漢黃芩素促進自身免疫性肝炎模型大鼠Th17/Treg細胞平衡

鄧 娟，王秀芳，孫瑞青

空軍軍醫大學第一附屬醫院 消化內科，陜西 西安 710032

自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)是一種復雜的免疫介導的肝病,患者大多數需要終身治療,以防止肝硬化和終末期肝病的發展[1]。目前,關于AIH的治療主要以糖皮質激素和硫唑嘌呤治療,但治療效果有限。漢黃芩素(wogonin,WG)是一種黃酮類物質,是從黃芩根(scutellarin radix)中分離得到的天然成分,是一種常用的用于過敏和癌輔助治療的藥材[2-3]。WG的抗氧化作用已在多種疾病中得到證實,特別是與炎性反應有關的疾病,如非酒精性脂肪性肝炎[4]。WG不僅能夠激活小鼠肝細胞(AML12)中轉錄因子4(transcription factor 4,ATF4)-成纖維細胞生長因子21(fibroblast growth factor 21,FGF21)表達,改善代謝性疾病,還能通過核因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf 2)介導的核轉錄因子(kappa B,NF-κB)信號緩解膿毒癥肝損傷[5-6]。AIH與自身免疫紊亂直接相關,輔助性T細胞17(Th17)和調節性T細胞(Treg)失衡會導致免疫系統紊亂促進AIH的發生[7]。Notch信號的持續失調會促進肝臟炎性反應和腫瘤發展產生[8]。下調Notch信號軸會促進肝卵圓細胞分化為肝細胞進而緩解肝損傷[9]。本研究旨在探究WG對AIH大鼠Th17/Treg細胞平衡和Notch信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物:SPF級雄性SD大鼠(200～220 g)[貴州醫科大學實驗動物中心,生產許可證號:SCXK(黔)2018-0001]。本研究已獲得本院動物倫理委員會的批準。

1.1.2 試劑及試劑盒:漢黃芩素(WG)(北京伊塔生物科技有限公司);伴刀豆球蛋白A(concanavalin A,ConA,上海源葉生物科技有限公司);Notch信號通路激活劑丙戊酸(valproic acid,VPA)(北京百奧萊博科技有限公司);丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase,ALT)試劑盒、天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase,AST)試劑盒和腫瘤壞死因子-β(tumor necrosis factor-β,TNF-β)試劑盒[博輝生物科技(廣州)有限公司];白介素10(interleukin 10,IL-10)試劑盒、白介素17(interleukin 17,IL-17)試劑盒和白介素-23(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司);CD4-APC、IL-17-PE抗體、抗-類視黃酸相關孤兒受體γt(retinoid acid-related orphan receptor γ t,RORγt)、-叉頭框蛋白P3(forkhead box protein P3,Foxp3)、-Notch、-hes家族bHLH轉錄因子1(hes family bHLH transcription factor 1 gene,HES1)和-含YRPW基序的bHLH轉錄因子hes相關家族1(hes related family bHLH transcription factor with YRPW motif 1,HEY1)抗體(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理: 隨機選擇10只大鼠作為對照組,其余大鼠參考先前文獻[4],通過尾靜脈注射ConA溶液12.5 mg/kg,每周1次,連續注射6周,構建AIH大鼠模型。隨機選擇5只大鼠根據HE染色情況判斷造模是否成功,將造模成功大鼠隨機分為AIH組、L-WG組、M-WG組、H-WG組和H-WG+丙戊酸(VPA)組,每組10只。L-WG組、M-WG組、H-WG組分別腹腔注射WG 10、20、30 mg/kg[10],每天1次,持續10 d。H-WG+VPA組在注射WG(30 mg/kg)的基礎上,隨后,注射300 mg/kg VPA[11],每天1次,持續10 d。AIH組和對照組給予等量0.9%氯化鈉溶液。

1.2.2 采集標本: 藥物治療結束第2天,通過腹主動脈采血3 mL,經3 000 r/min離心10 min后取上清液,置于-20 ℃保存以備后續ELISA檢測。麻醉后處死大鼠,分離肝臟和脾臟組織,一部分肝臟組織固定于4%多聚甲醛中用于HE染色和免疫組化,剩下的肝臟組織和脾臟組織儲存于-80 ℃中用于Western blot和流式細胞測量術。

1.2.3 ELISA檢測血清中炎性因子及肝功能: 取上述保存的血清,參照ELISA試劑盒步驟檢測大鼠血清中肝功能指標(ALT和AST)以及炎性因子(IL-10、TNF-β、IL-17和IL-23)水平。

1.2.4 HE染色觀察肝臟組織形態: 取4%多聚甲醛溶液中固定的肝臟組織,經過水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋后切成4 μm薄片,隨后將切片置于烤箱1 h,脫蠟、脫水后,用蘇木精和伊紅染色,在光學顯微鏡下觀察肝臟組織形態。

1.2.5 流式細胞測量術檢測脾臟Th17/Treg細胞水平: 分離脾臟組織的淋巴細胞,加入緩沖液細胞懸浮液,使每孔細胞濃度稀釋到1×109細胞/L,與CD4-APC、IL-17-PE避光孵育20 min,用流式細胞儀檢測Th17細胞數量,另外與CD4-APC、FOXP3-FITC避光孵育20 min,檢測Treg細胞數量。

1.2.6 Western blot檢測脾臟RORγt、Foxp3以及肝組織Notch信號通路蛋白表達 取-80 ℃保存的肝臟和脾臟組織,分別加入RIPA裂解緩沖液后提取總蛋白,將蛋白質進行定量、電泳、轉膜,將膜于室溫封閉3h后分別加入一抗:抗-RORγt(∶1 000)、-Foxp3(1∶1 000)、-Notch(1∶1 000)、-HES1(1∶1 000)、-HEY1(1∶2 000)和-GAPDH抗體(1∶1 000),于4 ℃孵育一夜,加入HRP標記的山羊抗兔二抗(1∶2 000),室溫孵育3 h,加入ECL試劑使蛋白條帶顯影后。使用Image J軟件分析蛋白的吸光度值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 WG對大鼠血清ALT、AST活性的影響

與對照組相比,AIH組大鼠ALT、AST活性顯著上升(P<0.05);與AIH組相比,L-WG組、M-WG組、H-WG組大鼠ALT、AST活性依次顯著降低(P<0.05);與H-WG組相比,H-WG+VPA組大鼠ALT、AST活性顯著增加(P<0.05)(表1)。

表1 WG對大鼠血清ALT、AST活性的影響Table 1 Effect of WG on serum ALT and AST activity

2.2 WG對大鼠血清炎性因子的影響

與對照組相比,AIH組大鼠IL-17和IL-23含量顯著上升(P<0.05),IL-10和TNF-β含量顯著下降(P<0.05);與AIH組相比,L-WG組、M-WG組、H-WG組大鼠IL-17和IL-23水平顯著降低(P<0.05),IL-10和TNF-β水平顯著上升(P<0.05);與H-WG組相比,H-WG+VPA組大鼠IL-17和IL-23含量顯著增加(P<0.05),IL-10和TNF-β含量顯著減少(P<0.05)(表2)。

表2 WG對大鼠血清炎性因子的影響Table 2 Effect of WG on aerum inflammatory factors in rats pg/mL, n=10)

2.3 WG對大鼠肝臟組織損傷的影響

對照組大鼠肝組織結構正常,染色清晰;AIH組大鼠肝組織細胞出現水腫,細胞體積增大導致肝竇受壓變窄,出現炎性細胞浸潤及少量細胞壞死現象。L-WG組、M-WG組、H-WG組改善了以上現象;H-WG+VPA組與AIH組結構相似(圖1)。

AIH.autoimmune hepatitis; WG.wogonin; VPA.valproic acid; H-WG.30 mg/kg wogonin.圖1 HE染色檢測肝臟組織病理變化Fig 1 HE staining for pathological changes in liver tissue(×200)

2.4 WG對大鼠脾臟Th17/Treg 細胞水平的影響

與對照組相比,AIH組大鼠Th17細胞水平、Th17/Treg均顯著上升(P<0.05),Treg細胞水平顯著下降(P<0.05);與AIH組相比,L-WG組、M-WG組、H-WG組大鼠Th17細胞水平以及Th17/Treg依次顯著降低(P<0.05),Treg細胞水平顯著上升(P<0.05);與H-WG組相比,H-WG+VPA組大鼠Th17細胞水平、Th17/Treg比例顯著增加(P<0.05),Treg細胞水平顯著減小(P<0.05)(表3)。

表3 WG對大鼠脾臟Th17/Treg 細胞水平的影響Table 3 Effect of WG on Th17/Treg cell levels

2.5 WG對大鼠脾臟中Foxp3、RORγt水平的影響

與對照組相比,AIH組大鼠RORγt水平顯著上升(P<0.05),Foxp3水平顯著下降(P<0.05);與AIH組相比,L-WG組、M-WG組、H-WG組大鼠RORγt水平依次顯著下降(P<0.05),Foxp3水平依次顯著升高(P<0.05);與H-WG組相比,H-WG+VPA組大鼠RORγt水平顯著增加(P<0.05),Foxp3水平顯著減少(P<0.05)(圖2)。

AIH.autoimmune hepatitis; L-WG.10 mg/kg wogonin; M-WG.20 mg/kg wogonin; H-WG.30 mg/kg wogonin; VPA.valproic acid; *P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with AIH; △P<0.05 compared with H-WG.圖2 WG對大鼠肝中Foxp3、RORγt水平的影響Fig 2 Effect of WG on Foxp3 and RORγt levels in rat n=10)

2.6 WG對大鼠肝組織Notch信號通路蛋白表達的影響

與對照組相比,AIH組大鼠Notch、HES1、HEY1蛋白表達均顯著上調(P<0.05);與AIH組相比,L-WG組、M-WG組、H-WG組大鼠Notch、HES1、HEY1蛋白表達依次顯著降低(P<0.05);與H-WG組相比,H-WG+VPA組大鼠Notch、HES1、HEY1蛋白表達顯著增加(P<0.05)(圖3)。

AIH.autoimmune hepatitis; L-WG.10 mg/kg wogonin; M-WG.20 mg/kg wogonin; H-WG.30 mg/kg wogonin; VPA.valproic acid; *P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with AIH; △P<0.05 compared with H-WG.圖3 WG對大鼠肝組織Notch、HES1、HEY1蛋白表達的影響Fig 3 Effect of WG on Notch, HES1, and HEY1 protein expression in rat liver n=10)

3 討論

AIH是一種病因不明的慢性進行性肝病,全球AIH患病率呈上升趨勢,特別是在男性中。AIH會導致肝硬化和相關并發癥,甚至有發展為肝細胞癌的風險[12]。因此,尋找AIH的潛在治療藥物極其重要。WG可通過調節肝星狀細胞的活化和凋亡來減輕肝纖維化,成為治療和預防肝慢性炎性的潛在藥物[13]。WG可以改善氧化應激和炎性反應,從而成為緩解敗血癥肝損傷的潛在治療劑[4]。本研究發現,AIH組大鼠肝組織出現明顯的病理損傷,同時ALT、AST活性升高,與既往研究[14]一致,表明AIH大鼠造模成功;不同劑量WG的干預不僅改善了肝臟病理損傷現象,還降低了ALT、AST活性,表明WG尤其是高劑量(30 mg/kg)WG可減輕肝損傷,提示WG可能是AIH的潛在治療靶點。

Th17細胞在多種免疫性疾病中發揮促炎作用,而Treg細胞是維持免疫穩態和誘導免疫耐受的關鍵因子,Th17/Treg失衡促進了AIH的發生[8]。Th17細胞可以通過產生促炎因子(IL-17、IL-22和IL-23),募集中性粒細胞,進而加重炎性反應;而Treg細胞可以通過產生抗炎因子(IL-10和TGF-β),維持免疫穩態。RORγt與Foxp3分別是Th17細胞和Treg細胞的轉錄調控因子[15]。本研究發現,WG可通過調節炎性因子水平促進AIH大鼠Th17/Treg平衡。

Notch激活會破壞肝臟穩態,加重小鼠肝纖維化[16]。下調Notch、HES1、HEY1表達可以抑制肝癌的發展[17]。下調Notch信號軸會恢復Th17/Treg平衡進而緩解大鼠自身免疫性葡萄膜炎[18]。在本研究中,Notch、HES1、HEY1蛋白高表達,與相關報道[19]相似,提示AIH大鼠中Notch信號通路處于激活狀態;而WG治療后Notch、HES1、HEY1蛋白水平下降,提示WG可通過下調Notch信號通路,促進Th17/Treg平衡,減輕AIH大鼠肝損傷。為了進一步證實此推測,在H-WG治療的基礎上,注射Notch信號通路激活劑VPA,結果發現VPA可消除H-WG對AIH大鼠肝損傷的治療作用。

綜上所述,WG可能通過下調Notch信號軸來維持Th17/Treg平衡,進而改善AIH大鼠肝臟損傷。且WG治療效果呈劑量依賴性。然而,WG是否可以通過調控其他通過起到同樣緩解肝損傷的效果需要進一步探究。