微納米塑料與細胞的相互作用的研究進展

劉元元,劉 杰,王海芳

(上海大學納米化學與生物學研究所,上海 200444)

塑料的性能好、成本低、易于生產,因此用途廣泛,應用在日常生活中的方方面面[1].2020年塑料的產量就已達到3.7億噸,而新冠大流行對一次性塑料用品的極度需求使得塑料產量加速增長[2],相關組織預測塑料產量將繼續增長,到2060年可能達到13億噸[3].但是塑料的生物降解性極低,在使用后大多會變成垃圾,進入環境.環境中的塑料在自然降解、機械磨損等條件下,成為微納米塑料(M/NP),即粒徑小于5 mm的塑料碎片和粒子[4].此外,制造和使用塑料制品過程中也會產生M/NP,釋放進入環境[5],涂料和化妝品等產品中加入的M/NP也會進入環境.M/NP來源多樣,分布范圍廣泛,包括水體、土壤和空氣[6],且其在生態系統中分散、遷移,并可能被不同物種吸收,從而有很大的產生負面影響的風險.研究發現M/NP能夠進入體內[7],并能夠抵抗化學降解并避免機體直接排除,從而在生物體內長期富集[8].

M/NP種類繁多,環境中最常見的是聚苯乙烯(PS)、聚乙烯(PE)、聚乙烯對苯二甲酸酯(PET)和聚丙烯(PP)[7].M/NP已經在飲用水和食物中被廣泛檢測到[9],更令人擔憂的是它在人體的多個組織器官和排泄物中也被檢測到[10].M/NP容易在生物體中長期蓄積,對人類健康具有潛在的危害[8].

目前的研究顯示,M/NP可能通過多種途徑進入人體,如經胃腸道吸收、呼吸道吸入和皮膚接觸吸收.當M/NP進入生物體后,不可避免地與細胞相互作用,影響細胞的結構和功能,進而影響生物的健康[11-12].因此了解M/NP和細胞的作用及機制對評估M/NP的健康風險至關重要.本文在概述了M/NP的來源、暴露途徑及對人體健康影響的基礎上,重點總結歸納M/NP和細胞的相互作用,包括攝入、外排及毒性的最新研究進展,討論了影響其相互作用的因素,并據此總結了今后應該關注的研究方向和內容.

1 微納米塑料的來源、暴露途徑及對人體健康的影響

1.1 微納米塑料的來源

M/NP主要分為初級M/NP和次級M/NP[13].初級M/NP主要來自于塑料制品的生產、加工過程中的塑料粒子[11],包括使用過程中磨損、碎裂而產生的更小的塑料粒子.人造纖維、橡膠制品、化妝品和個人護理等產品的生產和使用過程中也會釋放M/NP[14].此外,塑料制品在焚燒處理中也會釋放M/NP[15],汽車排放[16]也會釋放M/NP.次級M/NP則是指在環境中塑料制品經機械摩擦、紫外線輻射和生物降解而形成的M/NP[17],如汽車輪胎在行駛過程中、洗衣機和烘干機在清洗衣物過程中,都會產生M/NP[6];塑料袋、瓶子和包裝盒(袋)在海洋中漂流時,它們也會逐漸分解成M/NP;一些微生物可以分解塑料,產生M/NP.總之,M/NP的來源非常廣泛,這也是它在環境中普遍存在的原因之一.

1.2 人體的暴露途徑

M/NP可通過呼吸吸入、消化道攝入和皮膚接觸等多種途徑進入人體[18-19].空氣中存在大量各種來源的M/NP[16],濃度大約在9.8～500粒/m3[20].職業暴露也是人們通過呼吸攝入M/NP的一種途徑,如塑料制品生產、清潔劑制造和建筑工作[21-23,25].Wieland等人估計,人類每天可能吸入超過48 000粒M/NP[21],空氣中微塑料(MP)顆粒數含量可達到1 583±1 180粒/m3[24].小于10 μm、未被黏液清除的M/NP可沿著呼吸道進入肺深處,與肺細胞作用或穿過肺部屏障,進入血液并分散到全身[26].研究者已在人肺中發現微塑料纖維[18].滯留在肺部的M/NP可能導致肺機能的改變;許多因素會影響肺泡中M/NP的吸收和排出,從而加劇其對肺的損傷程度[27].聚苯乙烯(PS)被認為是空氣中M/NP的主要組成[28].因此,形貌相對均一且在體系中分散較好的PS常被作為M/NP模型,目前大部分關于M/NP的生物效應的工作都是用各種PS作為模型完成的.

Schwabl等人[29]在8個國家的人糞便中檢測到9種不同的M/NP,證實了其在人體腸道中的存在.人們主要通過進食、飲水和吸煙等方式經胃腸道攝入M/NP[23,30-32].據估計,人類每年通過胃腸道攝入的M/NP為40 000～50 000粒/人[23].此外,牙科和口腔保健產品,例如含塑料粒子的牙膏、漱口水和牙齒美白劑等,也是胃腸道攝入M/NP的重要來源[32].

M/NP還可以通過皮膚接觸進入人體.護膚品和化妝品常常會添加不同化學成分、形狀和尺寸的M/NP以達到某種功能,其中最常用的也是PS[33].例如女性每天使用的磨砂膏,含有約1千到1.8萬個M/NP/毫升[34].空氣和水中的M/NP也可能接觸皮膚.這些M/NP可能通過毛孔吸收、經過角質層、汗腺分泌或破損的皮膚進入皮膚,并進一步進入體內循環系統[32].

1.3 對人體健康的影響

通過呼吸和胃腸道,大約每人每年攝入7.4～12.1萬個M/NP[23].大多數攝入的M/NP會從體內直接排出,但仍有少量會滯留體內[35].已有分析顯示,人血液中檢出平均含量為1.6 μg/mL的M/NP[10];在人肝臟、脾臟、淋巴結、肺部和胎盤都發現有M/NP[9-10,36].這些證明了M/NP能夠穿越屏障,進入血液循環系統并在全身分布.絕大多數M/NP的生物可降解性很差,若無法被及時排出體外,可能引發局部炎癥,導致組織結構改變和功能紊亂,長期存在甚至可能產生遺傳毒性[37],以及改變機體行為的神經毒性,從而影響人體的正常生理功能.例如,M/NP在胃腸道中積聚會導致腸道炎癥和腸道菌群失調等問題[11];Yan等人也報告了人糞便中MP的數量與炎癥性腸病狀態之間呈正相關[12].

多項研究報道在人體的肺組織中檢測到M/NP,包括PS、PP和聚氯乙烯(PVC)粒子.這些粒子在肺部積聚會導致呼吸系統的損傷[27].吸入的PS還可能引起肺部炎癥或穿過血腦屏障進入中樞神經系統[38].M/NP會引起氧化應激和炎癥,可能破壞免疫和神經系統[39].研究者在生產合成纖維的工人中就觀察到有下氣道彌漫性間質或肉芽腫性病變、間質纖維化(哮喘樣綜合征,外源性過敏性肺泡炎,慢性支氣管炎,氣胸和慢性肺炎)[21-22,25].Burkhart等人[25]發現,盡管可吸入顆粒物濃度為2.2 mg/m3,低于美國國家職業安全衛生研究所針對有害粉塵設定的許可標準,但從事尼龍植絨工作的工人患間質性肺病與其吸入可吸入顆粒物有關.這些相關的和初步的研究工作提示我們亟需評估M/NP的健康風險.

2 細胞對微納米塑料的攝入及外排

2.1 細胞對微納米塑料的攝入

M/NP與細胞的相互作用是其生物效應的基礎,因此隨著人們對M/NP的關注,有關其細胞攝取的研究大幅度增加.M/NP的細胞攝取依賴于M/NP的物化性質,以及細胞種類和暴露條件.雖然在高濃度(50 μg/mL)下觀察到人結腸上皮細胞CCD841CON和小腸上皮細胞HIEC-6可以攝入5 μm的PS[40],但粒徑大于1 000 nm的很難被非吞噬性細胞攝取,粒徑越小越容易進入細胞.例如,相較于1 000 nm的PS,結腸腺癌細胞Caco-2更易攝入20 nm的PS[41].Wang等人[42]也發現,與40 nm的PS相比,150 nm PS進入HeLa細胞的速度較慢.我們發現肺細胞A549和BEAS-2B對50 nm PS的攝入量均高于100 nm PS;但在高劑量和長時間暴露條件下兩種細胞則攝取更多的100 nm PS而不是50 nm PS[43].可見不同的粒徑和細胞導致不同的細胞攝取結果.

一般來說,隨著時間增加,細胞攝入M/NP會逐漸增加,到最大值后會維持不變,或因細胞分裂等原因而降低.如0.1 mM的PS與HeLa細胞共培養后,細胞對40 nm PS的攝入在24小時后都沒有達到峰值,而對150 nm的PS的攝入在4小時就達到了峰值[42].但我們在肺細胞A549和BEAS-2B上的研究結果不同,劑量為20 μg/mL時,兩種細胞對50 nm 和100 nm的PS的攝入在24小時內持續增加,均未達到峰值[43].

粒子的細胞內化開始于與細胞膜的黏附,隨后,黏附的粒子可能通過被動滲透或主動內吞進入細胞[44].M/NP可通過內吞和被動滲入等方式進入細胞.一般來說,大于200 nm的粒子主要通過吞噬作用被攝入,較小的粒子(大于10 nm小于200 nm)通過胞飲作用被攝入(包括大胞飲作用、網格蛋白和小窩蛋白介導的內吞作用),多數情況下是多種路徑共存[42],而且也受細胞類型等的影響.Zhang等人報道70 nm的PS主要是通過網格蛋白和小窩蛋白介導的內吞作用進入肺細胞A549和人結腸腺癌細胞CaCo-2,而吞噬作用是200 nm和500 nm的PS進入細胞的唯一途徑[40].同樣地,Kuhn等人報道40 nm的PS通過網格蛋白介導和小窩蛋白介導的內吞作用被A549細胞攝入[45].但也有研究發現40 nm的PS只通過網格蛋白介導的方式進入HeLa細胞[42];20、120和190 nm的PS通過網格蛋白介導的途徑進入犬腎細胞MDCK-II和肺細胞A549[46].200 nm常常被認為是網格蛋白介導的內吞作用的尺寸上限.然而,Guarnieri等人[47]發現49 nm和100 nm PS可能是通過大胞飲作用進入豬主動脈內皮細胞PAE,并不涉及網格蛋白和小窩蛋白介導的途徑;Reinholz等人[48]也報道Caco-2細胞通過大胞飲作用攝入100 nm PS.這可能和PS在體系中的分散性有關.還有研究發現M/NP可以通過被動滲入進入細胞.如Liu等人發現50 nm和500 nm的PS進入大鼠嗜堿性白血病細胞RBL-2H3的內吞途徑不同,但都有一部分是通過被動滲入進入細胞的[49].我們的研究表明不同細胞對同樣的M/NP的攝取路徑可能不同.50 nm的PS進入A549細胞依賴于網格蛋白和小窩蛋白介導的內吞作用和大胞飲作用,進入BEAS-2B細胞則主要依賴于小窩蛋白介導的內吞途徑,但100 nm的PS進入這兩種細胞均依賴于三種路徑即大胞飲作用、網格蛋白和小窩蛋白介導的內吞作用[43].尺寸大于1 μm的MP很難被非吞噬細胞攝取,但可以通過吞噬作用被巨噬細胞吞噬.Kuhn等人發現A549細胞不能攝入1 μm的PS,而J774A.1細胞則可通過吞噬作用攝入[45].

M/NP通過內吞途徑進入細胞后,主要進入溶酶體,但也有部分能進入線粒體等細胞器;被動滲入的一般分布在細胞質.M/NP在細胞內的分布也受M/NP性質、細胞類型和暴露條件的影響.Ekkapongpisit等人[50]發現30 nm羧基化的PS積聚在人卵巢癌細胞NIH-OVCAR3的循環內體中.Thubagere和Reinhard[51]觀察到羧基化(20 nm和40 nm)和氨基化(40 nm)的PS分布在CaCo-2細胞的細胞質.而Liu等人報道,50 nm和500 nm的PS主要分布在RBL-2H3細胞的溶酶體中,少量分布在細胞質中[49].我們的研究也發現50 nm和100 nm的PS主要分布在A549和BEAS-2B細胞的溶酶體中,但在BEAS-2B細胞中100 nm的PS還分布在線粒體中[43](圖1).

BEAS-2B細胞暴露于50 nm的PS(綠色,a, b)或100 nm的 PS (紅色, c, d)不同時間后,PS 在BEAS-2B細胞中的分布.溶酶體和線粒體標記為紅色(a,b)或綠色(c,d).標尺代表10 μm

2.2 細胞對微納米塑料的外排

M/NP的細胞毒性與其細胞內含量密切相關,而細胞內M/NP的含量取決于M/NP的細胞攝入和細胞外排的綜合結果.然而,目前對于M/NP的細胞外排的研究還非常欠缺,僅有數據表明M/NP的外排不僅受其大小及表面電荷的影響,還受細胞類型的影響.

小粒徑的M/NP容易被排出細胞.例如,50 nm的PS比100 nm和500 nm的PS更易被細胞外排[43,49].但整體而言,M/NP均很難從細胞中排出.在A549細胞中,即使是50 nm的PS,6小時的外排量也只有50%,而100 nm的PS在24小時內的外排可以忽略[43].Han等人[52]發現小鼠胚胎成纖維細胞MEFs內的PS在4天內僅少量被排出.雖然大多數報道認為細胞質中的納米粒子很難排出細胞,但Fiorentino等[44]報道了一個異?？焖俚耐馀?即1分鐘內約50%的44 nm的PS通過被動滲透從牛輸卵管上皮細胞BOEC和人結腸成纖維細胞HCF中快速排出.M/NP表面電荷對外排的影響可以從Yang和Wang[53]的研究結果看出.雖然100 nm的PS的細胞外排速度都緩慢,但表面中性、帶正電和負電的PS在斑馬魚胚胎成纖維細胞ZF4中的保留半衰期還是有不同,分別為10.1,12.0和15.1小時,即表面負電的PS最難從細胞中被排出.

能量依賴和非能量依賴的途徑都能參與M/NP的細胞外排[44,54],能量依賴的途徑主要是溶酶體路徑和內質網/高爾基路徑.而我們發現50 nm的PS在A549和BEAS-2B細胞中的外排均具有能量依賴性,溶酶體路徑是主要路徑[43].非能量依賴的被動滲透也參與外排[44,49].

3 微納米塑料的細胞毒性

3.1 單獨暴露

已有的研究表明,M/NP對細胞造成各種影響,包括細胞膜結構和細胞功能的損傷,氧化應激和炎癥因子的表達改變,造成代謝障礙以及遺傳毒性,引起細胞凋亡和壞死等[13,55].M/NP細胞毒性的研究采用的細胞模型集中在表皮、胃腸道和肺細胞.

M/NP與細胞之間的物理接觸可能導致細胞膜結構和功能的破壞,表現在細胞形態和細胞膜通透性的改變[13,40].比較直接的表現是,短時間作用于細胞后,能夠引起的細胞凋亡,且細胞凋亡的情況依賴于M/NP的暴露濃度和細胞類型(圖2a-b).而M/NP對細胞膜功能的損傷,可能與其粒徑和形狀有關,如非球形的PS比球形的PS更容易黏附在細胞膜表面[56],但球形的PS更易被細胞攝入,產生更強的毒性[44].

(a-b) PS MP作用CCD841CoN細胞(a)和HIEC-6細胞(b) 0.5 h后引起的細胞凋亡[40];(c) PS、PS- COOH和PS- NH2(50/100 μg/mL)作用PC12細胞24 h后,細胞核中TFEB的平均含量[59];(d-f) PS對A549細胞的基因毒性:(d) 微核形態;(e) 80 nm和2 μm的PS引起的細胞微核的比較;(f)表面基團對80 nm PS引起的細胞微核形成的影響[37]

M/NP導致細胞內活性氧(ROS)的過度產生,這是M/NP最主要的細胞毒性機制[13,40,57].ROS的產生會影響多種信號通路和免疫應答,例如活化B細胞的核因子κB輕鏈增強子(NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)[58],和促炎因子IL-8的上調等.激活和調節這些信號通路和免疫應答會損傷細胞器、DNA、細胞膜、離子通道和細胞表面受體,導致不良反應和毒性.例如Song等人[59]發現PS引起細胞溶酶體自噬轉錄因子EB(TFEB)表達升高(圖2c),從而導致溶酶體功能障礙,引起細胞死亡;Hou等人[60]發現PS長期作用于細胞,會導致核因子(NF-κB p65)、IL-8和ROS水平的上升,其中NF-κB p65 對于調節細胞炎癥和免疫反應至關重要,細胞炎癥和免疫反應控制細胞內IL-8的分泌,從而進一步介導細胞凋亡.細胞內M/NP可以直接損傷線粒體,導致細胞內ROS增加;微米級PS對細胞活力和凋亡無顯著影響.此外,微米級PS引起的膜損傷顯著高于納米級PS,這可能是由于大量的PS附著在間隙上,對細胞膜功能有顯著的負面影響[40].Xu等人[55]發現,隨著PS在Caco-2中積累,細胞活力逐漸降低,細胞周期被阻滯在G0/G1期;細胞中Bax/Bcl-2蛋白比值略有增加,表明細胞對凋亡的抵抗能力降低,伴隨自噬標志物LC3-Ⅱ和SQSTM1蛋白水平升高,由此誘導細胞凋亡.

此外,M/NP還可以引起遺傳毒性.Shi等人[37]通過微核形成實驗分析5種不同的M/NP的基因毒性.結果表明,不同粒徑和表面修飾的PS均可以導致細胞微核的形成(圖2d).80 nm的PS比2 μm的PS引起的基因毒性更強(圖2e),同時表面修飾也影響PS對A549細胞的基因毒性,毒性從強到弱依次是氨基修飾的,羧基修飾的和未被修飾的(圖2f).

總的來說,M/NP對細胞的毒性作用,包括但又不限于細胞膜結構和功能的損傷,氧化應激以及其引起的一系列毒性相關的信號通路和免疫反應的激活,和造成的遺傳毒性.此外,M/NP的細胞毒性不僅與其本身的物化性質相關,還受到細胞類型、暴露條件等因素的影響.然而,相關研究多采用球形PS來代表環境種類眾多的微納塑料[28],代表性有限,今后應該加強其他化學成分的M/NP的研究.

3.2 協同暴露毒性

除了M/NP本身對細胞的毒性影響,M/NP容易吸附環境中的其他物質,包括各種有害物質,與他們聯合作用于細胞,有可能引起更嚴重的毒性效應[61-63].例如,多環芳烴(PAHs)可被M/NP吸附,一起被生物攝入,引起各種毒性效應[63];在M/NP存在的情況下,Cr、Cu、Mn和Zn等重金屬元素在生物體內的積累顯著增加,引發慢性毒性[64].Zhou等人[65]將這種現象描述為“特洛伊木馬”效應,即M/NP作為載體攜帶其他有害物質穿透生物體膜.M/NP為這些有害物質滲透到組織和體液提供了可能[66].相比于微米尺度的粒子,納米尺度的粒子由于比表面積大吸附量高,而且吸附在粒子表面的有害物質在細胞內更容易釋放,引起線粒體去極化等,導致M/NP的細胞毒性增強[67].

M/NP除了和吸附的有害物質聯合作用外,還可以與本身無毒的離子、其他的粒子、甚至不同粒徑的M/NP聯合作用于細胞,產生更強的毒性效應.相比于單獨作用,PS與Ag 納米粒子聯合作用于THP-1細胞使得細胞的IL-6、IL-8和TNFa表達上調,加劇了細胞凋亡和死亡[64].多種粒徑的PS共暴露會改變PS的細胞攝取和毒性.de-Boer等人[68]發現,100 nm PS促進細胞對40 nm PS的攝入,而40 nm PS抑制細胞對100 nm PS的攝入(圖3a-b);1 μm和5 μm PS混合比單獨的PS對A549細胞造成更嚴重損傷[69].另外,Steckiewicz等人[70]發現PS單獨作用于HT-29細胞時,不會誘導ROS產生,也不影響細胞周期;然而PS與本身沒有細胞毒性的F-共同作用于細胞后,除了引起細胞超微結構改變(圖3c-f),細胞被阻斷在G0/G1期,增殖受到抑制,導致細胞凋亡.然而這方面的工作還比較初步,需要更多的研究.

(a-b) HeLa細胞對混合的40 nm和100 nm的PS的攝取,發現40 nm的PS抑制細胞攝入100 nm的PS(a),而100 nm的PS促進細胞攝入40 nm的PS(b)[68];(c-d) HT-29細胞暴露于PS(500 μg/mL)后的TEM圖;(e-f) HT-29細胞同時暴露于PS(500 μg/mL)和F—(1 mM) 后的TEM圖(V:囊泡;N:細胞核;Mt:線粒體)[70]

4 微納米塑料影響其細胞攝入及毒性的因素

除了M/NP的物化性質(粒徑,形狀,表面性質),老化,M/NP的暴露時間和暴露濃度也會影響細胞攝入的量,繼而對M/NP的細胞毒性產生影響[69,71-73].

4.1 粒徑

M/NP對細胞的毒性效應存在顯著的粒徑依賴[73-74].小粒徑的M/NP比大粒徑的更易進入細胞且細胞毒性更大.Prietl等人[75]發現20 nm的PS比0.5 μm和1 μm的PS對人單核細胞有更強的毒性作用,其中一個重要原因可能是與細胞攝入量有關.小于200 nm的PS不僅能以內吞方式被細胞攝入,而且可以依賴濃度梯度下的被動滲入或是與通道蛋白或轉運蛋白發生黏附作用進入細胞[76],而粒徑大于1 μm的PS卻很難在短時內被細胞攝取[73,75],因此納米級的粒子更容易誘導細胞毒性的產生,如ROS(圖4a-d).M/NP在細胞內的大量積累導致細胞活力顯著降低.Stock等人[77]就發現Caco-2細胞和THP-1巨噬細胞對粒徑小于1 μm的PS的攝入量與兩種細胞的活力呈負相關趨勢,即攝入PS越多,細胞活力越小.Zhang等人[73]發現內皮細胞暴露于不同粒徑(20 nm,50 nm,100 nm,500 nm,5 μm,10 μm)的PS時,PS的粒徑越大,細胞攝入量越少,引起的細胞毒性也越弱.細胞攝入最高的20 nm的PS導致細胞出現嚴重損傷,包括活性氧水平增加,炎癥因子IL-6、TNF-α和IL-1β表達水平升高,細胞骨架破壞.

(a) 不同粒徑和表面基團的PS誘導A549細胞產生ROS.(b-d) 100 μg/mL不同表面基團的 PS與A549細胞作用6 h(b),9 h(c)和24 h(d)后細胞內的ROS水平[37].(e) 不同形狀的PS與不同細胞共孵育24 h后,細胞周期和凋亡水平分析 [56]

與細胞攝入PS納米粒子從而導致毒性不同的是,PS 微米粒子對細胞造成的損傷可能與其破壞細胞膜的完整性有關.Zhang等人[40]報道粒徑為100 nm、500 nm、1 μm和5 μm的PS與人結腸上皮細胞CCD841CON和小腸上皮細胞HIEC-6分別單獨作用24 h后,均表現出較低的細胞毒性;但PS 微米粒子對細胞膜的損傷高于PS納米粒子,這可能是由于大量的PS微米粒子黏在細胞膜的膜間質中,對細胞膜的功能產生了影響.此外,高劑量下,細胞也可以少量攝取5 μm的PS,導致細胞氧化應激的平衡被破壞,引起線粒體去極化.Wu等人[78]也發現,高濃度下5 μm的PS比100 nm的PS對Caco-2細胞造成更嚴重的線粒體損傷.但Liu等人[79]報道了相反的結果,即粒徑小于100 nm的PS比5 μm的PS對Caco-2細胞膜的損傷程度更高.矛盾的結果可能是由于PS的濃度和分散性不同導致的,也可能是PS 納米粒子通過滲透的方式進入細胞時,引起細胞膜結構的變化[80],即質膜重排[81],最終導致細胞膜結構和功能的損傷.

4.2 形狀

對M/NP的細胞毒性研究大多是將細胞暴露于具有特定尺寸、形狀和表面修飾的M/NP(多以球形PS為模型),但這并不能反映現實環境中的M/NP的真實情況[38].環境中M/NP多為非球形,與細胞的相互作用可能和球形M/NP表現不同.Zhang等人[56]在研究PS納米盤和納米球(20 nm)被HeLa、Hek 293、Jurkat和BJ細胞的攝入和對細胞的毒性時發現,盤狀PS只進入細胞膜的脂質雙層卻不進入細胞內,不產生毒性作用,而球形PS通過內吞作用進入細胞,將細胞周期阻滯在G2/M期,更容易誘導細胞凋亡(圖4e).近期的研究獲得了相似的結果,即球形PS比非球形PS更易被Caco-2細胞攝入,且能引起細胞更強的氧化應激反應,主要原因是球形PS富集在細胞的線粒體中[82].今后應該更加關注不規則M/NP的細胞攝取和細胞毒性.

4.3 表面性質

4.3.1 表面修飾

細胞對納米粒子的攝入是由納米粒子表面的性質和細胞表面受體之間的相互作用決定的[83].通常來說,由于細胞膜表面帶負電,因此表面帶正電的納米粒子相比于表面帶負電的納米粒子更容易被細胞攝取[84],同時表面帶正電的納米粒子細胞毒性更大[85],這對于M/NP也同樣適用.He等人[86]發現50 nm的表面帶負電和正電的PS比表面中性的PS對肝細胞HepG2細胞顯示出更嚴重的毒性且表面帶正電的PS會引起更嚴重的氧化應激,主要是因為細胞對表面帶電荷的PS的攝入量高于表面為中性的PS.Xu等人[55]也發現Caco-2細胞對100 nm PS的攝入量和毒性從高到低依次是氨基修飾的PS、羧基修飾的PS和無表面修飾的PS,說明PS的細胞攝入量與毒性正相關.Shi等人[37]也得出了一致的結論,即在6 h內氨基修飾的PS、羧基修飾的PS和無表面修飾的PS均能誘導A549細胞活性氧的產生(圖4b-d),但是隨著PS與細胞共孵育時間的延長,氨基修飾的PS對細胞具有更大的損傷.除了氨基修飾的PS更易與帶負電的細胞膜相互作用的原因外,還可能與氨基修飾的PS引起的溶酶體自噬有關.Song等人[59]發現,不同表面電性的PS被細胞攝入后,均能激活轉錄因子EB(TFEB),激活細胞自噬.表面帶正電的PS比其他PS能夠在更低的濃度范圍(10 ～ 25 μg/mL)和更短的時間(<24 h)激活TFEB,破壞溶酶體的完整性,從而阻斷細胞自噬通量,降低細胞通過自噬溶酶體清除PS的能力,從而顯示出更高的細胞毒性.綜上,與表面中性的PS相比,表面帶電的PS更容易被細胞攝入,且表面帶正電的PS能導致更嚴重的細胞損傷.

4.3.2 老化

排放到環境中的塑料在光、熱、氧、水、微生物、機械力等的作用下,失去原有性能,稱之為老化[17].如M/NP中不飽和雙鍵、支鏈、羰基、末端上的羥基等發生斷裂或氧化,使得其原本性質發生改變.老化通常表現在M/NP表面電荷的轉變,這增加了其親水性和生物可利用度,使其更容易吸附其它物質,產生聯合作用;或是其內部的分子單體釋出,進入環境,加劇了其對環境的影響等.

M/NP的老化普遍增強了其對細胞的毒性效應.M/NP與經紫外線輻射后獲得的老化后的M/NP相比,粒子形態上差異明顯[69,87-89],如圖5a所示PS在老化前后的形貌差異.El Hayek等人[69]發現,即使在低濃度(1-30 μg/mL)下,粒徑為1 μm和5 μm的老化的PS(APS)對A549細胞的毒性比PS的更明顯,表現為細胞膜完整性損傷嚴重,細胞核減小,細胞骨架和細胞代謝發生改變,細胞周期阻滯在S/G2期,細胞增殖抑制.此外,PS形態的改變通常也伴隨著表面官能團和表面元素組成的改變,這導致了有更多的反應位點結合環境中的其它物質或與其反應產生新的物質,從而增強了毒性作用.例如,在支氣管肺泡灌洗液(BALF)中,老化的PS(APS)比PS更易形成生物冠,且兩者表面吸附蛋白的種類和量也存在較大差異[89].APS在生物冠的“偽裝”作用下,則更容易被細胞攝入(圖5b-d),增加其在細胞內的含量,使得潛在的風險提高.

4.4 暴露條件

4.4.1 濃度

M/NP濃度是影響細胞攝入和毒性的重要因素[7,69].低濃度暴露條件下,M/NP對細胞可能具有毒性興奮作用,刺激其增殖;短時間高濃度和長期低濃度的暴露都會容易引起細胞炎癥反應、氧化應激和免疫反應等.El Hayek等人[69]就發現1 μm和5 μm的PS在濃度低于10 μg/mL時能夠刺激A549細胞增殖,但是當濃度增加到30 μg/mL后,PS則會對細胞產生毒性.暴露于高濃度PS(50-100 μg/mL)中,Caco-2細胞中出現致密囊泡,溶酶體的電子密度升高,線粒體出現腫脹以及脊的消失,ROS水平顯著增加[90].此外,M/NP對細胞的毒性作用還表現為時間依賴性.M/NP短時間(小于48 h)高劑量作用于正常人腸道細胞CCD-18Co后,細胞內ROS水平會顯著性升高,同時伴有細胞形態和細胞膜通透性的改變,線粒體膜電位的改變,和細胞活力的下降等;而在長時間(4周)低劑量下M/NP導致細胞內ROS水平逐漸升高,細胞代謝過程如TCA循環的重組[13].但Hou等人[60]用10 μg/mL的50 nm PS作用于腸道細胞14天,觀察到的細胞凋亡比例、炎癥因子表達水平和100 μg/mL的50 nm PS與細胞作用1～2天相當.此外,隨著PS濃度的升高,細胞核周圍PS的積累量明顯增多,說明細胞對PS的攝入是劑量和時間依賴性的,且細胞內PS含量越高越容易導致細胞毒性.

一些研究者提出,M/NP“過量”是導致明顯的毒性的主要原因,較少的接觸只會產生輕微的影響[77].Zhang等人[40]發現,濃度為1000 μg/mL時,三種粒徑(20 nm、100 nm和10 μm)的PS均可導致細胞膜出現不同程度的受損,細胞內ROS含量上升,但該濃度遠遠高于細胞能夠接觸的M/NP濃度(如在血液中的含量是1.6 μg/mL)[10].相反,較低濃度(0～80 μg/mL)的500 nm的PS作用于細胞時,并未發現細胞內ROS水平升高[91].與之相似,Cortes等人[90]研究50 nm的PS對Caco-2細胞的毒性效應時發現,暴露濃度在200 μg/mL時Caco-2細胞活力明顯降低,而暴露濃度低于150 μg/mL時PS對細胞不產生毒性作用.在另一項研究中,當Caco-2細胞暴露于0～200 μg/mL PS中,也未檢測到明顯的細胞活力降低[92].可見,M/NP對細胞毒性的影響是具有濃度依賴性的[93],但不同細胞的耐受能力不同,當細胞內蓄積的M/NP濃度超過其耐受的閾值時,就會引發氧化應激和炎癥等一系列反應.因此,在體外進行M/NP的健康風險評估時,應當考慮實際暴露劑量以及所采用的細胞模型.此外,由于M/NP在生物體內無法被有效降解,這導致其長期滯留在生物體內,因此M/NP引起的細胞的慢性毒性應當予以關注.

4.4.2 蛋白冠

當M/NP進入生物體后,能夠迅速被體內的多種蛋白(如白蛋白、免疫球蛋白和載脂蛋白)所包覆,形成“蛋白冠”層.這賦予M/NP新的生物學身份,并介導其與細胞的相互作用[94-95].這意味著通過各種途徑進入體內的M/NP在與細胞相互作用之前,已經在其表面形成蛋白冠,導致M/NP的表面性質發生改變.而被蛋白質包裹的M/NP能夠更有效地在細胞間進行交換(轉胞吐過程)[96].并且M/NP的蛋白冠在體內會隨著微環境的不同而發生蛋白冠成分和量的改變[97],使得M/NP與不同類型的組織細胞的作用不同.Ji等人[98]發現PS表面吸附了蛋白后,更容易被A549細胞攝取,但在細胞內轉運緩慢,從而在細胞內長時間滯留.但是,Tan等人[99]發現PS表面被胎牛血清包裹后,能減少巨噬細胞對PS的攝入,進而降低細胞的自噬和溶酶體損傷,減輕了細胞毒性.細胞模型的差異可能是結果不一致的一個重要原因.可見,M/NP表面蛋白冠的形成會顯著影響其與細胞相互作用以及其生物效應,但相關作用受多種因素影響,需要進一步深入研究.

5 總結和展望

目前環境中存在大量的M/NP,這些M/NP可以通過皮膚接觸、呼吸吸入以及消化道攝入等方式進入人體,對人體健康產生潛在威脅.我們分別從M/NP人體暴露途徑和潛在危害,M/NP的細胞攝入和外排,M/NP引起的細胞毒性,以及相關影響因素等方面總結了目前的研究進展.總的來說,M/NP的健康效應的研究才剛剛開始,有很多方面亟需進一步深入研究.

目前M/NP的細胞毒性研究中,大多數采用球形PS作為M/NP的模型,無論從M/NP形態上(粒徑、形狀、表面粗糙度等)還是暴露條件上(時間、劑量等),均與我們接觸到的真實環境中的M/NP存在巨大差異.環境中的M/NP不僅化學成分多種多樣,制造商還常常在塑料中添加增塑劑、穩定劑和顏料等,其中許多物質是有害的,如干擾內分泌(激素)系統.而且環境中的M/NP多數是纖維或碎片,而不是球形的,這些特征都能影響M/NP的生物效應.此外,M/NP常常是低劑量長期暴露的,因此開展長期低劑量的M/NP的研究更具有現實意義.同時,M/NP難以降解,通過各種屏障進入體內后會長期滯留,由此帶來的負面效應也應予關注.如何在現有的實驗設計和結果的基礎上,建立一套相對完善的M/NP的實驗標準,包括M/NP的標準樣、實驗條件和毒性檢測指標,對于獲得接近真實條件下的、可重復的實驗結果將尤為重要.

由于環境中M/NP處在復雜體系中,它的表面會吸附環境中的各種物質.只關注M/NP本身的生物效應,不足以反映真實體系的情況,需要考慮M/NP的生物冠以及共存的離子/分子對M/NP的生物效應的影響.

技術和方法的革新是科學發展的基礎,目前環境中的M/NP形貌各異、種類繁多,缺乏特異性的分析檢測手段.我們需要不斷地尋求和探索新的技術和方法,以應對這一領域的挑戰,如將快速發展的人工智能和機器學習等先進技術用于M/NP基礎數據的收集和分析,推動M/NP的安全性的研究,保護人類健康.