青藏高原冬克瑪底冰川可培養細菌群落特征研究

賈譜超， 張 威， 劉 陽， 田 茂， 張昺林，章高森， 劉光琇， 陳 拓

（1. 中國科學院 西北生態環境資源研究院 沙漠與沙漠化重點實驗室，甘肅 蘭州 730000； 2. 中國科學院 西北生態環境資源研究院冰凍圈科學國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730000； 3. 甘肅省極端環境微生物資源與工程重點實驗室，甘肅 蘭州 730000； 4. 中國科學院大學，北京 100049）

0 引言

冰川是由積雪經過多年反復融凍、累積和壓實等作用而形成的復雜生態系統，主要由雪、冰和融水3 種相互關聯的生境組成。冰川因其低溫、寡營養、強輻射等惡劣的自然條件，構成了冰川特有生態環境特征，這種極端寒冷的生境中生存的大量微生物使其成為一個天然的微生物資源保藏庫。隨著全球氣候變暖引發冰川消融，大量封存在冰川中的微生物逐漸被釋放出來［1］，導致冰川中大量的微生物資源隨著冰川的消融而流失。

冰川微生物主要來源于周圍環境，包括細菌、病毒、原生生物和真菌及其孢子等等，隨著冰川發育，這些微生物被封存在冰川冰中。在冰川微生物的研究中，高通量測序、宏基因組等各種分子水平上的研究方法現已十分普遍，但傳統的培養方法因其可得到完整的生命體，并能在個體水平研究微生物的各項生理生化指標，是獲得微生物資源和微生物全基因組的必要手段，仍被廣泛應用［2］。研究表明，冰川中微生物細胞數量范圍為2×102～7×107CFU·mL-1（colony forming units per milliliter）［3-8］，細菌群落豐富度低于土壤、水體和其他富營養生境。大量研究中冰川可培養細菌大多來源于放線菌門、變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門，但在不同生境中細菌群落結構不同，可培養細菌的數量也因生境的改變而不同［9-13］。然而，目前對于冰川微生物的可培養研究仍不夠，且冰川微生物資源的流失從未停止。

冬克瑪底冰川位于唐古拉山脈，其融水作為長江源頭之一，部分冰川微生物會隨融水進入下游，這些幸存者中包含一些遠古時期的細菌，可能對下游生態系統造成重大影響。該區域的氣候主要受西風帶和印度洋季風的影響，呈現出冬季干冷、夏季暖濕的特性［14］，年平均氣溫為-5 ℃［15］，降水集中于5—9 月，降水量436.6 mm，占全年比例為92.5%～94.1%［16］。相關可培養細菌的研究工作表明，冬克瑪底冰川雪樣中細菌來源于放線菌門、變形菌門和厚壁菌門，且放線菌門是優勢門［13］；而冰川前沿土壤可培養細菌研究同樣發現放線菌門是優勢門，且25 ℃培養條件下分離的屬的豐度和多樣性大于4 ℃［17］。通過非培養手段研究發現冬克瑪底冰川末端表層冰和基底冰也具有不同的細菌群落［18］。這些研究表明：冰川中不同生境條件下，微生物的群落分布差異較大，可培養微生物在異質的生境中系統進化會發生改變［10］。目前，對于冬克瑪底冰川微生物的研究不多，且都只研究了一種冰川生境，同時研究雪、冰和融水3種生境能夠更系統全面地了解冰川生態系統可培養細菌多樣性和群落構成。

本文通過可培養方法，研究冬克瑪底冰川5 430 m、5 550 m 和5 670 m 海拔表層雪、表層冰及冰下融水3種生境中可培養細菌多樣性及其群落結構特征，發現疑似新種48 株，豐富了冬克瑪底冰川微生物資源的理論基礎，對唐古拉山區域生態環境評估及微生物物種資源發掘有一定參考價值，以期為之后的冰川微生物研究提供科學依據，為微生物資源庫提供數據支撐及菌種資源。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

唐古拉山脈，位于中國西藏自治區東北部與青海省邊境處，東段為西藏與青海的界山，東南部延伸接橫斷山脈的云嶺和怒山。本研究樣品于2021年9月下旬在唐古拉山冬克瑪底冰川（圖1），海拔每隔120 m 采集冰、雪和融水樣品，采集的所有樣品用無菌采樣袋（Bombardier， 加拿大）和無菌瓶（比克曼，中國）分裝，每個海拔不同類型的樣品均采集三個平行樣（圖1）。將采集的樣品放入冰箱-20 ℃低溫保存運回實驗以進行后續細菌培養實驗。

圖1 冬克瑪底冰川采樣點Fig. 1 Sampling sites of Dongkemadi Glacier

1.2 樣品理化性質的測定

將解凍后的樣品使用定性濾紙過濾，然后取其中一部分用pH 測量儀（PT-10， Sartorius， 德國）對水體樣品pH 值進行測定；取另一部分樣品用電導率測量儀（DDSJ-308A，上海雷磁）對水體電導率（electrical conductance， EC）進行測量；Cl-、NO3-、SO42-、Na+、K+、Mg2+及Ca2+的含量均在中國科學院西北生態環境資源研究院冰凍圈科學國家重點實驗室測定，具體方法參照文獻［19］。

1.3 細菌分離培養

選用5 種不同的培養基：R2A 瓊脂培養基（R2A）、R2A 改良瓊脂培養基（R2A-Y，培養基中每升額外添加1 g酵母膏）、營養瓊脂、胰蛋白胨大豆肉湯培養基（TSB）和腦心浸出液肉湯（BHI），培養基參考德國菌種保藏中心（https：//www.dsmz.de）配方。

在超凈臺中將冰樣置于滅菌的5 L 燒杯中，切除表面1 cm，取出冰樣置于無菌瓶在4 ℃冰箱緩慢融化，雪樣同樣置于4 ℃冰箱緩慢融化。在超凈臺中從冰樣和融水樣分別取200 μL 涂布于R2A、R2A-Y、營養瓊脂、TSB 和BHI 瓊脂培養基上。在超凈臺中將200 mL雪樣融水過濾到0.22 μm無菌Millipor微孔濾膜上，將濾膜懸浮在2 mL 0.9%的生理鹽水中，充分震蕩以懸浮細菌細胞，然后取200 μL 涂布在培養基表面進行培養。所有樣品在無光條件下培養，每種培養基做6個平行樣，其中3個置于25 ℃條件下培養，另外3 個置于10 ℃條件下培養。培養1周后開始對25 ℃培養箱的平板進行計數和不同表型特征菌落的分離和純化，3 周后開始對10 ℃培養箱的平板進行同樣操作。分離、純化出的細菌加入25%的甘油混合后放置于凍存管中并保存至-80 ℃冰箱中。

1.4 可培養細菌的16S rRNA 基因的擴增以及序列測定

對可培養細菌進行16S rRNA基因的擴增，引物采用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）［20］。擴增體系（25 μL）：12.5 μLTaqDNA 聚合酶，10.5 μL ddH2O，1 μL 引物。擴增反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s 和72 ℃延伸45 s進行30個循環；最后72 ℃延伸20 min。PCR 擴增的產物送至西安擎科生物公司進行序列測定，將測定得到的16S rRNA 基因序列提交至GeneBank（NCBI）獲取序列登錄號：ON693689-ON693837。

1.5 序列比對及系統發育樹的構建

將提交至NCBI 的16S rRNA 基因序列在EZBioCloud 數據庫進行比對（www. ezbiocloud. net）；clustal muscle 方法進行比對，p-distance 方法計算的距離，選擇鄰近相接法對序列進行分析；用MEGA11構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 冬克瑪底冰川樣品理化性質分析

冰川樣品中，雪的pH 值呈弱酸性，5.71～5.86；EC 較低，3.45～5.51 μS·cm-1。Cl-、NO3-、Na+、Mg2+和Ca2+含量隨著海拔變化差異顯著；其中Na+、Mg2+和Ca2+含量隨海拔增加含量降低（表1）。雪樣的SO42-和K+含量隨著海拔變化無顯著性差異（表1）。

冰的pH 值的范圍為6.55～6.57，電導率較低，10.93～48.30 μS·cm-1。Cl-、Na+、K+、Mg2+、Ca2+、NO3-和SO42-含量隨著海拔變化差異顯著，其中NO3-和SO42-含量隨海拔增加而增加（表1）。

冰川融水的pH 值的范圍為6.93～7.30；電導率范圍在73.30～134.77 μS·cm-1之間。Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cl-、NO3-和SO42-含量隨著海拔變化差異顯著，其中Cl-、NO3-和SO42-含量隨著海拔增加而增加（表1）。

2.2 冬克瑪底冰川可培養細菌數量

不同溫度下可培養細菌數量顯著不同；在10 ℃培養條件下，10 ℃培養溫度下培養得到的細菌數量平均值為539 CFUs·mL-1，顯著高于25 ℃的189 CFUs·mL-1［圖2（a）］。雪樣在10 ℃培養條件下，可培養細菌數量平均值是8 CFUs·mL-1，在25 ℃時是12 CFUs·mL-1，10 ℃培養得到的數量平均值低于25 ℃［圖2（b）］；冰樣和融水樣在10 ℃培養條件下，培養得到的細菌數量平均值（冰樣1567 CFUs·mL-1，融水樣44 CFU·mL-1）均顯著高于25 ℃（冰樣528 CFU·mL-1，融水樣27 CFU·mL-1）［圖2（c）～2（d）］。

圖2 冬克瑪底冰川可培養細菌數量Fig. 2 Abundance of the culturable bacteria from the Dongkemadi Glacier

研究還發現不同樣品類型，培養得到的細菌數量也不同。在10 ℃培養條件下從雪、冰和融水樣培養得到的細菌數量顯著不同，表現為冰樣＞融水樣＞雪樣。在25 ℃從雪、冰和融水樣培養得到的細菌數量同樣表現為冰樣＞融水樣＞雪樣，但雪樣和融水樣間的差異性不顯著。

2.3 冬克瑪底冰川可培養細菌群落結構特征

根據培養基上細菌菌落的表型特征，分離、純化得到149 株細菌。將這些細菌的16S rRNA 基因序列在EZBioCloud數據庫進行比對，分析發現冬克瑪底冰川分離出的菌株分別歸屬于4 個門，放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes）。

本次研究共分離得到了放線菌門中的16個屬，分別是庫克菌屬（Kocuria）、微桿菌屬（Microbacterium）、節桿菌屬（Arthrobacter）、假節桿菌屬（Pseudarthrobacter）、紅球菌屬（Rhodococcus）、土壤球菌屬（Agrococcus）、密執安棍狀桿菌屬（Clavibacter michiganensis）、類諾卡氏菌屬（Nocardioides）、纖維素單胞菌屬（Cellulomonas）、血桿菌屬（Sanguibacter）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、冷桿菌屬（Cryobacterium）、氣微菌屬（Aeromicrobium）、居真菌細菌屬（Mycetocola）、根戈德里谷氨酸桿屬（Paeniglutamicibacter）和鹽地桿菌屬（Salinibacterium），庫克菌屬為優勢屬（圖3）。

圖3 放線菌門可培養細菌基于16S rRNA基因序列構建的系統發育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of Actinobacteria culturable bacteria based on 16S rRNA gene sequence

變形菌門中分離得到13個屬，分別是馬賽菌屬（Massilia）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、短波單胞菌屬（Brevundimonas）、鞘氨醇盒菌屬（Sphingopyxis）、紫色桿菌屬（Janthinobacterium）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、副球菌屬（Paracoccu）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、極單胞菌屬（Polaromonas）、皺紋單胞菌屬（Rugamonas）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、Aquirhabdus和紅育菌屬（Rhodoferax），馬賽菌屬為優勢屬（圖4）。

圖4 變形菌門可培養細菌基于16S rRNA基因序列構建的系統發育樹Fig. 4 Phylogenetic tree of Proteobacteria culturable bacteria based on 16S rRNA gene sequence

擬桿菌門中分離出4 個屬，分別是黃桿菌屬（Flavobacterium）、薄層菌屬（Hymenobacter）、土地桿菌屬（Pedobacter）和Kaistella，其中黃桿菌屬是優勢屬（圖5）厚壁菌門分離出3個屬，分別是芽孢桿菌屬（Bacillus）、微小桿菌屬（Exiguobacterium）和類芽孢桿菌（Paenibacillus），芽孢桿菌屬是優勢屬（圖6）。

圖6 厚壁菌門可培養細菌基于16S rRNA基因序列構建的系統發育樹Fig. 6 Phylogenetic tree of Firmicutes culturable bacteria based on 16S rRNA gene sequence

研究表明，16S rRNA 基因同一性為98.7%作為物種級臨界值［21］，本研究中發現與已分離發表的菌種相似度低于98.7%的細菌有46 株，均為潛在新種。

2.4 冬克瑪底冰川可培養細菌分布特征

統計不同溫度下可培養細菌物種發現，不同培養溫度，培養得到的細菌群落結構不同，具體表現在物種數目和組成。在10 ℃培養條件下，共分離出55個種（28個屬），而在25 ℃只分離出43個種（23個屬）。有些細菌只在一個培養溫度發現，氣微菌屬、冷桿菌屬、居真菌細菌屬、根戈德里谷氨酸桿屬、鹽地桿菌屬、Aquirhabdus、副球菌屬、嗜冷桿菌屬、極單胞菌屬、皺紋單胞菌屬、假單胞菌屬、黃桿菌屬和土地桿菌屬只從10 ℃培養溫度分離得到，纖維素單胞菌屬、密執安棍狀桿菌屬、血桿菌屬、不動桿菌屬、副球菌屬、鞘氨醇盒菌屬、芽孢桿菌屬和微小桿菌屬只從25 ℃培養溫度分離得到，而其他屬在兩個培養溫度下均能分離得到［圖7（a）］。

圖7 冬克瑪底冰川可培養細菌物種數（a）和CFU（b）Fig. 7 Number of species （a） and colony forming units （b） of the culturable bacteria from the Dongkemadi Glacier

研究還發現，不同生境，培養得到的細菌群落結構也不同。本次培養共分離出36個屬，雪中分離出8 個屬，冰中28 個，融水中14 個。在10 ℃培養條件下，雪中分離出5 個種，冰中35 個，融水中21 個；在25 ℃下，雪中分離出5 個種，冰中32 個，融水中8個。微桿菌屬在3 種生境中均能分離得到，土壤球菌屬僅在雪樣中分離得到；纖維素單胞菌屬、密執安棍狀桿菌屬、庫克菌屬、居真菌細菌屬、根戈德里谷氨酸桿屬、假節桿菌屬、鹽地桿菌屬、血桿菌屬、不動桿菌屬、紫色桿菌屬、嗜冷桿菌屬、假單胞菌屬、皺紋單胞菌屬和微小桿菌屬僅在冰樣中分離得到；氣微菌屬、類諾卡氏菌屬、Aquirhabdus、紅育菌屬、鞘氨醇盒菌屬和類芽孢桿菌僅在融水樣中分離得到［圖7（a）］。

在10 ℃和25 ℃培養條件下，放線菌門均為優勢門，分別占60.64%和77.76%，在屬水平上，以庫克菌屬（24.49%和44.31%）、微桿菌屬（19.83%和25.52%）和馬賽菌屬（10.35%和4.48%）為優勢屬。冰樣中的最優勢屬為庫克菌屬，而融水樣和雪樣中的最優勢屬均為微桿菌屬［圖7（b）］。

2.5 冬克瑪底冰川可培養細菌多樣性

辛普森多樣性指數（Simpson’s diversity index）、物種均勻度指數（species evenness index）、香農-威納指數（Shannon-Weiner index）和物種數目（number of species）4個多樣性指數的統計結果均表明不同培養溫度，冬克瑪底冰川3 種樣品總的可培養細菌多樣性不同，且10 ℃培養條件下，可培養細菌的多樣性高于25 ℃［圖8（a）］。

圖8 冬克瑪底冰川可培養細菌α-多樣性（a）和β-多樣性（b）Fig. 8 α-diversity （a） and β-diversity （b） of the culturable bacteria from the Dongkemadi Glacier

4 個多樣性指數的統計結果均發現不同生境，可培養細菌多樣性也不同。其中，香農-威納指數和物種數目的統計結果一致，在10 ℃和25 ℃兩個培養條件下多樣性均表現為冰樣＞融水樣＞雪樣。兩個溫度培養條件下辛普森多樣性一致表現為融水樣＞冰樣＞雪樣［圖8（a）］。10 ℃培養條件下物種均勻度：雪樣＞融水樣＞冰樣；25 ℃培養條件下物種均勻度：融水樣＞雪樣＞冰樣［圖8（a）］。NMDS 圖結果顯示冬克瑪底冰川3種不同生境的細菌群落結構明顯不同，且相比雪樣，冰樣與融水樣的可培養細菌群落結構更相近［圖8（b）］。

3 討論

3.1 可培養細菌群落結構特征

本研究從冬克瑪底冰川分離得到的可培養細菌可分為4個門，分別是放線菌門、變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門，與其他冰川研究結果一致［10，13，22-24］。無論在可培養細菌數量還是物種數目方面，放線菌門都是冰川生態系統的優勢菌門［25-27］，本研究中冬克瑪底冰川也有類似的結果。

不同溫度下冬克瑪底冰川可培養細菌的數量顯著不同，在10 ℃培養條件下可培養細菌的數量高于25 ℃。相關研究結果表明，不同培養溫度下可培養細菌數量差異顯著［17］，可培養細菌數量與溫度呈負相關關系［28-29］。冰川細菌經過了一定時間的反復融凍和低溫封存，冰樣和融水樣的細菌群落已發生了變化，部分不耐冷的細菌因不適應低溫環境而被淘汰，存活下來的細菌可能更適應低溫環境。冷桿菌屬、嗜冷桿菌屬和極單胞菌屬等只在10 ℃培養條件下被分離的耐冷細菌，極大可能在冰川消融的大趨勢下消失；而纖維素單胞菌屬、血桿菌屬和副球菌屬這些只在25 ℃培養溫度分離得到的非耐冷細菌，隨著冰川消融，它們可能在經過低水溫的冰前河流時就被淘汰。

本研究結果與其他冰川對比，包括安第斯山脈玻利瓦爾冰川［26］、北極斯瓦爾巴群島冰川［30］、卓奧友峰冰川［31］、天山烏魯木齊河源1 號冰川［32-33］、老虎溝12 號冰川［33-34］和慕士塔格冰川［22，33，35］等［11，36-38］。結果發現包括優勢屬（庫克菌屬、微桿菌屬和馬賽菌屬）在內的28 個屬在其他冰川均被發現，而纖維素單胞菌屬、假節桿菌屬、根戈德里谷氨酸桿屬、血桿菌屬、Aquirhabdus、皺紋單胞菌屬、鞘氨醇盒菌屬和Kaistella在其他冰川未見報道。冬克瑪底冰川發現的細菌門和優勢屬在其他冰川相關研究中也被發現，可能是由于這些冰川相似的極端環境對于細菌的選擇性造就了細菌群落結構的相似性。冬克瑪底冰川存在大量獨有的屬，這可能是由于其微生物來源不同，并且受到溫度、濕度、太陽輻射程度和營養水平等一系列環境條件的影響而造成的［39］。研究還發現疑似新種49 株，分離的可培養細菌中32.21%為潛在新種，說明冰川是一個極好的微生物資源庫［40］，可以為冰凍圈微生物資源開發及利用提供數據支撐及菌種資源。目前，冰川消融的情況十分嚴峻，在冰川消失前相關領域的科研工作者應盡力保存微生物資源以便進一步研究和利用［41］。

3.2 不同生境中細菌群落結構差異

比較三種生境可培養細菌的多樣性指數，發現不同生境中可培養細菌多樣性不同。不同生境中可培養細菌數量差異顯著。在其他冰川也發現了類似現象，有研究表明崇測冰帽雪樣、土樣和冰磧物中的可培養細菌數量差異很大［10］；祁連山七一冰川雪和融水中的可培養細菌數量差異同樣很大［38］。冰樣中可培養細菌數量遠高于融水樣和雪樣，這可能與樣品中的非水溶性固形物有關，冰樣中非水溶性固形物含量最多，為細菌提供了穩定棲息的微環境。

在屬水平雪樣、冰樣和融水樣中發現的細菌有重合，但部分屬是單一樣品獨有的。相似結果在其他冰川也有報道，如崇測冰帽雪樣、土樣和冰磧物［10，42］；青藏高原竹溪冰川融化池和冰周河流［42］；玉龍雪山白水1 號冰川前沿土壤和融水［44］。這3 種生境重合的細菌是微桿菌屬，在其他冰川的生境中也比較常見［24，27，45］，微桿菌屬還是冬克瑪底冰川的優勢屬，其很有可能在冰川生態系統中穩定發揮重要作用。冰樣中發現的屬最多，雪樣有75%的屬與冰樣重合，融水樣有64.3%的屬與冰樣重合，雪樣只有12.55%的屬與融水樣重合；說明相比融水樣，雪樣和冰樣的群落相似度更高；且相比雪樣，融水樣和冰樣的群落相似度更高。冬克瑪底冰川9月末的平均溫度在0 ℃以下［15］，冰川雪消融較少，冰川融水大部分來自受冰體壓力和地熱融化的底層冰，導致了雪與融水細菌群落差異巨大。

3.3 可培養細菌群落結構與環境因子相關性分析

研究發現冬克瑪底冰川可培養細菌數量與Cl-、K+和Ca2+的含量，以及pH 和EC 呈正相關關系，與海拔（EL）呈反相關關系（表2）。相關研究表明，K+和Ca2+等離子濃度可代表冰雪中粉塵的含量［46-47］，粉塵不僅可作為細菌的“載體”，將微生物從冰川周圍環境中攜帶至冰川，其中還含有微生物賴以生存的營養物質，為微生物提供了生存的微生態環境。已有的研究表明pH 值同樣對細菌數量影響顯著［48-49］，主要原因可能是本次雪樣的pH 呈弱酸性，而冰和融水的pH 值均在7左右，中性的環境更適合絕大多數細菌的生存。

表2 可培養細菌多樣性與環境因子的相關性Table 2 Correlation between culturable bacterial diversity and environmental factor

研究結果表明，環境因子還會影響微生物群落的多樣性［50-51］。在之前冰川微生物相關研究中未發現多樣性與Cl-濃度的明顯相關性，但在鹽堿化土壤微生物的研究中發現了與本研究相似的結果［50］。對于pH 值與細菌多樣性的相關性，部分研究與本研究有類似的結論［52］，但還有研究結果表明pH 值與細菌多樣性在不同生境的相關關系不同［53］。pH值與細菌多樣性的相關關系受生境酸堿性影響，大多微生物更適合中性環境，環境是酸性時，pH 值與細菌多樣性是正相關關系［54-55］，環境是堿性時，pH值與細菌多樣性是負相關關系［56］。

4 結論

本研究以冬克瑪底冰川雪、冰和融水為研究對象，分離得到三類樣品中放線菌門、變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門，其中放線菌門是優勢菌門。雪樣在不同培養溫度下得到的可培養細菌數量差異不顯著；而冰樣和融水樣在不同培養溫度下得到的可培養細菌數量差異顯著。

冰樣中可培養細菌數量遠高于融水樣和雪樣，這可能與樣品中的非水溶性固形物有關，冰樣中非水溶性固形物含量最多，為細菌提供了穩定棲息的微環境。在屬水平，雪樣、冰樣和融水樣中發現的細菌有重合，雪樣和冰樣的群落相似度更高。

Cl-、K+、Ca2+、Na+和Mg2+的含量和pH 與冬克瑪底冰川可培養細菌數量和多樣性均呈正相關關系，且與Cl-、Ca2+的含量和pH 的相關性較大，這可能與冰川中粉塵的含量有關。

研究發現疑似新種49株，分離的可培養細菌中32.21%為潛在新種，說明冰川是一個極好的微生物資源庫，可以為冰凍圈微生物資源開發及利用提供數據支撐及菌種資源。

致謝：對唐古拉冰凍圈與環境觀測研究站全體成員在本研究采樣階段提供的幫助與指導表示衷心的感謝。