色譜技術在木犀草素中的研究進展

徐 濤,夏鵬志,金 磊,李昶昶,程子鈺

(合肥學院 生物食品與環境學院,安徽 合肥 230000)

1 木犀草素

木犀草素(圖1)是一種常見的黃酮類化合物,存在于多種植物中,如木犀草、胡蘿卜、香芹等。它具有多種生物活性和藥理學特性,被廣泛研究和應用。與其他2-苯基苯并γ-吡酮衍生物類似,其基本骨架具有C6—C3—C6體系的特征,包含兩個苯環和一個C2—C3雙鍵和一個氧原子連接的橋。研究表明木犀草素和其他類黃酮的藥理作用與C5、C7、C3′和C4′碳上羥基的存在以及C2—C3上雙鍵的存在密切相關?！狾H基團在C3′位置的存在將木犀草素與芹菜素區分開來,而在C3上缺乏這一基團是將木犀草素置于黃酮基團中的一個元素[1-2]。

圖1 木犀草素的化學結構

木犀草素具有抗氧化、抗炎、免疫調節等多種生物學作用。富含木犀草素的植物在傳統醫學中經常被用于治療各種疾病,如高血壓、炎癥性疾病,甚至癌癥。因為木犀草素有四個羥基(在C5、C7、C3′和 C4′位置),所以可以產生許多木犀草素的衍生物。各種類型的官能團可以附著在這些位置上,形成大量不同但結構相似的分子。

目前市場上越來越多的草藥制劑含有木犀草素,如半枝蓮[3],它是一種藥用植物。為了確定這類產品的質量,使用合適的分析方法是很重要的。然而,現有木犀草素的定量方法缺乏質量評價,也缺乏對它們進行比較的信息。

色譜法在分析化合物的儀器方法中占有主導地位。它是一種分離分析化合物的物理化學方法,可以對被檢測物質進行檢測鑒定和定量測定,準確度高。色譜法與其他分析方法的耦合有助于更準確地檢測和分析,特別是對復雜的有機化合物。色譜技術是基于物質在固體或流動相中的分離和分析原理的一種技術。它利用物質在不同相中的相互作用力的差異,將混合物中的不同成分分離開來,并使用檢測器進行分析和定量。常見的色譜技術包括氣相色譜(GC)、液相色譜(LC)和薄層色譜(TLC)等。在色譜技術中,樣品首先通過一個固定相(如固定在柱子上的填料或涂覆在薄層上的材料)與流動相(如氣體或液體)相互作用,物質在固定相和流動相之間以不同速率移動。由于不同物質之間的相互作用力不同,它們在固定相和流動相之間的分離度也不同,從而實現了不同成分的分離。分離完成后,通過檢測器對分離出的物質進行檢測和定量。檢測器可以根據樣品的特性進行選擇,常見的檢測器包括紫外-可見光譜檢測器、熒光檢測器、質譜檢測器等。通過檢測器的信號,可以得到分離出的物質的濃度、結構等信息。

色譜技術分類的一個標準是流動相的物態不同,可以將色譜技術分為液相色譜、氣相色譜等,還可以根據操作方式的不同,可以將色譜技術分為常壓色譜、高效液相色譜、超高效液相色譜等。常壓色譜操作相對簡單,適用于一般分析;高效液相色譜(HPLC)使用高壓泵強制流動相通過固定相,分離效果更好;超高效液相色譜(UHPLC)是HPLC的進一步發展,具有更高的分離效率和靈敏度。許多不同的色譜技術都可用于木犀草素的分析,其中包括薄層色譜法(TLC)、高效薄層色譜法(HPTLC)、液相色譜法(LC)、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)和逆流色譜法(CCC)。

本研究的目的是將木犀草素及色譜分析技術領域的知識和信息系統化。本研究首次對木犀草素的色譜分析技術進行了系統的綜述,包括TLC、HPTLC、LC、HPLC、GC和CCC。

2 木犀草素的色譜分析技術

2.1 木犀草素的薄層色譜分析

蘇聯于1938年報道了Nikolay A. Izmaylov和Maria S. Shrayber將載體材料作為薄膜分布在玻璃板上,可以用類似于紙色譜的方式操作板和支撐材料。直到1956年德國化學家Egon Stahl開始深入研究其應用,該方法的潛力才被廣泛認識。在20世紀50年代,薄層色譜法逐漸發展成為一種常用的分析技術。這一時期,Egon Stahl以及其他科學家對薄層色譜技術進行了改進和擴展,包括對固定相、槽設計和檢測方法的改進。20世紀60年代末,薄層色譜法開始在不同領域得到廣泛應用。自20世紀70年代以來,薄層色譜法繼續發展和改進,包括新型固定相、新的檢測方法以及自動化系統的引入,進一步提高了分離和分析的準確性和效率。

在近幾十年間,薄層色譜法在成分鑒定、混合物分離、藥物分析、農藥殘留檢測、食品研究等領域發揮了重要作用,并衍生出其他技術,如高效液相色譜(HPLC)、超高效液相色譜(UHPLC)等。

薄層色譜(TLC)作為一種分離和分析技術,至今仍被廣泛應用于科學研究和分析實驗室中。薄層色譜法的一般步驟是首先準備樣品,接著準備TLC板,然后涂布樣品,再接著運行分離,最后進行可視化測量和數據分析,適用于實驗室初學者和快速分析需求。TLC檢測快速高效,可以在短時間內完成樣品分離和分析,通常只需幾十分鐘至幾小時。相比于其他分離技術,如柱層析,TLC具有更快的分離速度和高效性。TLC使用的材料相對廉價,成本較低,且由于其分離速度快,對溶劑消耗也相對較少,節約了實驗成本。TLC還可以同時分離和分析多個樣品,例如對于混合物的分離和組分分析,這使得TLC在樣品檢測、藥物分析和天然產物研究等領域具有廣泛的應用。通過觀察TLC板上斑點的位置、顏色和形狀,可以初步判斷不同成分的相對含量和分離程度。雖然TLC不能提供定量結果,但可以從定性角度對樣品進行快速評估。此外,在薄層色譜板上,不存在消失或未預料到的峰的問題,因為整個樣品都被應用并且可以視覺檢測到。HPLC和GC中,保留度高的物質形成最寬的峰,分辨率最差;而TLC中,保留時間最長(比移值最低)的物質形成最緊的區,檢測靈敏度最高[4]。

TLC和柱層色譜法(CC)都基于不同物質在固定相和流動相之間的不同親和性來實現分離。它們都是根據化合物的相對極性來進行分離。因此,在某些情況下是可互換的技術,可以結合使用,這大大降低了成本和分析時間。為達到這一目的,理想情況下TLC和CC都使用相同的吸附劑,不過也可以使用其他溶劑體系。CC的洗脫可以在一個流動相中進行,也可以在色譜過程中改變其組成(梯度洗脫),從而增加洗脫力。在這種情況下,TLC流動相要相應改變。

固定相是TLC中非常關鍵的組成部分,它對于分離混合物的影響非常顯著。固定相的極性決定了它與待分離混合物之間的相互作用。不同極性的固定相對于不同類型的化合物有不同的選擇性。例如,對于極性化合物,使用硅膠固定相可以提供更好的分離效果,而對于非極性化合物,更低極性的固定相會更適合。具有親脂性(非極性)固定相的反相體系也很常見,但在黃酮類化合物的分析中意義不大。目前,硅膠是最常用的TLC固定相之一,具有廣泛的應用。它對許多不同類型的化合物有較好的分離效果,特別適用于中性和極性物質的分離。

黃酮類化合物通常在紫外光源下進行檢測。常用的波長有254 nm和366 nm。這些波長通常適用于大多數黃酮類化合物的可視化。木犀草素衍生物也顯示熒光,可以使用適當的衍生化試劑增強,例如使用所謂的NP/PEG試劑。最常見的步驟是用質量分數2%的AlCl3甲醇溶液噴涂板。密度計也可用于該物質的定性分析。通過比較被試物質與標準品的比移值(Rf)和吸收光譜進行分析。如薄層色譜法測定不同屬楊樹種及雜種花蕾中部分黃酮的含量實驗中,采用CD-60密度計(Desaga)進行密度測量。質量分數2%的AlCl3甲醇溶液衍生化后,使用TLC顯像儀(Camag)在366 nm處可以進行密度分析[5]。此外,分析物也可以通過從板上提取分離物質來鑒別。然后,利用質譜(MS)、紫外光譜、拉曼光譜或其他技術進行分析。盡管木犀草素的TLC分離(表1)可以在不同類型的固定相中進行,如聚酰胺相和纖維素相[6-7],但最常見的還是在硅膠板上進行分離。例如該方法已應用于草屬植物開心果中木犀草素的分析[8]。在薄層色譜檢測中可以通過調節兩種溶劑的配比來調節展開劑的極性大小,對于一般極性的化合物,用石油醚乙酸乙酯體系就可以,如果化合物的極性很大,就要選擇二氯甲烷甲醇體系。此外,木犀草素分離的流動相由非質子有機溶劑(如乙酸乙酯或丙酮和H2O的混合物組成),能更好地實現分離。

表1 TLC和HPTLC對木犀草素的分析

薄層色譜法可以用于初步評估樣品混合物的成分和相對含量,以指導后續的HPLC分析。它可以提供快速分析結果,幫助確定樣品中具有較高含量的成分,并優化HPLC分離條件。例如,Markus Ganzera等用乙酸乙酯-甲酸-乙酸-水洗脫的硅膠層可以很容易地區分這兩個田薊物種的黃酮類化合物,然后采用高效液相色譜法定量測定木犀草素等四種黃酮類化合物[16]。薄層色譜法還可以在聚酰胺板上進行薄層色譜檢測,并找到了最佳流動相。此外,薄層色譜能夠用于分析被測物的單個組分。采用薄層色譜-高效液相色譜-脈沖安培-質譜聯用(TLC-HPLC-PDA-MS)技術對雪絨花草藥提取物中木犀草素等酚類化合物進行分析,還利用紫外和核磁共振(NMR)對這些化合物進行了鑒定[17]。

與其他色譜技術相比,高效薄層色譜法(HPTLC)減少了分析時間和成本,并提供了更高的分離效率。它甚至適用類似于TLC的粗提取物的分析,并且使用相對少量的溶劑來分析幾種樣品,使該方法具有環保性。在木犀草素的分析中(表1),HPTLC硅膠60大部分被用作固定相與薄層色譜類似,有機溶劑、水等的混合物常被用作流動相。

高效薄層色譜法也可作為其他色譜技術的補充方法。Ivan Lozada Lawag等采用高效薄層色譜(HTPLC)衍生的酚類數據庫對酚類成分進行鑒定,并采用HPTLC對鑒定的酚類化合物進行定量。最后,使用DPPH-HPTLC生物自顯像法鑒定了蜂蜜抗氧化活性的成分。結果表明,蜂蜜中含有木犀草素[12]。

利用衍生化試劑和366 nm紫外光比較Rf系數進行檢測。衍生化后的特征熒光帶為樣品中主要黃酮類化合物的鑒定提供了重要線索,同時采用高效液相色譜-紫外光譜法或二極管陣列檢測器(HPLC-UV/DAD)技術對這些化合物進行同時檢測和定量。

2.2 液相色譜法分析木犀草素

液相色譜法(Liquid Chromatography,簡稱LC)結合串聯質譜(LC-MS/MS)(表2)在分析多組分混合物(如草藥提取物)時特別有用,因為它不需要大量的樣品。為了進一步減少其他因素對分析的影響,越來越多地使用更先進的技術,包括多種檢測方法的組合,例如采用液相色譜-質譜聯用技術對大西洋黃連木亞種提取物進行了研究[18]。用甲醇和0.05%三氟乙酸梯度洗脫。對該物種的分析顯示,其中存在木犀草素及其衍生物。

表2 LC對木犀草素的分析

在眾多色譜方法中,以流動相為液體、固定相為固體的吸附色譜法是十分常見的方法。這種方法的應用比氣相色譜法廣泛得多,因為它允許分析液體和可溶性固體形式的物質。高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography,簡稱HPLC)是將待分離的混合物通過高壓泵送進液相色譜柱中,通過流動相在固定相(填充柱或固定相涂層)上的相互作用進行分離。與傳統色譜分析相比,HPLC高分離效率和靈敏度,定量準確性和重復性好,還可以通過調整流動相和柱溫等參數進行優化,適應不同樣品和分析要求,是目前主要檢測分析手段。然而改進的方法,如液相色譜結合質譜(LC-MS),越來越多地用于分析天然化合物,其中包括木犀草素。HPLC儀器和技術不斷創新,包括新型柱材、檢測器和分離模式的引入(如手性色譜、離子交換色譜、凝膠色譜等)。此外,HPLC與其他分析技術(如質譜聯用、光譜檢測等)的結合也得到了廣泛應用操作。

在HPLC中流動相是一種溶液或混合溶劑,通過高壓泵送進色譜柱中。固定相則通常是由細小顆粒構成的柱填料(也稱為固定相床)。填料可以是無機材料(如硅膠)、有機聚合物(如聚合物高分子)等。通常樣品溶液被注入流動相中,并被輸送到色譜柱中。樣品混合物中的化合物會以不同速度在固定相表面上與流動相相互作用。這個相互作用可以是吸附作用、分配作用、離子交換作用等,根據不同的分離原理,HPLC可以采用不同的柱材和減速劑。在分離結束后,溶液中的化合物通過檢測器進行檢測。常見的檢測器包括紫外-可見光檢測器(UV-Vis)、熒光檢測器、質譜檢測器等。這些檢測器可以測量樣品分子與光的相互作用,以獲取關于化合物的信息。通過比較待測化合物的峰面積或峰高與已知標準樣品的峰面積或峰高,可以進行化合物的定量分析。通過校正曲線或內標法等方法,可以確定待測化合物的濃度。

選擇適當的色譜柱是進行高效液相色譜法(HPLC)分析的關鍵步驟。色譜柱的選擇應基于樣品特性、分離目標和分析條件。首先確定分離和分析的化合物的特性,如極性、分子大小、溶解度等。根據樣品的物化性質,有選擇性地選擇色譜柱。其次根據分離原理和樣品特性選擇適當的色譜模式。接著選擇柱填料的類型和粒徑。填料通常使用硅膠,因為硅膠是最常見的固定相材料之一,它在反相色譜中廣泛應用。它具有較大的表面積、中等的硅氧鍵極性和良好的機械穩定性。硅膠柱常用于極性化合物的分離。但它在酸性或堿性條件下會有一定的化學不穩定性。低pH條件下,硅膠可能會被腐蝕或溶解,導致柱性能下降。高pH條件下,硅膠表面可能發生硅氧鍵的水解作用,導致失去固定相的性能和效果,并且硅膠通常具有親水性,對于極性化合物的吸附能力較強。這使得在一些非極性化合物的分離中,硅膠柱的選擇性較低,容易引起保留不良或分離不徹底的問題。為了更好地分離和利用硅膠這一材料,在硅膠表面經過修飾,覆蓋有長鏈烷基(通常是十八烷基),這種柱稱為C18柱,適用于分離疏水性較強的化合物。硅膠這種填料可以有不同的性質取決于硅膠類型和生產方法。如氨基柱是一種正相色譜填料,也是由硅膠表面經氨基功能團修飾,使得氨基柱對極性化合物顯示良好的吸附能力。填料的粒徑通常以微米(μm)為單位,如 3 μm、5 μm、10 μm等。較小的粒徑可以提供更高的分離效率和靈敏度,但也會增加色譜柱的壓力。根據分離需求和儀器性能,選擇合適的柱填料和粒徑。例如,從枸杞中分離木犀草素[23]以及從山茱萸中分離木犀草素[24],見表2。

在高效液相色譜中,選擇合適的流動相對色譜分離也非常重要。應考慮分析物的類型、混合物組成、固定相和所用檢測器。在反相系統中最常用的是三種溶劑,通常使用甲醇(MeOH)/水或乙腈(ACN)/水的混合物。隨著有機溶劑用量的增加,非極性物質的保留時間縮短,而H2O的加入延長了其保留時間。根據經驗,含有ACN/H2O的系統比含有MeOH/H2O的系統效率更高。然而,在正相體系中,極性通過添加另一種極性更高的溶劑如三氟乙酸(TFA)而適當改變[32]。根據現有文獻,大部分用于木犀草素分析(表3)的流動相都由ACN/H2O組成[23-24,26-28,31]。

表3 HPLC對木犀草素的分析

在HPLC檢測過程中,洗脫可通過等度和梯度兩種方式進行。等度洗脫適用于具有較簡單樣品組分的化合物分離。它常用于分析目標化合物在相對短的時間內完成分離,或者在不需要顯著增加分離度的情況下進行定性或定量分析。在等度洗脫中,流動相的組成根據待分離化合物的性質和分析要求選擇。通常流動相可由水和有機溶劑(如甲醇、乙腈等)組成,可以根據需要調整它們的比例。在一些特殊情況下,還可以添加緩沖劑、酸或堿來改變流動相的酸堿度。在梯度洗脫中,流動相的比例會變化,有機溶劑的比例逐漸增加,而水的比例逐漸減少。這樣的變化可以通過線性梯度、非線性梯度或階梯梯度等方式來實現。通過梯度洗脫可以提高分離度,減少共洗物質的干擾,從而更好地分離和定量目標化合物。

目前,檢測最常用的方法是二極管陣列檢測器(DAD)(也稱為光電二極管陣列檢測器,PDA),然而,通常情況下,DAD與其他檢測器結合使用以進行結構測定。DAD結合其他檢測方法分析植物中木犀草素衍生物的例子包括：使用串聯質譜(MS/MS)和核磁共振(NMR)分析小麥幼苗[33],二極管陣列探測器結合電噴霧電離和質譜(DAD-ESI-MS)分析Lathyrus cicera L. 種子[34],電噴霧電離結合串聯質譜(ESI-MS/MS)分析芹菜[35]。高效液相色譜-光二極管陣列檢測-質譜(HPLC-PAD-MS)技術被用于分析雪絨花高山地區(Leontopodium alpinum)的空中開花部分[17]。從該提取物中共分離出14種化合物,包括幾種木犀草素衍生物和木犀草素。采用梯度洗脫,流動相為水- 0.9%甲酸∶0.1%乙酸∶1.5% 1-丁醇(均為v/v;溶劑A);乙腈加30%甲醇∶0.9%甲酸∶0.1%醋酸(均為v/v;溶劑B)和甲醇(溶劑C)。完成分離后的組分結構通過核磁共振譜進一步證實。

對所有分析物具有統一的液相色譜檢測的探索正在進行中。到目前為止,還沒有找到理想的解決方案,需要根據分析的特點類型選擇特定的檢測器。缺乏一種適用于廣泛條件下能夠定性和定量分析的通用檢測技術,這使得開發普遍適用的HPLC方法仍然具有挑戰性。在實驗室大多數分析仍然是通過高效液相色譜-紫外進行的。對于非紫外線活性成分的檢測,基于氣溶膠的檢測器,如蒸發光散射檢測器(ELSD)或電霧式檢測器(CAD)等,這些代表了高效液相色譜-質譜的一種方法,在未來可能會越來越受歡迎。高效液相色譜-質譜是一個非常通用和強大的工具,它可以被認為是一種特殊的檢測方法,這項技術雖然很昂貴,但檢測精度高的特點將使其在許多領域得到廣泛應用。

2.3 氣相色譜法分析木犀草素

氣相色譜法(Gas Chromatography,簡稱GC)是一種常用的物質分離和分析技術。氣相色譜可以與多種檢測技術相結合,如氣相色譜結合質譜(GC-MS)、氣相色譜結合串聯質譜(GC-MS/MS)或氣相色譜結合飛行時間質譜(GC-Tof-MS),從而大大提高了靈敏度和準確性。GC有不同類型的探測器,而不同類型的探測器具有不同的最佳工作溫度。例如,氫火焰離子化檢測器(FID)通常在300～400 ℃之間,以確保良好的離子化和檢測靈敏度。熱導檢測器(TCD)的工作溫度通常在100～200 ℃之間。所以GC所分析的物質應熱穩定,且其沸騰(或升華)溫度不應超過400 ℃。

GC的流動相選擇取決于分析目標和所使用的柱。在GC中,流動相通常指的是氣相載氣,它在色譜柱中傳遞樣品。通常情況下,氮氣、氫氣和氦氣是最常用的載氣選擇。這些氣體均為惰性氣體,不會影響樣品的分離和檢測。當然,載氣的流量需要根據柱的類型、分析目標和樣品性質進行適當的調整。較高的流量可以加快分析速度,但可能會影響分離效果和檢測靈敏度。選擇高純度的載氣以確保準確的分析結果。此外,載氣需要保持干燥以避免引入水分對分離和檢測產生干擾。某些柱具有特定的要求,需要選擇與柱相兼容的載氣。例如,使用具有極性固定相(比如聚酯或聚酰胺柱)的分析,可能需要使用氫氣作為載氣以獲得更好的分離效果。

在氣相色譜(GC)中,開放式柱(Open Tubular Column)是一種常用的柱類型。開放式柱也被稱為毛細管柱(Capillary Column),其內部是一個細長的毛細管。開放式柱的內徑通常在0.1～0.53 mm之間,相比之下,填充柱的內徑較大。這種細小的內徑使得開放式柱能夠實現更高的分離效能和更好的峰形。由于開放式柱的內徑較小,分析物在柱中的擴散速度更快,從而實現更高的分離效能。開放式柱通常具有較長的有效長度,提供更大的分離空間。開放式柱由于毛細管結構的特點,具有較好的熱傳導性能,適用于高溫分析。此外,由于柱內的氣體流動速度較快,開放式柱也適用于高速分析,提高樣品的分析效率。

木犀草素的分析按照分析其他類黃酮的一般程序進行(表4)。木犀草素揮發性的檢測采用質譜法,最常見的是氦氣被用作載氣。氣相色譜-質譜法可以作為一種特異性最高的補充分析技術。

表4 GC對木犀草素的分析

2.4 逆流色譜法分析木犀草素

逆流色譜法(Counter Current Chromatography,簡稱CCC)是一種無固定相的液相色譜技術,它利用兩種不相溶的液體相通過旋轉柱來實現樣品的分離和純化。CCC的原理基于兩種液相之間的分配平衡。它利用兩種不同極性的液相相互配平,其中一種液相為移動相(移相器)而另一種液相則為靜止相(靜相器)。

靜止相被固定在柱內,而旋轉柱使兩種液相形成重力計數并保持連續的混合和分離。CCC的基本步驟如下：首先準備兩種不相溶的液相,其中一種為移動相,另一種為靜止相,然后將兩種液相注入CCC柱中,使其分層。接著開始旋轉柱,產生離心力和地心引力,使兩種液相分散形成旋轉流動。在注入樣品進入柱時,樣品在兩種液相間進行分配平衡,并根據分配系數在兩相間移動。最后根據目標化合物的特性,逐步收集柱出口的分離物。

CCC不需要使用固定相柱,因此可以分離一些傳統液相色譜無法處理的樣品,例如高分子量化合物。CCC具有良好的分離效能和分離能力,能夠實現高分離度和純度的目標化合物。由于沒有固定相的吸附損失,CCC可以實現高藥物回收率。

表5給出了用快速逆流色譜法分離含有木犀草素的混合物的條件。從不同植物化學物質的混合物中分離木犀草素通常是用乙酸乙酯與醇和水的混合物中的一種進行的。分離后,需要用核磁共振測定結構。然而,代替核磁共振,高分辨率質譜(HRMS)也可以用于結構確認。

表5 CCC對木犀草素的分析

盡管逆流色譜法(CCC)有許多優點,但也存在一些缺點：CCC系統相對復雜,需要特殊的旋轉柱和控制裝置,這增加了設備配置和維護的復雜性,同時也增加了設備成本。它的成功與否高度依賴于液-液界面的管理。液-液界面的穩定性對分離效率和純化能力至關重要。然而,液-液界面不穩定容易引起相混合和擴散,從而降低分離性能。CCC需要選擇兩種不相溶的液相作為移動相和靜止相。找到合適的液相對于目標化合物的親疏性具有挑戰性。液相的穩定性、成本和可得性也是需要考慮的因素。由于液-液分配平衡的需求,CCC的流速通常較低,這導致分離和純化過程可能比較耗時。雖然某些改進的CCC系統可以處理大容量樣品,但普遍來說,樣品容量受到限制,使得大規模分離變得困難。在CCC中,柱的再生相對困難,因為靜止相固定在柱內,清洗和再生過程相對復雜。

3 結語

目前用于測定木犀草素的色譜方法提供了現有知識的系統總結。毫無疑問,色譜分析可以作為木犀草素定性評價和定量測定的有效方法。在繁瑣而耗時的多成分植物提取物的測定中,包括那些含有最普遍的木犀草素的植物提取物,將大規模色譜技術與不同檢測模式相結合是最有效的方法,如LC-MS/MS或LC/NMR/MS,這是一種非常有用的方法。色譜與其他分析技術的這種有益耦合擴展了其分析能力,同時還提高了測定的準確性、靈敏度和精密度。盡管LC在天然化合物分析中占據主導地位,新的色譜方法也在不斷發展,但TLC/HPTLC在木犀草素的植物化學分析中并沒有失去其重要地位。該技術相對簡單,價格低廉,同時便于對測試化合物進行快速定性和定量分析。此該技術還在不斷改進,其適用范圍正在擴大。在所有色譜技術中,氣相色譜是最不適合分析植物提取物的,包括那些含有木犀草素的植物提取物。盡管與各種檢測技術(MS、MS/MS、TOF-MS)相結合時具有很高的靈敏度和效率,但該色譜分離過程涉及高溫和分析物衍生化。正是由于這一點,氣相色譜法較少用于多酚類化合物的分析。雖然植物種類的復雜性是色譜分析中的一個難題,但色譜法仍然是目前測定天然化合物的主要分析技術。