非洲豬瘟發病機理研究進展

馮芳蘭

（甘肅省畜牧技術推廣總站，甘肅 蘭州 730030）

非洲豬瘟（African Swine fever，ASF）是豬的一種急性、熱性、高接觸性傳染病，已被證明對全球豬肉行業造成破壞性影響。20世紀20年代，在肯尼亞引進歐洲家豬后，該病首次被發現[1]，之后ASF病毒蔓延到全球各地，影響著豬產業的健康發展。非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）是一種直徑為200 nm的二十面體DNA病毒，包括包膜、衣殼、內囊膜、核殼和內核。病毒基因組是一個長度為170～190 kb的線性雙鏈DNA分子，兩端共價閉合。根據病毒株的不同，編碼150～200種病毒蛋白，包括68種結構蛋白和100多種非結構蛋白[2-5]。ASFV基因組中某些序列的重復和丟失是導致不同來源或同一品系的世代ASFV菌株差異的因素之一[6]。p72是ASFV主要的衣殼蛋白，因其保守性而用于血清分型。單核-巨噬細胞是ASFV的主要靶細胞[7]。ASFV感染宿主細胞的分子機制尚不清楚。網格蛋白依賴的內吞途徑和大細胞吞噬途徑是ASFV侵襲的可能途徑。然而介導這一過程的細胞膜受體和病毒蛋白仍然未知。截至目前，仍然沒有有效的疫苗或抗病毒藥物來預防或治療非洲豬瘟。復雜的病毒基因組及其調節宿主免疫反應的能力可能是開發疫苗困難的原因。

1 ASFV感染機制

病毒成功感染宿主細胞必須經歷6個過程，包括吸附、滲透、脫衣、生物合成、包裝和脫落。ASFV在與宿主受體結合后或通過巨噬細胞增多途徑被內化。病毒粒子在感染1～30 min時進入早期核內體，并在30～90 min運輸到晚期核內體。之后，ASFV完成了晚期核內體的脫殼和基因組釋放?；虮磉_可分為3個階段：早期、中期和晚期。早期基因表達發生在感染后的4～6 h，主要編碼ASFV復制相關蛋白，隨后在感染后的6～8 h復制ASFV基因組?；蚪M復制首先發生在細胞核中（主要在細胞質），復制后，編碼病毒顆粒結構相關蛋白的中晚期基因在8～16 h開始表達。在16～24 h，病毒顆粒在病毒工廠聚集。大約24 h后，組裝好的病毒顆粒從細胞膜上發芽，釋放到細胞外[8]。單核巨噬細胞是ASFV的主要宿主細胞。此外，ASFV還感染次要靶細胞，如血管內皮細胞、肝細胞或上皮細胞[9]。

2 ASFV入侵機制

研究表明，ASFV進入宿主細胞是一種受體介導的內吞過程，依賴于溫度、能量、膽固醇和低pH值，相關研究將這一過程描述為網格蛋白依賴的內吞作用（CME）和巨胞飲作用。CME和巨胞飲作用都需要動力素。幾種藥物抑制劑和特異性蛋白對ASFV進入所需的抑制關鍵蛋白具有明顯的負作用，表明ASFV進入的主要途徑是巨胞飲作用。巨胞飲作用依賴于肌動蛋白的重排，還涉及膽固醇、鈉/質子交換器（Na/H）、EGFR、PKC、磷酸化PI3K、Pak1激酶和小Rho-GTPase Rac1的激活[10]。但在一些研究中，純化的病毒顆粒在Vero細胞和巨噬細胞中沒有引起顯著的巨胞飲作用[11]。臨床癥狀提示ASFV感染的巨噬細胞表現出抗體依賴性增強作用（ADE），也就是說，Fc受體可能參與該過程，但需要進一步的研究來驗證這個假設[12]?？贵w依賴性增強作用說明ASFV更喜歡利用不同的途徑來提高其感染各種靶細胞的能力，并適應感染過程中不斷變化的條件。

3 ASFV在宿主細胞中的傳播機制

病毒粒子從早期核內體到病毒工廠再到細胞膜的運輸取決于微管的功能[13]。病毒粒子內化后，囊泡在細胞中依次形成早期核內體（EE）、成熟核內體（ME）和晚期核內體（LE）。隨著含ASFV的EEs成熟為LEs，核內體腔逐漸酸化，核內體膜表面的分子標記物逐漸改變，最終在酸性環境中病毒顆粒脫殼。ASFV感染會重新分布整個囊泡系統，因此病毒顆?？梢院苋菀椎乇贿\輸到核周區[14]。感染早期，衣殼蛋白和內包膜蛋白立即與特定標記物共同定位，如EE和大粒細胞體中的EEA1和Rab5。感染晚期，病毒內包膜蛋白（p17）或核殼蛋白（p150）與晚期內體標記物（Rab7）和溶酶體標記物（Lamp1）共同定位，后者是ASFV感染的關鍵調節因子[15-19]。病毒顆粒在病毒工廠（VF）中組裝后，驅動蛋白使用多端微管馬達將“貨物”從病毒工廠運輸到細胞膜。此外，ASFV還可以通過過度乙?；⒐軄碓黾游⒐艿姆€定性，以確保成熟的病毒顆粒被運輸到質膜上。肌動蛋白細胞骨架被認為是病毒逆行運輸的一種可能的替代途徑[20]。

4 ASFV在宿主細胞中的復制及基因表達機制

ASFV從核內體釋放出來，通過病毒內膜蛋白pE183L（p54）結合微管動力蛋白激活微管系統，遷移到核周微管組織中進行DNA復制和生物合成[21-25]。病毒基因的表達分為4個階段：即刻、早期、中期和晚期。早期基因在病毒感染的4～6 h表達，包括病毒基因組復制所需的蛋白質和酶，晚期基因的表達與免疫逃避的多基因家族相關。ASFV感染6～8 h后，病毒開始復制。雖然ASFV的復制主要發生在細胞質的VF中，但在早期的細胞核中也有短暫的復制時刻。8～16 h后，中晚期基因開始表達，合成形成新生病毒所需的結構蛋白和包裝在病毒顆粒中的早期轉錄因子[26]。通過質譜分析，共有68種病毒蛋白，包括結構蛋白和非結構蛋白，其是病毒轉錄、DNA修復和蛋白質修飾不可或缺的重要組成部分[27]。

5 ASFV病毒工廠形成機制

ASFV劫持并改變細胞反式高爾基體核內體網絡系統以促進病毒感染。宿主適配器蛋白AP-1介導蛋白質從trans-Golgi網絡（TGN）到核內體的轉運，吸收網格蛋白形成網格蛋白包被的小泡，通過識別蛋白質分選信號進行選擇性轉運。AP-1在小GTP酶ADP核糖基化因子1（Arf1）的調控下被招募到TNG膜。細胞內AP-1定位和細胞內網格蛋白包被的體/核內體遷移由于外包膜蛋白CD2v和AP-1之間的相互作用，可誘導新的膜結構形成[28]。

相關研究表明，各種形式和小型的ASFV膜碎片的結構和功能參與病毒工廠形成的早期過程，先形成彎曲的膜，再形成組裝中間產物。這些膜的組裝中間體積累和聚集形成網絡結構[29]。病毒工廠是存在于微管組織中心（MTOC）[30]的單個并且比較大的核周結構，病毒在這里完成復制以及新合成病毒體的組裝。病毒工廠膜結構中存在結構蛋白p54和p34，共聚焦顯微鏡顯示病毒工廠中的p72和p54在形態上是不同的，p72為點狀結構，而p54為多態結構，可能是p54與新形成的病毒顆粒之間的連接有關[31]。ASFV感染會改變細胞內膽固醇的分布[32]。膽固醇對細胞的攝入是病毒進入宿主細胞、復制和形成病毒工廠的關鍵。相反，膽固醇不允許在核內體積聚，否則病毒顆粒將滯留在核內體。大量的脂質轉移蛋白，如羥甾醇結合蛋白（OSBP），介導病毒工廠中的脂質和離子交換。病毒利用膜接觸位點（MCS）確保脂質轉移到病毒工廠[33-34]。病毒顆粒招募PI4P激酶形成大量的PI4P聚集體，然后聚集PI4P蛋白形成大量MCS，MCS通過膽固醇和PI4P交換積累膽固醇。此外，在ASFV感染細胞的室顫中發現了完成脂質交換和磷脂酰肌醇-4激酶β（PI4Kβ）所需的含有ACBD3的?；o酶A結合域。研究表明，ASFV編碼的g5Rp具有1個Nudix水解基序，該基序可能在調節病毒形態中起作用，涉及二磷酸肌醇多磷酸鹽介導的膜轉運[35]。ASFV j4R蛋白與新生多肽相關復合體（NAC）的α鏈相互作用，這表明j4R可能參與新合成蛋白向病毒工廠的轉運[36]。完整的病毒工廠是缺乏外部限制膜的單個結構，由線粒體和波形蛋白包圍，其提供病毒工廠的物理支架或阻止病毒進入細胞質[37-38]。病毒感染期間病毒工廠的形態發生變化。由于病毒工廠形成，宿主細胞的重排機制以及病毒工廠與宿主細胞膜的關系仍不清楚[39]。

6 ASFV免疫調節機制

ASFV感染豬巨噬細胞后，宿主首先誘導先天性免疫反應，然后產生適應性免疫反應[40]。ASFV的基因組是DNA，這可能被cGAS（DNA的一種模式識別受體）識別為病原體相關分子模式（PAMP），然后通過cGAS/STING信號通路激活I型IFN的表達。I型干擾素的下游抗病毒基因，如IFIT家族也被激活和表達。I型干擾素和干擾素刺激基因（ISG）可以抵抗ASFV感染。巨噬細胞和樹突狀細胞是ASFV感染誘導的自然免疫應答的主要效應細胞。巨噬細胞能夠釋放一系列細胞因子，如IL-1a、IL-1b和IL-18，并表達MHCI以啟動適應性免疫反應。漿細胞樣DC（pDC）和自然殺傷細胞（NK）可以產生大量干擾素來抵抗ASFV感染。ASFV感染8 d后，抗體水平逐漸升高，這表明宿主存在體液免疫應答。這些中和抗體有一定的保護作用。此外，細胞免疫，如CD8+T細胞，在ASFV感染中也起著重要的抗病毒作用。CD4+CD8+雙陽性T細胞可分泌穿孔素和顆粒酶，這也可能在抵抗ASFV感染中發揮作用[41]。然而，為了生存并產生后代病毒，親本病毒編碼各種蛋白質以逃避宿主的免疫反應。

迄今為止，還沒有針對ASFV的有效疫苗，這使得ASF的預防或控制變得困難。因此，ASFV的基礎研究仍需為疫苗研究提供理論依據。一方面，ASFV在宿主細胞中的生命周期需要進一步研究；另一方面，宿主對ASFV的免疫應答以及ASFV進化的免疫抑制機制有待進一步研究。雖然ASFV感染細胞的詳細過程在以往的研究中已被描述，但涉及的細胞和病毒蛋白仍是未知的?？赡苡卸鄠€分子作為受體或共受體參與病毒感染過程。參與進入宿主細胞的病毒蛋白可作為ASFV衰減的靶點，這為成功開發疫苗提供了可能性。ASFV成功進入宿主細胞后，在核周區附近形成VF，這是新生病毒組裝所必需的。然而，VF膜結構的形成機理尚不清楚。此外，ASFV也在細胞核內復制，ASFV DNA進入細胞核可能與可以進入細胞核的病毒蛋白p37、p14和p10有關[42]。然而，病毒蛋白介導的大病毒DNA到細胞核的轉運、DNA復制和DNA到細胞質的轉運有待進一步研究。眾所周知，ASFV入侵機體會產生一系列抗病毒反應，而ASFV也能形成自身的免疫逃逸機制對抗抗病毒反應。此外，一些ASFV基因還可以通過抑制轉錄因子（如IRF3和NFkB）抑制巨噬細胞I型IFN的產生。ASFV的免疫侵襲和免疫抑制機制已部分闡明，但仍不清楚。ASFV通常以幾種方式抑制某些抗病毒蛋白或免疫反應的表達。如A276R、I329L通過不同機制抑制IFN-b的表達，A179L、A224L、DP71L抑制細胞凋亡。這種冗余可能也是疫苗開發困難的原因之一。因此，研究ASFV編碼蛋白的功能，特別是介導ASFV免疫逃逸和免疫抑制的蛋白，對ASFV減毒活疫苗的開發和設計具有重要意義。