蘭花分子育種技術研究進展

賈思思，曾瑞珍，張志勝，魏 倩，謝 利，郭和蓉

(廣東省植物分子育種重點實驗室/華南農業大學 林學與風景園林學院,廣東 廣州 510642)

蘭花是蘭科Orchidaceae 植物的總稱，但在中國，蘭花是指蘭科蘭屬Cymbidium植物，特別是其中的地生種類，也就是今天的國蘭[1]。蘭科是開花植物中最大的科之一，已鑒定的蘭科植物有899 屬29 199 種，約占開花植物的8%～10%，除極地和極端干旱的沙漠外，世界各地均有蘭花分布[2-3]。蘭花具有很高的觀賞價值、藥用價值、食用價值、生態價值和文化價值，是世界著名的觀賞花卉，也是中國傳統十大名花之一[3]。作為觀賞花卉，蘭花既可以做切花、也可以做盆花，既可以觀花、也可以賞葉，同時也是園林造景優良植材，深受世界各國人民的喜愛。作為進化程度最高、種類最豐富的植物，蘭花也是當今生物學領域研究生命和進化的理想模式植物。新品種選育是蘭花產業自主和高質量發展的基礎，而育種方法是快速高效選育蘭花優良品種的關鍵。目前，蘭花育種的主要方法有引種馴化、選擇育種、雜交育種、誘變育種和多倍體育種等[4-5]。這些育種方法雖然有效，但可利用資源范圍窄、育種周期長，不能定向培育市場所需品種。分子育種是采用轉基因或基因編輯技術創造變異、或通過分子標記輔助選擇技術培育新品種的方法，主要包括轉基因育種、基因編輯育種和分子標記輔助選擇育種。近年來，隨著蘭花組學技術的發展，蘭花主要育種目標性狀的分子遺傳基礎、基因鑒定和克隆、高密度分子圖譜構建等取得巨大進步，蘭花轉基因技術和分子標記輔助選擇技術也取得明顯進展，本文對此進行綜述并對未來蘭花分子育種技術研究的重點和品種創新進行了展望，為進一步推動蘭花分子育種技術研究和新品種選育提供參考。

1 蘭花基因組測序和功能基因鑒定

1.1 基因組測序

自2015年Cai 等[6]完成小蘭嶼蝴蝶蘭Phalaenopsisequestris基因組測序以來，迄今有來自4 亞科8 屬18 種共27 份蘭花完成了基因組測序，包括附生、地生和腐生3 類(表1)[6-31]。其中，廣東舌唇蘭Platantheraguangdongensis基因組最大(4.27 Gb)[20]，深圳擬蘭Apostasiashenzhenica基因組最小(348.73 Mb)[30]，天麻Gastrodiaelata預測基因數最少(17 895 個)[25]，染色體數最少的香莢蘭Vanillafragrans預測基因數最多(59 128 個)[29]?；诨蚪M測序結果，對蘭花葉藝、花型、花色、花期、適應性等性狀的分子遺傳基礎分析結果表明，CH1基因家族顯著縮減可能是導致墨蘭Cymbidiumsinense葉藝形成的重要原因[7]；光合天線和代謝途徑相關基因表達水平降低引起建蘭C.ensifolium葉藝的形成，葉片中與花發育相關的MADS-box基因表達水平顯著提高導致花被狀葉的形成[8]。

表1 蘭花基因組測序Table 1 Genome sequencing of orchid

MADS-box基因影響花發育和形態。通過測序分析，在多枝擬蘭A.ramifera、深圳擬蘭、天麻、紫金舌唇蘭Platantherajaponica、廣東舌唇蘭、香莢蘭、小蘭嶼蝴蝶蘭、臺灣蝴蝶蘭P.aphrodite、鼓槌石斛Dendrobiumchrysotoxum、鐵皮石斛D.catenatum、春蘭C.goeringii、建蘭和墨蘭中分別鑒定出30、36、40、43、43、55、51、56、58、63、69、71 和94 個MADS-box基因[2,7,9,19]，且多數蘭花中沒有FLC、AGL12和AGL15基因。在小蘭嶼蝴蝶蘭中有20 個基因優先在花組織中表達，MIKC等5 個基因只在花中表達，C/D 類和B 類基因AP3、AGL6基因家族的擴張和分化可能是蘭花高度特化花型形成的原因[6]。CsSEP4基因正調控墨蘭合蕊柱發育[7]。C 類基因CeAG-1和CeAG-2在建蘭花瓣中的高表達形成鼻狀花瓣，在花芽中低表達時，則花中沒有鼻，取而代之的是幾輪花被片，形成具有多花被片分枝花序的花；CeSEP-2基因表達上調對蘭花形成特化的唇瓣十分重要，下調則形成菊瓣花；唇瓣結構由CeAP3-1、CeAP3-2、CeAP3-3、CeAP3-4和CeAGL6-2基因控制，CeAP3-3、CeAP3-4和CeAGL6-2在萼片和花瓣中高表達則分別形成唇瓣狀萼片和花瓣突變體[8]。

萜類化合物在蘭花香氣和抗逆性中起關鍵作用。在深圳擬蘭、小蘭嶼蝴蝶蘭、鼓槌石斛、金釵石斛D.nobile和墨蘭中鑒定出TPS基因數分別為14、21、48、51 和59 個[6,7,14,17,30]。墨蘭的花香與TPS基因家族擴張有關，與無香的墨蘭相比，有香的墨蘭TPS家族基因表達量更高[7]。單萜和倍半萜主要在花發育晚期和開花期形成，與其生物合成的相關基因GDPS、FDPS和LIS高表達有關，FDPS和GDPS主要在萼片、花瓣和唇瓣中表達，說明萜類化合物主要在花被中合成[8]。

花色是蘭花主要育種目標性狀。通過基因組測序和表達分析，在墨蘭中鑒定出56 個花青素合成代謝相關基因和125 個MYBs，花青素合成代謝相關基因在綠色、黃色、粉色和紫黑色花中差異表達，其中，4 個F3′H基因在紅色和紫色花中高表達。調控花青素合成途徑上游的MYBs一般在開紫黑色花的墨蘭中表達上調，而調控下游的平行基因表達譜存在顯著差異，此外，MYBs通過調控F3′5′H的表達影響墨蘭的花色[7]。在白色和粉色臺灣蝴蝶蘭中，F3H的表達模式明顯不同，R2R3-MYB在不同顏色蝴蝶蘭中表達模式也不同[19]。

次生代謝物是藥用蘭花的主要育種目標性狀。測序分析結果表明，鐵皮石斛中SPS和SuSy基因擴張與石斛多糖形成有關[12]；甲基赤蘚糖醇磷酸途徑中DXS、LUT1、LUT2、LCY1、LUT5等相關基因的丟失，導致天麻中葉黃素、胡蘿卜素和脫落酸等物質的缺乏[23]；OMT基因在秋水仙素生物合成中起重要作用[24]。

其他性狀研究結果表明，墨蘭CsSVP基因與其互作蛋白CsAP1 和CsSOC1 共同調控低溫誘導開花[7]。附生蘭耐熱性與SDD1、PPP7和3MAT基因家族擴張有關[12]。鼓槌石斛花期短是由于在開花至凋謝過程中類胡蘿卜素含量逐漸增加、葉黃素含量逐漸減少，導致ABA 含量減少、乙烯含量增加所致[14]。

1.2 功能基因鑒定

功能基因鑒定是蘭花分子育種的基礎。迄今采用轉基因、RNAi 和VIGS 等技術已從蘭屬、石斛屬、蝴蝶蘭屬和文心蘭屬Oncidium蘭花中鑒定出功能基因91 個[32-103]。其中，通過將基因轉入蘭花中并驗證功能的有24 個，占比24.7%。已鑒定出功能的基因包括植株生長發育、葉色、花發育、花色、開花時間、多糖合成、抗病、抗逆和組培快繁特性等基因(表2)，其中，花色、花發育、花期、抗逆和多糖合成的基因數分別為20、19、15、13 和 5 個，占比分別為22.0%、20.9%、16.5%、14.3%和5.5%。

2 轉基因和基因編輯

轉基因技術是蘭花分子育種核心技術之一。自Kuehnlehe 等[104]利用基因槍法將PRVCP基因轉入石斛蘭原球莖以來，蘭花轉基因技術研究取得巨大進展(表3)。迄今已建立蝴蝶蘭、石斛蘭、文心蘭、大花蕙蘭C.hybrida、春蘭、墨蘭、寒蘭C.kanran、萬代蘭Vanda和小扇葉蘭Erycina pusilla等蘭花轉基因技術體系，主要轉基因方法為農桿菌介導法和基因槍法，涉及的性狀包括花型、花色、花期、花壽命、次生代謝物、抗病、抗逆和組培快繁特性等[85-131]。通過過表達外源基因或自身基因、基因沉默、RNAi 和激活標簽系統等手段已獲得花色變深的蝴蝶蘭‘TS444’[33]和‘V3’[94]，花期提前的石斛蘭[102]，抗除草劑小扇葉蘭[89]，多糖和甘露糖含量高、抗逆性強的鐵皮石斛[96]，PLB 形成能力增強的蝴蝶蘭[97]，頂端分生組織形成多芽和花期提前的石斛蘭[98]，花瓣中出現紅色斑點的南茜文心蘭OncidiumGower Ramsey[101]和寒蘭[103]，鮮切花壽命增加、花蕾脫落延遲的石斛蘭[119]，抗病毒的蝴蝶蘭[122,124]、石斛蘭[104,123]和抗低溫的蝴蝶蘭[131]等轉基因蘭花。

基因編輯技術是一種有效定向育種技術。Kui 等[90]以原球莖為受體，通過農桿菌介導法建立了鐵皮石斛CRISPR/Cas9 基因編輯技術體系，C3H、C4H、4CL、CCR和IRX基因編輯效率為10%～100%。Tong 等[95]以培養30 d 的原球莖為受體，對小蘭嶼蝴蝶蘭MADS基因進行編輯，從20 個外植體中共獲得47 個突變體，其中，46 個突變體在3 個位點均發生突變，總突變率為97.90%。

3 分子標記輔助選擇

高密度遺傳連鎖圖譜構建對QTL 定位、基因克隆和分子標記輔助選擇等具有重要作用。在石斛蘭、蝴蝶蘭和兜蘭Paphiopedilum等蘭花上已構建出了高密度分子遺傳圖譜(表4)[19,132-139]。Lu 等[135]以細莖石斛D.moniliforme×鐵皮石斛雜交后代為作圖群體，構建了含 8 573 個SLAF 標記、19 個連鎖群的石斛蘭分子遺傳圖譜，標記間平均距離為0.32 cM，鑒定出5 個與莖多糖含量相關的QTLs。Li 等[136]以100 個金釵石斛和大苞鞘石斛D.wardianumF1雜交后代為作圖群體，構建出含9 564個SNP 標記、19 個連鎖群的石斛蘭分子遺傳圖譜，標記間平均距離為 0.41 cM，鑒定出2 個與莖長和1 個與莖粗相關的QTLs。Hsu 等[138]通過測序基因分型(Genotyping-by-sequencing，GBS)鑒定出1 191個SNPs，基于1 191 個SNPs 和22 個SSRs 構建出含19 個連鎖群的蝴蝶蘭高密度分子遺傳圖譜，通過基因組關聯分析(Genome-wide association study，GWAS)，鑒定出7 個與1 個花部顏色相關聯的SNPs。Li 等[139]以同色兜蘭Paph.concolor和帶葉兜蘭Paph.hirsutissimum的95 個雜種后代為作圖群體，構建出具有13 個連鎖群、8 410 個SNP 標記的遺傳圖譜，標記間平均距離為0.19 cM，篩選出與葉長、葉寬、葉厚和葉數連鎖的SNP 標記共12 個。

表4 蘭花分子遺傳圖譜構建Table 4 Construction of genetic map in orchid by molecular marker

王健等[140]利用RAPD 分子標記對16 種有香和無香春蘭進行分析，篩選到引物BA0088，該引物在有香春蘭中擴增出一條特異性370 bp 條帶，帶型清晰，重復性好。劉澤強[141]利用大花蕙蘭和墨蘭雜交后代F1群體篩選到2 個與蘭花香氣性狀緊密連鎖的ISSR 標記b19 和b21，b19 對蘭花有香后代的預測準確率為84%、b21 的預測準確率為88%，雙標記預測準確率為98%。李曉紅[142]篩選到8 個與蘭花純黃綠色花連鎖的SSR 標記，這些標記輔助純黃綠色花選擇的準確率為52%～100%。肖文芳等[143]以黃金豹蝴蝶蘭P.Frigdaas Oxford 和白天使蝴蝶蘭P.Join Angel 及其雜交后代為材料，篩選到2 個與蝴蝶蘭花底色關聯的SNP 標記，Marker35886 和Marker70907 的2 個SNP 位點對花底色的鑒定準確率分別為66.67%和73.33%，雙標記鑒定準確率達93.33%。

4 展望

蘭花種類繁多、用途廣泛、市場前景廣闊。隨著經濟發展和人們個性化需求的增加，市場對蘭花新品種的需求逐漸提高，如何快速高效選育蘭花新品種，滿足市場需求已成為育種家急需解決的問題。分子育種能夠最大限度利用種質資源，快速定向培育蘭花新品種，目前已成為蘭花育種方法研究的熱點[2,5]。隨著組學技術的發展，分子育種技術將成為影響蘭花新品種選育、決定產業競爭力和高質量發展的關鍵核心技術。

21 世紀以來，蘭花分子育種技術研究取得了巨大進步，但鮮見利用分子育種方法培育出蘭花新品種的報道，原因是蘭花轉基因、基因編輯和分子標記輔助選擇等技術還處于技術研發階段，且目前的研究主要是從技術創新而非品種創新的角度進行的。為了將分子育種技術更好地應用于品種創新，今后應加強以下幾個方面的研究工作。

1)加強優良商業化品種轉基因技術研究，建立穩定高效蘭花轉基因技術體系。轉基因技術不僅是轉基因和基因編輯育種的技術基礎，也是挖掘蘭花主要育種目標性狀基因的關鍵技術。目前蘭花轉基因技術只在蝴蝶蘭、石斛等少數蘭花的個別材料中取得成功，而且轉基因效率不高，今后應研究其他主要商業化蘭花和優良品種的高效轉基因技術，為選育具有商業化應用前景的蘭花新品種奠定基礎。

2)加強遺傳圖譜構建和標記輔助選擇技術研究，構建以SSR、Indel 等分子標記為主的高密度分子遺傳圖譜，建立分子標記輔助主要育種目標性狀選擇技術體系。雖然目前已構建出幾種蘭花高密度分子遺傳圖譜，但這些圖譜主要是SNP 標記圖譜，育種應用價值不高，已建立分子標記輔助選擇技術的只有花香和黃綠色花等少數性狀，今后應加強篩選與育種早期無法選擇或選擇難度大、成本高和準確率低的性狀緊密連鎖分子標記，建立其輔助目標性狀選擇技術，實現育種早期高效定向選擇的目的，以進一步提高育種效率和效益。

3)加強控制主要育種目標性狀的主效基因挖掘。不管是轉基因還是基因編輯育種，獲得功能基因是前提，目前雖然鑒定出許多育種目標性狀基因，但這些基因都是通過反向遺傳學方法獲得的，多數基因的功能未經驗證，其效應和遺傳規律不清楚，今后應加強采用正向遺傳學方法或結合傳統遺傳學研究結果挖掘關鍵基因。

4)加強蘭花基因編輯技術研究。利用CRISPR/Cas9 編輯蘭花基因效率高[90,95]，顯示出其在蘭花育種上的巨大應用潛力。因此，大力加強蘭屬蘭花、卡特蘭、文心蘭等蘭花基因編輯技術研究、建立基因編輯技術體系，對進一步推動蘭花育種和產業高質量發展具有重要意義。