干擾線粒體功能,誘導植物細胞死亡[58]。

2 新興鏈格孢毒素

鏈格孢毒素污染多種農作物,最常檢出的種類包括鏈格孢酚(Alternariol, AOH)、鏈孢酚甲基醚(Alternariol monomethyl ether, AME)、細交鏈孢菌酮酸(Tenuazonic acid, TeA)、交鏈孢烯(Altenuene, ALT)、交鏈孢毒素(Altertoxins, ATXs)(圖1)。A.alternata和A.arborescens可產生TeA、ALT、AOH和AME[59]。A.bertholletius、A.caelatus、A.nominus、A.pseudonominus、A.arachidicola和A.bombycis也會產生TeA[4]。

2.1 鏈格孢毒素在糧食中的污染現狀

鏈格孢毒素廣泛污染糧食、水果和蔬菜等農作物,存在多種鏈格孢毒素復合污染的現象,歐洲國家污染報道較多(表1),主要污染類型包括AME、TeA、TEN、AOH及ALT等。小麥、玉米及其制品主要受AOH、AME及TeA的鏈格孢毒素污染[60-67], 我國小麥樣品也有TEN(Tentoxin)污染的相關報道[17]。

2.2 鏈格孢毒素的毒理學研究

鏈格孢毒素的毒性主要表現為細胞毒性、遺傳毒性和致癌致突變性(表3)。AOH的細胞毒素表現在通過線粒體途徑誘導細胞凋亡[68,69],引起細胞內活性氧水平升高,與DNA拓撲異構酶互作造成DNA斷裂,細胞周期停滯在G2/M期,細胞增殖減少。AME具有誘變性,可造成DNA斷裂和細胞周期停滯。醌類化合物ATX-Ⅱ 和ATX-Ⅲ 比AOH具有更強的誘變性[70,71]。此外,AOH通過干擾巨噬細胞分化和減少TNF-α分泌,在THP-1單核細胞中發揮免疫毒性作用[70,72]。AOH、AME和ALT與雌二醇結構相似,AOH處理引起類雌激素反應并干擾類固醇生物合成,通過雌激素作用增加孕酮和雌二醇含量,誘導孕酮受體表達水平增加。在豬顆粒細胞中,AOH和AME調控孕酮分泌和細胞活力[73]。AME腹腔注射處理敘利亞金倉鼠會導致母體和胎兒毒性,但不會導致畸形,AOH、AME和ALT暴露會導致依賴劑量的致畸現象[74]。ALT可引起NIH/3T3細胞基因損傷,導致DNApolβ表達上調[75]。TeA通過抑制核糖體蛋白質合成發揮毒性作用[76],會引起動物嘔吐、心跳過速和出血性胃腸病。

表3 鏈格孢毒素的產生菌及其毒理學數據

3 總結與展望

針對糧食中的主要真菌毒素污染,通過風險評估、污染監測和較為系統的毒理學研究,目前國內外制定了限量標準,相應的防控技術也得以研發與應用。新興真菌毒素的發生風險、污染動態和毒理學研究尚缺乏系統研究,目前尚未被列入常規風險監測。國內外圍繞新興毒素污染及其毒理學已開展了相關研究,文章綜述分析糧食中主要新興真菌毒素的污染類型、發生分布和毒理學相關研究進展。目前新興鐮刀菌毒素和鏈格孢毒素是糧食中主要的污染類型,污染分布廣泛,其中,ENNs、BEA、FA、MON和TeA等在小麥、玉米、稻谷等主糧作物及飼料中污染嚴重,且存在多種新興毒素與常見毒素復合污染的態勢。毒理學研究表明, ENNA、ENNA1、ENNB1、BEA、MON、AOH、AME等具有遺傳毒性,AOH、BEA和ENNB具有生殖毒性。建議將糧食中污染較為嚴重、毒性較強的新興毒素納入常規監測和風險評估體系,并圍繞其產毒菌群遺傳、毒素生物合成途徑、產毒調控機制、污染風險形成機制和多毒素毒理效應等開展深入系統研究,結合污染數據和毒理學數據以及風險評估結果,提出標準制定建議,將為糧食中真菌毒素的全面風險評估和管控技術的研發提供參考。