土壤環境中四環素抗性基因向病原菌的轉移研究

彭雙，宋丹，王一明*，林先貴

1. 江蘇開放大學環境生態學院，江蘇 南京 210017；2. 中國科學院南京土壤研究所/土壤與農業可持續發展國家重點實驗室，江蘇 南京 210008

隨著畜禽養殖的發展，中國是已成為世界上最大的畜禽養殖國，每年約有38 億噸畜禽糞便產生（Zhao et al.，2022）。將畜禽糞便還田仍是一種常見的廢物處理方式，可提高土壤肥力并增加糧食產量（Li et al.，2021）。然而，隨著抗生素在畜牧業中的廣泛應用，畜禽糞便含有大量殘留抗生素、多種抗生素抗性基因（ARGs）和重金屬（Zhu et al.，2013；Sorinolu et al.，2021；Peng et al.，2022a）。越來越多的證據表明，施用糞肥會明顯增加土壤中ARGs的種類和豐度（Peng et al.，2017；Rahman et al.，2018），導致抗生素抗性細菌和ARGs 擴散至蔬菜中（Zhang et al.，2019；Huang et al.，2021）。同時，畜禽糞肥還可能含有公共衛生相關病原體（Neill et al.，2018；Alegbeleye et al.，2020），它攜帶的人畜共患病原體可能會污染新鮮農產品（Li et al.，2020；Zhang et al.，2020），進而導致食用人群的胃腸道疾病。此外，如果這些人畜共患病原體同時攜帶ARGs和移動遺傳元件（MGE），可能會對人類健康造成更為嚴重的威脅（Zhou et al.，2019）。因此，有必要探討不同土壤環境條件下，腸道病原菌能否從施肥土壤處獲得ARGs 并在土壤中存活，這對于指導動物糞便的合理施用具有重要的意義。

細菌獲得抗生素耐藥性有兩種途徑，包括通過自發基因突變產生ARG 和通過水平基因轉移（HGT）獲得ARG。HGT 可導致ARGs 在相同或不同種屬細菌間傳遞，該過程具有速度快、周期短、范圍廣的特點，因此HGT 被視為ARGs 傳播的主要途徑（胡小婕等，2022）。因為致病細菌可以通過HGT 獲得耐藥性（Tang et al.，2023），所以ARGs的水平轉移是評估其環境風險的重要參數之一。目前大多數關于土壤或堆肥環境中ARGs 水平轉移的研究僅關注MGEs 的豐度變化特征及其與ARGs 以及細菌群落的相關性和影響因素（Zhou et al.，2021；Qiu et al.，2022；Zhang et al.，2022；Chen et al.，2023）。一些在實驗室條件下開展的研究表明，土壤礦物硼鈉石、小于100 nm 的塑料顆粒、有機污染物等物質可促進ARGs 的轉移（Wu et al.，2020；Hu et al.，2022；Li et al.，2022；胡小婕等，2022）。然而，與實驗室純培養體系相比，自然狀態下的土壤或水體環境非常復雜，其中的供體/宿主細菌及抗性質粒種類繁多，微生物的生理狀態也不同，因此量化自然環境中的ARGs 轉移頻率相對較難。質粒介導的接合基因轉移被認為是HGT 的主要機制（S?rensen et al.，2005；Thomas et al.，2005）。目前，已有研究在土壤環境中觀察到質粒的接合轉移（Krasovsky et al.，1987）。Macedo et al.（2022）將攜帶pKJK5 質粒的大腸桿菌（Escherichiacoli）與糞肥混合后施入土壤，發現質?？梢詮募S便轉移到土壤細菌，雖然轉移的頻率很低，且主要發生在施用糞肥后的4 d 內。Xu et al.（2021）向含有四環素的水培系統中接入攜帶RP4 質粒的大腸桿菌，通過熒光標記來追蹤質粒在擬南芥內生菌中的傳播，發現大腸桿菌被內化到植物組織中，RP4 質粒被轉移到植物內生細菌中，來源于土壤的細菌群落抑制了大腸桿菌的內化，但顯著促進了RP4 質粒向植物微生物組的傳播。Fan et al.（2019）將攜帶抗性質粒RP4 的惡臭假單胞菌接種到土壤微宇宙中，在75 天的培養過程中，觀察到RP4 的傳播增加，宿主細菌的多樣性增加，組成發生變化。上述研究通過向土壤/水培環境接入攜帶已知質粒的供體細菌的方式證明在環境條件下能夠發生質粒的轉移；然而，如果將環境中攜帶ARGs 的細菌視作供體，人類致病細菌是否可以通過HGT 從土壤環境或糞便獲得ARGs 目前仍然未知。因此，在自然環境條件下進行相關探索，有助于我們了解環境中的ARGs 向致病菌轉移的潛力和風險。

在腸道病原體中，沙門氏菌是通過食物和水傳播疾病的常見病原體之一（Blanco et al.，2021）。有研究表明畜禽糞便攜帶的沙門氏菌在土壤中可存活968 d（Nicholson et al.，2005）。沙門氏菌在土壤中存活時間越長，它們污染水果或蔬菜的可能性就越高。為了了解沙門氏菌在不同類型土壤中的存活時長，我們在前期研究中分析了沙門氏菌在進入3種土壤后，其存活數量的動態變化，同時探討了淹水環境對其存活的影響（Peng et al.，2022b）。由于沙門氏菌可在篩選培養基上形成黑色菌落，明顯區別于其他細菌類群，為抗生素敏感型沙門氏菌是否能夠從土壤或糞肥獲得ARGs 的研究提供了可能性。四環素是動物糞便中最常見的抗生素（Gaballah et al.，2021），豬糞中常常能夠檢出高濃度的殘留四環素和四環素抗性基因（Peng et al.，2022a）。此外，自20 世紀70 年代以來，土壤中幾乎所有類別的ARGs 都顯著增加，尤其是四環素抗性基因增加的最多（Knapp et al.，2010）。因此，在前期研究的基礎上，本研究對進入土壤90 d 后依然存活的沙門氏菌進行了四環素抗性篩選，對分離的抗性疑似沙門氏菌進行了鑒定和全基因組測序；并在實驗室純培養體系下，分析了分離菌株攜帶的四環素抗性基因向E.coliO157:H7 的轉移能力。本研究探討了人畜共患病原體從土壤環境或者來源于土壤環境的細菌處獲得ARGs 的潛力，研究結果可為科學評估土壤環境中ARGs 的轉移風險提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗設計和土壤樣品采集

供試土壤采集自3 個中國科學院農業生態實驗站，分別位于江西省鷹潭縣（28°15′N，116°55′E）、江蘇省常熟市（31°33′N，120°42′E）和河南省封丘縣（35°00′N，114°24′E）。從長期施用化肥的田間采集土樣（0—20 cm），土壤性質詳見Peng et al.（2022b），土壤質地分別為紅粘土（R）、壤土（L）和砂質壤土（S）。將土壤陰干后過5 mm 篩，將土壤含水量調節至土壤最大持水量的三分之一，取5 kg 土壤置于花盆（23 cm×22 cm）中。

鼠傷寒沙門氏菌Salmonellaentericasubsp.enteric serovar Typhimurium（CICC 21484）來自中國工業微生物菌種保藏中心（CICC），為四環素敏感型沙門氏菌。將單菌落接種到LB 肉湯中，并在37 ℃下培養約16 h。在4 ℃下離心收集菌體，用磷酸鹽緩沖液（10 mmol·L-1，pH 7.2）洗滌3 次，懸浮在無菌去離子水中，調整菌體密度后與133.82 g 新鮮豬糞（干重為40 g）混合，使新鮮豬糞中的沙門氏菌濃度達到1011CFU·g-1。將豬糞與表層土壤混合，分別在自然條件下（接收雨水）和淹水狀態下培養，每個處理重復4 次，詳見Peng et al.（2022b）。在第90 天和120 天采集0—5 cm 土壤，帶回實驗室進行四環素抗性菌株的分離和鑒定。

1.2 土壤中四環素抗性疑似沙門氏菌菌株的分離和生理生化鑒定

將5 g 新鮮土壤樣品添加到50 mL 磷酸鹽緩沖液（10 mmol·L-1，pH 7.2）中，并在180 r·min-1條件下振蕩30 min。取0.5 mL 土壤懸浮液涂布到添加四環素的木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂（中國，海博）平板上，并在37 ℃下培養過夜。XLD平板中四環素濃度為8 μg·mL-1，在這個濃度下，土壤中的四環素抗性細菌數量約為106CFU·g-1干土（Peng et al.，2016）。沙門氏菌一般在XLD 上形成黑色菌落，該方法的檢測限約為100 CFU·g-1干土。經平板涂布培養法檢測，供試土壤和新鮮豬糞中均不含能夠在XLD 培養基上形成黑色菌落的細菌。

使用從青島海博生物購買的HBI 沙門氏菌生化鑒定條（HBIG01）、西蒙氏枸櫞酸鹽試驗和吲哚試驗對分離的抗性細菌進行生理生化鑒定，相關操作根據產品說明書進行，每株菌3 個重復。同時，用HE 瓊脂、沙門氏菌顯色培養基、SS 瓊脂、亞硫酸鉍BS 瓊脂、麥康凱MAC 和三糖鐵TSI 等篩選培養基培養，以鼠傷寒沙門氏菌SalmonellaTyphimurium （CICC 21484）作為對照，觀察分離菌株在不同培養基上的形態特征。

1.3 DNA 提取、ARGs 檢測和四環素抗性菌株16S測序鑒定

將分離的菌株劃線接種到XLD（含8 μg·mL-1四環素）平板上，37 ℃過夜培養；挑單克隆到裝有50 mL LB（含8 μg·mL-1四環素）的三角瓶中，振蕩培養8h，將菌液轉移到50 mL 無菌離心管中，8 000 g 離心10 min，棄上清，用無菌水洗兩次，用細菌基因組DNA 提取試劑盒（TransGen Biotech,Beijing）提取DNA。土壤或豬糞DNA 分別用FastDNA?SPIN Kit for soil/feces（MP Biomedicals，Santa Ana，CA）試劑盒提取，用HT-qPCR 方法（Peng et al.，2022a）檢測土壤、豬糞和四環素抗性菌株是否攜帶329 ARGs 和35 MEGs。

用細菌16S rRNA 基因通用引物27F/1492R（Popowska et al.，2012）擴增菌株的16S rRNA 基因，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳驗證，得到與預期相符的條帶，并連接到pEASY-T3 載體上（TransGen Biotech，Beijing），然后克隆到Trans1-T1 感受態細胞中（TransGen Biotech，Beijing），挑取陽性轉化子，PCR 驗證其攜帶的條帶大小，然后將正確的陽性轉化子送交華大基因進行Sanger 測序鑒定。

1.4 全基因組測序和基因注釋

全基因組測序工作由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成，采用單分子測序技術，測序平臺為PacBio 和Illumina，使用SMRT Link v5.0.1 軟件對reads 進行組裝，得到初步組裝結果，把reads比對到組裝序列上，統計測序深度的分布情況，根據序列長度及比對的方法區分初步組裝的序列為染色體序列還是質粒序列，并檢驗序列是否成環。使用GeneMarkS 軟件（http://topaz.gatech.edu/）進行細菌的編碼基因預測?；驆u可以編碼多種功能，涉及共生關系和發病機理，還能提高生物的適應性。使用軟件IslandPath-DIOMB 預測基因島。整合在宿主基因組上的溫和噬菌體的核酸稱之為前噬菌體，通過軟件phiSpy 預測前噬菌體。分別使用Diamond 軟件和Resistance Gene Identifier（RGI）軟件，與ARDB 和CARD 數據庫進行比對，對ARGs進行注釋。使用Diamond 軟件，與VFDB 數據庫進行比對，注釋毒力因子信息。使用PlasmidFinder（https://cge.food.dtu.dk/services/PlasmidFinder/）注釋質粒分型。T2 菌株的全基因組測序結果已經提交至NCBI 數據庫（SUB12441302）。

1.5 四環素抗性菌株的抗性基因轉移實驗

將培養12 h 的T2 和四環素敏感型E.coliO157:H7（CICC 10907）菌液離心，收集菌體并用磷酸鹽緩沖液（10 mmol·L-1，pH 7.2）洗滌3 次，用磷酸鹽緩沖液將菌體重懸，制備成菌懸液，兩種菌懸液的濃度均為109CFU·mL-1。參照Wang et al.（2019）的方法將等體積的T2 與E.coliO157:H7 菌懸液混合共培養，并添加鹽酸四環素使混合液中的四環素濃度分別為0、0.05、0.5、1、5、8、10、20 和40 μg·mL-1。將混合菌液置于25 ℃培養12、24、120 h后，重新懸浮菌體，取100 μL 共培養菌液，分別涂布于添加四環素（終濃度為8 μg·mL-1）的XLD 和O157 顯色培養基（青島，海博），同時在不含四環素的兩種平板上涂布混合菌液和O157 作為對照，以計算混合菌液中T2 和O157 的數量并確認平板中的抗生素有效。利用T2 和E.coliO157:H7 在含或不含四環素的XLD 和O157 顯色培養基上形成不同顏色的菌落來區分供體、受體和接合子：XLD 平板上T2 菌落呈黑色，O157 菌落呈黃色；在O157 顯色培養基上，T2 菌落呈藍色，O157 菌落為淺紅色。

2 結果與分析

2.1 土壤和豬糞中ARGs 的構成和含量

為了充分了解3 種土壤和豬糞中的ARGs 和MGEs 組成，用HT-qPCR 方法檢測了豬糞和施用豬糞第1 天的土壤樣品（未淹水處理組）中的329 ARGs 和35 MEGs。豬糞中檢測到183 種ARGs，26 種MGEs；3 種土壤樣品中分別檢測到146（L）、152（S）、166（R）種ARGs 和20（L）、22（S）、24（R）種MGEs。土壤和豬糞中不同類型ARGs 的總相對豐度如圖1 所示，豬糞中含量最多的是氨基糖苷類抗性基因（Aminoglycoside），占比34.8%，其次為四環素類抗性基因（Tetracycline），占比30.8%。土壤中四環素類ARGs 在3 種土壤中占比分別為47.3%（R）、30.6%（L）和21.4%（S），氨基糖苷類ARGs 占比分別為18.0%（R）、22.1%（L）和25.5%（S）。其中，tetW、tetO和ermB是土壤和豬糞樣品中平均豐度最高的ARGs；tnpA-06/IS1216和tnpA-04/IS6100是平均豐度最高的MGEs。

圖1 豬糞和施用豬糞第1 天的土壤中ARGs和MGEs 的總相對豐度Figure 1 The relative abundance (ARG copies/16S rRNA gene copies) of ARGs and MGEs detected in pig manure and different types of soils under natural condition collected on the first day

2.2 土壤中四環素抗性疑似沙門氏菌菌株的分離和生理生化鑒定

在施肥后的第90 天，通過添加四環素的XLD平板篩選，僅在不淹水的紅粘土中分離得到3 株能在XLD 平板上形成黑色菌落的四環素抗性疑似沙門氏菌，該抗性疑似沙門氏菌形成的菌落相對較小，生長較慢；該時期該處理土壤中存活的沙門氏菌數量為 (4.89±1.89)×104CFU·g-1干土。用沙門氏菌生化鑒定條和篩選培養基分別對分離到的這3 株抗性菌進行生理生化鑒定，結果如表1 所示，3 株抗性菌株可產生半乳糖苷酶，能分解鄰硝基酚-半乳糖苷（ONPG），生成黃色的鄰硝基酚，且不能利用西蒙氏枸櫞酸鹽，吲哚陽性，在這些生理生化特性上，與實驗添加的沙門氏菌存在差異，根據這些特性初步判斷3 株抗性菌為大腸桿菌。在施肥后的第120 天，未分離到具有四環素抗性的疑似沙門氏菌。

表1 沙門氏菌、大腸桿菌和3 株四環素抗性菌的生理生化鑒定結果Table 1 Physiological and biochemical identification results of Salmonella, E. coli and three tetracycline resistant strains

2.3 四環素抗性菌株的測序鑒定和ARGs 檢測結果

對菌株的基因組進行16S rRNA 基因擴增，擴增產物經克隆測序后，將測得的序列在NCBI 數據庫中比對，結果如表2 所示，3 個抗性菌株與大腸桿菌的相似度均達到99%，說明3 株抗性細菌均為能夠產生H2S 的大腸桿菌，而不是獲得四環素抗性的沙門氏菌。

表2 3 株四環素抗性菌測序和NCBI 比對結果Table 2 Sequencing and NCBI comparison results of three tetracycline resistant strains

通過HT-qPCR 檢測方法，用329 對ARGs 和35 對MEGs 引物對3 株菌的DNA 進行了檢測（部分ARG 種類有多條檢測引物）。T1、T2 和T3 分別有55、64 和63 個ARG 引物檢出陽性，其中包含了38、44 和43 種ARGs（表3）。T1、T2 和T3 分別攜帶7、11 和10 個MGEs，其中T3 攜帶的10 種MGEs 在T2 中均能檢測到。如表3 所示，有37 種ARGs 和5 種MGEs 在3 株菌中共有，此外，3 株菌分別攜帶一些特有ARGs 和MGEs。根據3 株菌攜帶的ARGs 數量，選擇T2 進行全基因組測序，以進一步了解該菌的基因構成和ARGs 分布位點。

表3 3 株四環素抗性菌攜帶的ARGs 和MGEs 檢測結果Table 3 ARGs and MGEs carried by the three tetracycline resistant strains detected by HT-qPCR

2.4 抗性菌株T2 的全基因組分析

將 T2 菌株進行全基因組測序，共得到867 963 947 bp Clean Data，平均序列讀長為8 951 bp，經生物信息學分析后，該菌株含有一個4.723 Mb 的染色體（GC 含量為50.88%）和兩個長度分別為40.48kb（GC 含量為44.87%）和93.31 kb（GC含量為51.09%）的質粒，三者均為環狀結構（圖2）。共含有4690 個編碼基因、30 個CRISPR 序列（均位于染色體上），15 個基因島（其中1—13 位于染色體，14 和15 分別位于兩個質粒上），8 個前噬菌體（均位于染色體上），170個非編碼RNA（指tRNA、rRNA 及sRNA 等3 種），217 個散在重復序列。

圖2 T2 菌株染色體和質粒圈圖Figure 2 Chromosome and plasmid circle diagrams of strain T2

使用Diamond 軟件，把T2 的4 690 個基因的氨基酸序列，與NR 數據庫進行比對，把T2 的基因和其相對應的功能注釋信息結合起來，總共有4 653 個基因在NR 數據庫得到注釋，其中有3 512個基因與Escherichia coli的基因相似，595 個基因與Achromobactersp 基因相似。該注釋結果進一步驗證了16S rRNA 基因測序鑒定結果，證實該菌株為大腸桿菌。該菌株攜帶的兩個質粒序列經過blast比對，結果如表4 所示，兩個質粒均與大腸桿菌攜帶的質粒序列高度相似，其中質粒1 攜帶的部分序列與沙門氏菌相似。使用PlasmidFinder 對兩個質粒的分型進行檢索，結果質粒1 為IncX1 型質粒（相似度98.93%），質粒2 為IncY 型質粒（相似度99.48%）。

表4 T2 菌株攜帶的兩個質粒序列比對結果Table 4 Sequence comparison results of the two plasmids carried by strain T2

全序列與COG、GO、KEGG、Pfam、Swiss-Prot、Nr 等通用數據庫比對，其中，與COG 數據庫比對得到了3 807 個注釋基因，包含前噬菌體和轉座子共197 個；與KEGG 數據庫比對，得到4586 個注釋基因，其中包含了多個對人類致病的基因，例如幽門螺桿菌感染中的上皮細胞信號轉導基因、軍團菌病、百日咳、沙門氏菌感染、肺結核基因等。再將序列與ARDB、CARD、VFDB 和PHI 等功能數據庫比對，得到ARDB 注釋基因34 個（相似度大于98%）、CARD 注釋基因62 個（相似度大于91%）（表5），438 個VFDB 毒力因子，和440 個經PHI注釋的病原體與宿主互作蛋白。注釋的ARGs 中包括了3 種四環素抗性基因，均位于質粒2 上，但是兩個數據庫的比對結果存在差異。

表5 菌株T2 的全基因組序列與ARDB、CARD 比對后注釋的ARGsTable 5 Antibiotic resistance gene annotated after comparing the whole genome sequence of strain T2 with ARDB and CARD

2.5 四環素抗性菌的基因轉移

將T2 菌體與E.coliO157:H7（四環素敏感型）菌株共培養，并施加不同濃度梯度的四環素，觀察T2 菌株能否將四環素抗性基因轉移到E.coliO157:H7。實驗結果表明，在0、0.05、0.5、1、5、8、10、20 和40 μg·mL-1四環素作用下，均未分離到獲得四環素抗性的E.coliO157:H7。說明T2 與E.coliO157:H7 在共培養期間，T2 攜帶的四環素抗性基因沒有轉移到O157 菌株。

3 討論

3.1 在土壤環境中，沙門氏菌未通過HGT 獲得四環素抗性基因

細菌病原體對抗生素的耐藥性發展使危及生命的細菌感染的治療大大復雜化（O’Neill，2014），因此抗菌藥物耐藥性被認為是21 世紀全球衛生面臨的主要挑戰之一（Berendonk et al.，2015）。人類攜帶的抗性共生菌或致病菌被認為可以通過食物鏈或環境在人和動物之間直接或間接交換傳播；動物和人類之間的聯系，以及環境在促進這種聯系方面的重要性，被稱為“One Health”框架（Hernando-Amado et al.，2019）。在“One Health”框架下，了解ARGs 在環境中的歸趨及其向人類致病菌的轉移潛力對于評估ARGs 的潛在風險和控制ARGs 在環境中的轉移擴散至關重要。本研究通過向3 種土壤施入含有大量沙門氏菌的糞肥的方式，嘗試了解糞肥及土壤中的四環素抗性基因轉移到沙門氏菌中的可能性。結果表明，在土壤中存在大量沙門氏菌受體的情況下，無論土壤是否處于淹水狀態，沙門氏菌沒有從糞肥和土壤處獲得四環素抗性基因并在土壤中長期存活。研究表明，土壤細菌群落結構是 ARGs 含量的主要決定因素，而不是 HGT（Forsberg et al.，2014）。盡管土壤微生物攜帶多種ARGs，但僅有少數與人類病原體共有，而且這些基因在土壤群落內以及從土壤向其他細菌的傳播并不常見（Sommer，2014）。ARGs 已被公認為環境中的新型污染物，雖然HGT 是ARGs 傳播與擴散的主要途徑，但其常受環境條件變化和共存物質的影響（胡小婕等，2022）。據報道，ARGs 的轉移頻率可能受各種非抗生素條件的影響，例如環境溫度和pH、環境介質的特征、額外的電場和聲場等（Shi et al.，2022）。因此，在自然條件下精確評估HGT 在環境ARGs 的擴散中發揮的作用，對于我們科學評估環境中ARGs 的轉移風險至關重要。

絕大多數沙門氏菌可以產生硫化氫（hydrogen sulfide，H2S），因此，H2S 是初篩與鑒定沙門菌的重要生化指標。XLD 瓊脂培養基是常見的用來鑒別和篩選沙門氏菌的培養基，在堿性的條件下，培養基中的硫代硫酸鈉及檸檬酸鐵銨與沙門氏菌產生的H2S 反應，使菌落的顏色呈黑色。我們從紅壤中分離到3 株具有四環素抗性且能夠產生H2S 的細菌，但是經過生理生化和測序鑒定，最終確定為大腸桿菌，而不是獲得抗性的沙門氏菌。大腸桿菌是和臨床關系最為密切的細菌之一，與畜牧獸醫、公共衛生有關，長期以來一直作為糞源性細菌污染的衛生指標，是國際上公認的衛生監測指示菌。大腸桿菌一般不產H2S，近年來也偶見產H2S 大腸桿菌的報道（張曉玲等，2021）。有研究表明，H2S 的產生在大腸桿菌中是由質粒介導的（Bouanchaud et al.，1975），而且一些菌株可以通過質粒轉移將此特性傳遞給不產H2S的大腸桿菌（Harnett et al.，1996）。H2S 是一種可自由穿梭細胞的小分子，擴散性強。已有研究指出，H2S 不僅是細菌硫代謝的副產物，還在大腸桿菌、沙門菌耐藥過程中發揮重要作用，H2S 可利用其還原性清除抗生素氧化應激反應產生的活性氧物質（ROS），發揮細菌耐藥作用（吳府麗，2017）。沙門菌中，phs操縱子編碼硫代硫酸鹽還原酶，由phsA、phsB和phsC等3 段基因組成，是沙門菌產生H2S 的重要功能基因（吳府麗，2017）。我們在T2 菌株的質粒2 上也發現了phsA、phsB和phsC基因，且與 TCDB 數據庫中Salmonellatyphimurium 攜帶的基因一致；此外，在添加沙門氏菌之前，土壤和豬糞中并未檢測到能夠產生H2S 的菌株。因此，我們推測可能是T2 從添加的沙門氏菌處獲得了這3 段基因，從而獲得了產生H2S 的能力；這可能暗示著在土壤環境中大腸桿菌能夠通過自然轉化（細菌從環境中直接攝取游離DNA 并獲得相應的遺傳特征）或基因轉移獲得特定功能；也暗示著大腸桿菌從環境中獲得基因的潛力可能高于沙門氏菌。

土壤是“One Health”框架下一個極其重要的組成部分，通過與人類和/或動物相關微生物的相互作用，ARGs 逐漸富集并可能最終流入人類食物鏈（Wang et al.，2022）。盡管我們在3 種土壤中都未發現沙門氏菌從土壤或糞肥處獲四環素抗性功能，但是并不排除有其他類型ARGs 發生轉移的可能性。此外，未淹水土壤中沙門氏菌初始濃度約為108CFU·g-1干土，因為不能適應土壤環境，其數量在施肥14 d 后逐漸減少，大多數在施入土壤后90 d 內死亡（Peng et al.，2022b），因此本研究只關注了90 d 后仍然存活的沙門氏菌是否獲得了耐藥性，對于施肥后90 d 內是否有沙門氏菌從土壤獲得ARGs 并未關注。Pornsukarom et al.（2017）從施用豬糞7—21 d 的土壤中分離到多株攜帶IncF1 質粒的耐藥沙門氏菌，且它們攜帶的質粒都可以通過培養體系下的接合轉移實驗傳遞給E.coliJM109?？紤]到各種生物和非生物因素，腸道病原體在土壤中的存活率是高度可變的，為了避免糞肥中的病原微生物直接或通過食物鏈間接對人造成感染，應該盡可能地延長施肥和收獲間隔，讓帶入農田的病原微生物數量得到充分削減。

3.2 在純培養體系下，從土壤中分離的T2 菌株未向病原菌E.coli O157:H7 轉移四環素抗性基因

水平基因轉移（HGT）在ARGs 的傳播中起著重要作用，其中接合轉移被認為是ARGs 在環境中傳播的主要方式之一。在本研究中，分離到的3 株四環素抗性菌均攜帶多種ARGs（表3），對其中攜帶ARGs 種類最多的T2 進行全基因組測序，明確T2 攜帶了兩個質粒并且質粒上攜帶了多個四環素抗性基因（表5）。為了了解T2 菌株攜帶的四環素抗性基因的轉移潛力，在施加不同濃度四環素的條件下，將其與四環素敏感型E.coliO157:H7 菌株共培養，結果未觀察到T2 菌株的四環素抗性基因發生轉移。目前，關于耐藥基因接合轉移的研究多采用的是純培養的供體和/或受體細菌，研究的質粒以RP4 質粒（Jia et al.，2021；Zhang et al.，2022；Zhai et al.，2022；Liu et al.，2023）或pUC 質粒（Fang et al.，2022；Wang et al.，2022）較為多見。不同的質粒有不同的宿主范圍，這在一定程度上可能影響質粒的轉移效率，RP4 質粒是一種典型的IncP-1α類質粒，IncP-1 和IncQ-1 類型質粒宿主范圍較寬，為泛宿主質粒（broad-host-range plasmids），且常含有抗生素抗性特征，由于它們可以有效的接合轉移并在廣泛的宿主中穩定復制，因此被認為有助于水平基因轉移（Dungan et al.，2020）。所有革蘭氏陰性菌都是IncP 和IncW 質粒的潛在宿主（Droge et al.，2000）。本研究分離的T2 攜帶的兩個質粒經過序列比對與數據庫中大腸桿菌攜帶的質粒非常相似（表4），經過PlasmidFinder 分型發現兩個質粒分別屬于IncX1 和IncY 型，IncX 質?？勺匪莸角翱股貢r代，是腸桿菌科的狹宿主質粒（narrowhost-range plasmids），它們編碼IV 型菌毛，使其自身能夠接合轉移，并為宿主細菌提供輔助功能，如抗微生物藥物耐藥性和生物膜形成（Johnson et al.，2012）。IncY 質粒也屬于狹宿主質粒（Hawkey，2008），在腸桿菌科中比較常見，如大腸桿菌、沙門氏菌和肺炎克雷伯桿菌等（Zhang et al.，2017）。除了質粒的宿主范圍之外，供體細菌攜帶的質粒轉移潛力對接合轉移的發生頻率也很重要，結合質粒（conjugative plasmid）可編碼結合系統控制基因，該基因可以促使細菌自發地進行接合（Li et al.，2022），例如RP4 質粒是一種IncP 類泛宿主質粒，該IncP 質粒的接合轉移取決于trfA和trbB基因的產物（Qiu et al.，2012）。有研究報道，IncF、IncA/C、IncL/M、IncI1、IncHI2 和IncN 質粒家族是與腸桿菌科耐藥性在全球范圍內傳播特別相關的質粒家族（Bustamante et al.，2017）。因此，需要進一步研究不同類型質粒的轉移潛力及其在環境ARGs 的傳播擴散中發揮的作用。

此外，純培養體系下細菌質粒接合轉移的研究方法也有多種，例如Pornsukarom et al.（2017）在接合轉移實驗中進行了42 ℃熱激處理；而其他一些研究則只是將受體和供體菌株在培養液中混合培養（Lin et al.，2016；Zhang et al.，2022；Alvarez-Molina et al.，2023）；為了避免細菌繁殖，在另外一些研究中用磷酸鹽緩沖液（Wang et al.，2019；Jia et al.，2021；Yan et al.，2023；Li et al.，2023）或生理鹽水（Chen et al.，2019；Zhai et al.，2022）替代培養液。接合實驗的反應條件，包括初始細菌濃度，供體細菌與受體細菌的比率，養分供應，實驗體系的溫度和pH，接合時間的長短等都可能對細菌質粒的接合轉移頻率產生影響。本研究將T2 和E.coliO157:H7 在磷酸鹽緩沖液中共培養，并在實驗體系中加入不同濃度的四環素，但是均未分離到接合子。因此，需要進一步優化接合轉移實驗條件，以進一步分析T2 攜帶的兩個質粒的轉移潛力及其影響因素。此外，還需要建立合適的ARGs 水平轉移實驗體系，模擬真實的環境條件，綜合利用多種技術對ARGs 的接合、轉化和轉導進行跟蹤和檢測。

4 結論

1）向3 種土壤施入含有大量沙門氏菌的豬糞，無論土壤是否處于淹水狀態，沙門氏菌均未從糞肥和土壤處獲得四環素抗性基因并在土壤中長期存活；說明自然條件下，沙門氏菌通過HGT 從土壤環境獲得抗性基因并長期存活的可能性很小。

2）從紅壤中分離到3 株具有四環素抗性且能夠產生H2S 的細菌，經過生理生化和測序鑒定，最終確定為大腸桿菌；經HT-qPCR 檢測，T1、T2 和T3 分別攜帶38、44 和43 種ARGs，7、11 和10 個MGEs。

3）對T2 進行全基因組測序與分析，結果表明T2 攜帶了兩個長度分別為40.48kb 的IncX1 型和93.31kb 的IncY 型質粒，15 個基因島，前噬菌體和轉座子共197 個；經ARDB 注釋獲得34 個ARGs，其中包括了2 種四環素抗性基因均位于IncY 型質粒上。

4）將T2 菌體與四環素敏感型E.coliO157:H7菌株共培養，在施加不同濃度四環素的條件下，T2攜帶的四環素抗性基因沒有向E.coliO157:H7 菌株轉移。