關于光合色素的提取、分離及其吸光度的探究

楊運昕 趙映蕾 朱冰瀅 鄭歡珂 朱雪瀅

浙江省寧波市效實中學白楊校區(315012)

高中生物必修1進行了光合色素的提取和分離實驗,通過實驗觀察光合色素的種類和顏色。出于對光合色素的興趣,在查閱資料時了解到,柱層析法也可以將光合色素分離,因此進行了用柱層析法分離光合色素的實驗,將柱層析與紙層析進行比較;并對光合色素提取液進行吸光度的測量,驗證光合色素的功能,深化對光合色素種類、顏色和功能的理解。

1 實驗原理

綠葉中的光合色素能夠溶于有機溶劑而不溶于水,因此可用無水乙醇等有機溶劑提取光合色素。在色素分離的環節,因為各種色素在層析柱填充物硅膠上的吸附力不同,極性較大的物質易被硅膠吸附,極性較弱的物質不易被硅膠吸附,當采用溶劑洗脫時,發生一系列吸附→解吸→再吸附→再解吸的過程,吸附力較強的組分,在層析柱中移動的速度慢;吸附力較弱的組分,移動的速度快,從而形成若干色帶,使各種色素相互分離。

2 材料用具

2.1 實驗材料

新鮮的菠菜葉。

2.2 實驗藥品、試劑

無水乙醇、碳酸鈣粉末、二氧化硅晶體、正己烷、氯化鈉晶體、硅膠、展開劑[石油醚∶乙酸乙酯=6∶4(體積比)]、無水硫酸鎂。

2.3 實驗儀器

研缽、布氏漏斗、抽濾瓶、燒杯、具塞試管、圓底燒瓶、容量瓶、比色皿、循環水泵、梨形分液漏斗、洗身球、層析柱、分光光度計等。

3 探究過程

3.1 研磨

稱取15 g新鮮菠菜葉,剪碎,放入研缽中,加入少量二氧化硅晶體、碳酸鈣粉末和20 mL無水乙醇,充分研磨,研磨物成綠色糊狀。

3.2 抽濾

準備1套干凈的抽濾瓶,剪一片略小于布氏漏斗內徑又能遮住漏斗內所有小孔的濾紙放在布氏漏斗底部,用少量清水潤濕濾紙,打開循環水泵的開關,將抽濾瓶接到循環水泵上,濾紙隨即被緊緊吸在漏斗底部,立即將研磨后的混合物倒入布氏漏斗,這時可以看到綠色的濾液被吸入抽濾瓶(見圖1),漏斗內的濾渣變成了淺黃綠色(見圖2)。濾渣抽干后,將抽濾瓶與循環水泵脫開,關閉水泵。

圖1 用布氏漏斗進行抽濾

圖2 抽濾后的淺綠色濾渣

3.3 萃取

取1套干凈的100 mL分液漏斗,先檢驗是否漏液。將分液漏斗放置在鐵圈上,抽濾瓶內的色素提取液倒入分液漏斗,加入約1 gNaCl固體,再加入10 mL正己烷,右手掌頂住漏斗頂端并握住漏斗,左手握住活塞處,大拇指壓緊活塞,將分液漏斗稍稍傾斜,振蕩分液漏斗,約1 min后,使漏斗上口略朝下,旋開活塞,朝斜上方無人處放出氣體。如此振搖排氣2～3次后,將分液漏斗放在鐵圈上,靜置,直到液體分層(見圖3)。將下層液體從活塞口放出,上層液體從漏斗上口倒出,倒入容量瓶內,待用(見圖4)。由于下層液體顏色偏深,色素含量仍然較大,將溶液倒入分液漏斗,加入10 mL正己烷,重復上述操作。將上層萃取液合并入容量瓶內。

圖3 用正己烷對光合色素進行萃取

圖4 萃取得到光合色素

3.4 干燥、濃縮

加1 g無水硫酸鎂(干燥劑)子萃取液中,靜置約5 min,干燥充分后,過濾干燥劑,濾液收集到干燥的圓底燒瓶中。減壓蒸餾,至濃縮溶液約為1 mL。

3.5 填充層析柱

將層析柱下端活塞關閉,把30 g干燥的硅膠用展開劑調成漿狀,然后倒入層析柱,打開活塞使溶劑流出,硅膠固體下沉,用洗耳球不停敲打層析柱,使固定相填充均勻。

3.6 色素分離

調節層析柱活塞使展開劑均勻地從下端流出,當上端展開劑的液面接近硅膠柱上端時,將濃縮后的色素提取液倒入,層析管上端放一個裝有展開劑的滴液漏斗,當色譜將要完全滲入層析柱的時候,打開滴液漏斗,并調節流速,使層析柱上端一直保持一定的液面高度(見圖5)。

圖5 開始柱層析

光合色素逐漸在層析柱上發生分離,分離出不同的色帶(見圖6),當色帶移動到層析柱底部的時候,用干凈的比色皿接流出的溶液,不同的色帶流出時更換不同的比色皿。

3.7 分光光度法檢測

圓底燒瓶內剩余的少量色素濃縮液用展開劑稀釋,然后以展開劑為參照,在可見光范圍內測量吸光度。

4 探究結果

層析柱上色帶的移動速度及色帶的延展寬度見表1。

表1 光合色素的種類與移動速度、顏色、色帶的延展寬度

收集到的各種色素溶液如圖7所示。

圖7 收集到的各種色素溶液

光合色素提取液在不同波長(λ)下的吸光度(A)數值見表2,對應的吸光度曲線如圖8所示。

表2 光合色素提取液在不同波長下的吸光度值

圖8 光合色素提取液的吸光度曲線

5 討論分析

層析柱上色帶的數目多于紙層析法分離的結果,且顏色順序與紙層析法獲得的結果不完全相同。文獻顯示,除葉綠素外,葉綠體中還有許多種黃色、 橙色和紅色的色素,合稱為類胡蘿卜素,其中最多的是胡蘿卜素和葉黃素[1],由于柱層析的分離效果較好,這些色素在層析柱上進一步分離,所以呈現更多的色帶。影響色素在層析柱上移動結果的實驗因素有很多,如研磨中加入的輔助試劑、萃取劑、展開劑、層析柱的填充材料等,我們分析導致各色素在層析柱和濾紙上展開順序有差異的主要原因是層析柱的填充材料與濾紙材料不同,對色素的吸附能力不同。當然這仍需要進一步的實驗才能得出準確結論。

從圖8中可見,光合色素對波長400～500 nm范圍內的藍紫光和620～680 nm范圍內的紅橙光有較強吸收能力,而對在波長為500～600 nm范圍內的綠光沒有吸收或吸收很弱。所以,植物最喜歡的光是紅橙光和藍紫光。

對比紙層析和柱層析分離色素,兩種分離方法各有優勢。紙層析的方法需要的實驗器材簡便,操作簡單,可以用于簡單的色素分離[2]。柱層析分離操作相對復雜,但是分離的效果更好,且可以用于大量色素的提取和制備中。