不飽和脂質氮雜環丙烷化反應中間體的原位質譜分析

陳凱祥,魏是奇,陳素明

(武漢大學高等研究院,湖北 武漢 430072)

脂類物質是一類重要的生物分子,在生物系統中發揮著關鍵作用[1-2],它們不僅是生物膜的重要組成成分,還在能量儲存、信號轉導等生物過程中扮演著重要角色[3-4]。不飽和脂質是包含1個或多個碳-碳雙鍵的脂質亞類,脂質雙鍵的位置對其結構和功能有著重要影響,精確解析脂質雙鍵異構體是深入理解不飽和脂質生物學功能的前提[5]。質譜(mass spectrometry, MS)是分析脂質結構的有力工具[6-7]。有研究表明,烯烴的臭氧分解反應[8]、Paterno-Büchi反應[9]、環氧化反應[10]、交叉復分解反應[11]等均可用于脂質雙鍵的活化和衍生,結合串聯質譜可進行雙鍵位置異構體的分析。其中,烯烴的氮雜環丙烷化反應是最新發現的一種脂質雙鍵衍生方法[12-14]。

本工作擬利用θ型毛細管代替常規納升靜電噴霧離子化質譜(nESTASI-MS)裝置中的普通玻璃毛細管[19-20],使θ毛細管兩側的溶液在電噴霧時進行在線混合和反應,然后進入質譜分析,以便捕獲反應過程中的短壽命中間體。同時,以N-Me-DPH為胺化試劑,磷脂酰膽堿(PC 18∶1/18∶1)為代表性底物,研究N-Me氮雜環丙烷化反應的中間過程,希望為闡明氮雜環丙烷化反應機理提供數據支持。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

Orbitrap Elite LTQ XL高分辨質譜儀:德國Thermo Fisher Scientific公司產品,配有Xcalibur 4.1數據處理系統;DDS數字合成函數信號發生器:中國國睿安泰信公司產品;10HVA24高壓放大器:美國Advanced Energy公司產品;24 V直流電源:廣東粵海電子公司產品;P-97拉針儀:美國Sutter公司產品。

1.2 主要材料與試劑

磷脂酰膽堿PC 36∶2(18∶1 (Δ9)/18∶1 (Δ9))、PC 34∶1 (16∶0/18∶1 (Δ9)):美國Avanti Polar Lipids公司產品;三氟乙醇(TFE):純度為99.9%,北京伊諾凱科技有限公司產品;N-Me-DPH、Rh2(esp)2:上海畢得醫藥科技有限公司產品;θ毛細管:美國Harvard Apparatus公司產品。

1.3 實驗方法

使用拉針儀拉制毛細管,制備適用于nESTASI-MS的θ毛細管(1.5 mm×0.13 mm×0.17 mm),使其一端呈尖銳形狀,作為反應底物的容器和nESTASI-MS的發射器。拉針儀參數條件為:HEAT=523,PULL=15,VEL=14,TIME=150。實驗時,將θ毛細管固定在適配臺上,使其尖端正對質譜儀的離子進樣口,距離約8 mm;毛細管尖端的下方放置1個垂直向上的圓形盤鉑電極(外層為聚四氟乙烯材料,內部鉑電極直徑為2 mm),毛細管與電極的距離約5 mm;電極與脈沖高壓裝置(方波,頻率385 Hz,電壓8 kV)相連,從而在毛細管下方產生脈沖高壓電場。檢測樣品時,在θ毛細管兩側通道各裝入10 μL對應底物溶液,打開脈沖高壓電源,毛細管尖端會形成靜電噴霧使分析物離子化后進入質譜分析,噴霧持續時間在2 min以上。

1.4 質譜條件

正離子模式,質量掃描范圍m/z100～2 000,最大離子注入時間100 ms,分辨率60 000。

2 結果與討論

2.1 基于θ毛細管的納升靜電噴霧離子化質譜分析裝置的構建

基于θ毛細管的nESTASI-MS分析裝置示意圖示于圖1。當打開高壓電源時,在θ毛細管和質譜儀進樣口之間形成強大的脈沖電場,導致靜電電荷在毛細管尖端裸露的溶液表面累積。有研究[21]表明,當溶液表面的電荷累積過多時,表面張力將不足以阻止帶電液滴形成噴霧,此時會突然形成靜電噴霧使溶液中的待測分子離子化而被質譜檢測。θ毛細管兩側的溶液會同時受到靜電場的作用而噴射出來,并在管口處混合。因此,如果兩側裝有不同的反應試劑,可以監測溶液在線混合后的反應過程。

圖1 基于θ毛細管的納升靜電噴霧離子化質譜裝置示意圖Fig.1 Schematic of nano-electrostatic spray ionization-mass spectrometry device based on θ capillary

在θ毛細管兩側分別裝入TFE和1 mmol/L PC 36∶2溶液,打開電源后,可以穩定地觀測到PC 36∶2的質譜圖,其中m/z786.603 0、808.582 3分別是PC 36∶2的質子化離子和鈉離子加合離子,初步驗證了該裝置的可行性,示于圖2a。然后,測試該裝置對2種溶液的檢測能力,當在θ毛細管兩側分別裝入1 mmol/L PC 34∶1、PC 36∶2溶液時,可同時觀測到2種物質的質譜峰,m/z782.567 9、808.581 5分別是PC 34∶1、PC 36∶2的鈉離子加合峰,示于圖2b。該θ毛細管2個通道中的分析物可在噴霧離子化過程中混合,然后進入質譜檢測,大大縮短了2種反應物混合后的停留時間,為成功捕獲反應過程中短壽命中間體提供了條件。

注:a.θ毛細管兩側分別裝入三氟乙醇和PC 36∶2溶液;b.θ毛細管兩側分別裝入PC 34∶1和PC 36∶2溶液圖2 基于θ毛細管的nESTASI-MS裝置驗證Fig.2 Validation of the θ capillary-based nESTASI MS setup

2.2 不飽和脂質的直接N-Me氮雜環丙烷化反應過程中間體研究

以PC 36∶2和N-Me-DPH為反應物,Rh2(esp)2為催化劑,研究不同混合模式下的N-Me氮雜環丙烷化反應過程。根據文獻[17]推測的氮雜環丙烷化反應機理,PC 36∶2的N-Me氮雜環丙烷化反應可能的中間過程示于圖3。首先,N-Me-DPH與催化劑Rh2(esp)2反應生成銠-氮烯中間體1,同時失去1分子二硝基苯酚;然后,中間體1與PC 36∶2的雙鍵作用,形成含有第1個C-N鍵的三元雙自由基中間體2;最后,形成第2個C-N鍵,Rh-N鍵斷裂,生成含1-甲基氮丙啶結構的產物。其中,中間體1和中間體2是該反應可能的中間體,但尚缺乏直接證據。

圖3 Rh2(esp)2催化下PC 36∶2與N-Me-DPH的氮雜環丙烷化反應可能的中間過程Fig.3 Possible intermediate process in the Rh2(esp)2-catalyzed aziridination reaction of PC 36∶2 with N-Me-DPH

用θ毛細管nESTASI-MS裝置研究反應過程。在第1種混合模式下,以TFE為溶劑,將催化劑Rh2(esp)2與N-Me-DPH溶液預混合,使二者濃度分別為0.1、1 mmol/L,裝入θ毛細管的一側,將1 mmol/L PC 36∶2溶液裝入另一側,然后進行nESTASI-MS分析,結果示于圖4。在質譜圖中僅觀察到PC 36∶2的質子化峰(m/z786.600 7)和鈉離子加合峰(m/z808.582 6),未檢測到相關中間體和產物質譜峰。

圖4 第1種混合模式下的θ毛細管nESTASI 質譜圖Fig.4 θ Capillary-based nESTASI mass spectrum in the first mixing mode

在第2種混合模式下,將PC 36∶2與催化劑Rh2(esp)2溶液預混合,使二者濃度分別為1、0.1 mmol/L,裝入θ毛細管的一側,將1 mmol/LN-Me-DPH溶液裝入另一側,然后進行nESTASI-MS分析,結果示于圖5?？梢?檢測到銠-氮烯中間體1的加氫峰(m/z788.117 9)和加鈉峰(m/z810.589 6),氮雜環丙烷化產物的加氫峰(m/z815.627 7),以及三元雙自由基中間體2的質子化離子峰(m/z1 573.719 0)。通過對中間體1進行串聯質譜分析,進一步確證其結構,示于圖5c。雖然PC 36∶2含有2個雙鍵,但僅單個雙鍵發生反應的產物是主要產物,且任一雙鍵發生反應的產物質量數均相同。此外,還檢測到2個雙鍵同時發生反應的產物,其質子化離子峰為m/z844.652 2,示于圖5d。雖然其強度僅為單個雙鍵反應產物的10%,但可為多個雙鍵位置的同時鑒定提供可能。

注:a.低質量區;b.高質量區;c.中間體1的二級質譜圖;d.PC 36∶2單個雙鍵反應產物和2個雙鍵反應產物質譜圖圖5 第2種混合模式下的θ毛細管nESTASI 質譜圖Fig.5 θ Capillary-based nESTASI mass spectra in the second mixing mode

在第3種混合模式下,將PC 36∶2與N-Me-DPH預混合,使其濃度均為1 mmol/L,裝入θ毛細管的一側,將0.1 mmol/L催化劑Rh2(esp)2裝入另一側,然后進行nESTASI-MS分析,結果示于圖6?？梢?檢測到中間體1的加氫峰(m/z788.118 6)和加鈉峰(m/z810.590 5),以及產物的加氫峰(m/z815.628 8),表明在這種混合模式下可以發生反應,但產物的量較少。

注:a.低質量區;b.高質量區圖6 第3種混合模式下的θ毛細管nESTASI 質譜圖Fig.6 θ Capillary-based nESTASI mass spectra in the third mixing mode

僅在第1種混合模式下未觀察到中間體和產物,推測N-Me-DPH與Rh2(esp)2混合可能會使催化劑失活,繼而影響N-Me-DPH與PC 36∶2的進一步反應。同時,也體現了本工作開發的具有在線混合反應功能的θ毛細管nESTASI-MS裝置的優勢。

2.3 N-Me氮雜環丙烷化反應用于脂質雙鍵位置的鑒定

N-Me氮雜環丙烷化衍生可以在雙鍵處生成1-甲基氮丙啶結構,該結構在質譜碰撞誘導解離(CID)過程中容易發生斷裂,生成指示雙鍵位置信息的碎片離子。本研究以PC 36∶2為例,考察其氮雜環丙烷化產物的質子化離子在CID模式下的解離行為。衍生產物離子的CID-MS/MS譜圖示于圖7a,出現了2個較高的質譜峰m/z756.555 1和632.562 5,分別是產物離子失去磷酸膽堿頭基末端的N(CH)3和整個磷酸膽堿頭基得到的。同時,在1-甲基氮丙啶結構處斷裂得到的碎片離子m/z506.421 6豐度較低。以上結果表明,相較于衍生的氮丙啶結構,PC的磷酸膽堿頭基在CID過程中更易丟失。為得到相對豐度更高的雙鍵診斷離子,進一步對丟失頭基的碎片離子m/z632.562 5進行CID,得到PC 36∶2衍生產物的三級質譜圖,示于圖7b。在此條件下,氮丙啶結構發生了明顯碎裂,分別得到靠近?；撕图谆说腃-N鍵斷裂生成的碎片離子m/z477.394 3和506.420 8。通過碎片離子質量可以判斷雙鍵的位置在Δ9位。由于PC 36∶2另1條脂肪鏈上的雙鍵位置也在Δ9位,因此無論是哪1個雙鍵被衍生,得到的產物碎片離子均相同。從衍生產物離子的二級和三級質譜圖上沒有觀察到指示其他雙鍵位置信息的離子,表明PC 36∶2中沒有雙鍵在其他位置的脂肪鏈。因此,推測PC 36∶2的精確結構是PC 18∶1 (Δ9)/18∶1 (Δ9)。

注:a.CID-MS/MS譜圖;b.CID-MS3譜圖;c.可能的碎裂途徑圖7 PC 36∶2氮雜環丙烷化衍生產物用于CC鍵位置的鑒定Fig.7 Location identification of CC bond by aziridination product of PC 36∶2

甲基取代的氮丙啶結構具有較高的質子親和勢(934.8 kJ/mol)[22],因此,不飽和脂質進行氮雜環丙烷化標記后,在電噴霧質譜分析中具有較高的靈敏度,可以提高復雜體系中脂質雙鍵異構體的鑒定效率。本課題組[12]研究表明,N-Me氮雜環丙烷反應結合液相色譜-質譜聯用法可實現人血清中大量脂質異構體的鑒定。將本研究的基于納升靜電噴霧離子化的直接進樣方法,與N-Me氮雜環丙烷化衍生反應相結合,可用于復雜生物樣本中脂質雙鍵異構體的鑒定。

3 結論

本工作使用基于θ毛細管的納升靜電噴霧離子化質譜分析裝置,實現了不同反應物的在線混合和質譜監測,通過研究不同混合模式下的氮雜環丙烷化反應過程,直接觀測到了N-Me氮雜環丙烷化反應過程中的銠-氮烯中間體和三元雙自由基中間體,為該反應機理的確證提供了關鍵信息,該裝置也為反應過程中短壽命中間體的捕獲和鑒定提供了有效方法。