“細胞間對話囊泡”外泌體在椎間盤退變治療中的研究進展*

王君坦, 張宇坤

華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院骨科醫院,武漢 430022

下腰痛(lower back pain,LBP)是一種世界范圍內常見的慢性疼痛性疾病,好發于體力勞動者以及長期久坐辦公人群。據不完全統計,全世界多達80%人群均遭受過不同程度的LBP癥狀,然而現有LBP的治療效果卻差強人意[1]。脊柱系統作為人體最重要的支撐系統,椎間盤組織起到了緩沖人體載荷的重要功能,是人體骨骼肌肉系統中重要一環。研究發現,LBP癥狀與腰椎間盤退變(intervertebral disc degeneration,IDD)息息相關。椎間盤由中央髓核(nucleus pulposus,NP)、四周纖維環以及上下軟骨終板組織構成。IDD的病理特征主要表現為髓核細胞(NPC)減少和細胞外基質(extracellular matrix,ECM)降解[2]。其中,髓核ECM是維持椎間盤彈性和功能的主要成分,其降解是IDD的主要病理特征之一。ECM的主要組分包括Ⅱ型膠原蛋白(collagen Ⅱ)和蛋白聚糖(aggrecan)。ECM的減少既包括合成減少亦包括分解增加,基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)MMP-3和MMP-13在ECM降解中起到了重要作用,這也是椎間盤退行性改變的重要標志物[3]。目前治療IDD的方法有限,多以手術清除病灶、藥物治療緩解疼痛為主,尚沒有能夠減輕IDD進程的有效藥物。因此,尋找減緩IDD進展,甚至逆轉IDD進程的治療方式,成為目前脊柱退行性疾病領域的研究熱點[4]。

外泌體是一種納米級細胞外脂質雙層囊泡,在生理及病理條件下幾乎所有細胞均可分泌,其直徑大約30～150 nm,密度1.13～1.19 g/mL;不同細胞來源的外泌體大小略有差異,也是其后期篩選的重要標志之一。初期研究認為外泌體只是被人體細胞舍棄的細胞外成分,后期研究發現,外泌體廣泛存在于人體的各個部位。外泌體呈扁平狀,內部包含核酸、蛋白質、脂質等生物大分子,既可以通過血漿遠處運輸,也可以在相鄰細胞間互相作用,對于細胞間交流以及維持細胞的蛋白質及脂質的平衡都具有重要的意義[5]。目前研究表明,外泌體有抑制細胞凋亡、抗衰老、促進增殖、抑制炎性反應的作用,同時還能促進干細胞向特定方向分化,其功能差異由其內含物決定。而外泌體的外雙層脂質能夠有效保護其內容物免受補體或巨噬細胞的清除,保證了外泌體內環境的穩定性。因此改變或者重塑外泌體內容物成了外泌體研究的熱點,也是外泌體臨床應用的關鍵步驟之一。

隨著表觀遺傳學、再生醫學和組織工程學研究的深入,細胞外囊泡——外泌體作為IDD治療的一種潛在手段被科研人員寄予厚望[6]。作為一種包含核酸、蛋白質、脂質等物質的磷脂雙分子層膜結構細胞外囊泡,外泌體的來源不具特異性,幾乎所有的細胞均可分泌外泌體[7],但目前以髓核間充質干細胞、骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)和脂肪間充質干細胞(adipose mesenchymal stem cells,AMSCs)來源的外泌體最為常見。同時,外泌體具有低免疫原性,不同來源的外泌體不會被機體免疫系統破壞清除[8],此特性也為外泌體治療IDD的臨床應用提供了巨大的潛力。本文將綜合分析外泌體研究在椎間盤退變領域的最新動態,對不同細胞來源外泌體的功能進行綜述,以期為后續外泌體研究及外泌體治療IDD的臨床應用提供參考。

1 外泌體的生物學來源

外泌體的產生以及分泌后被相關靶細胞攝取的機制尚不完全明確。目前的研究表明,外泌體來源于腔內囊泡。在高爾基復合體和溶酶體的作用下,多囊泡體通過依賴ESCRT(endosomal sorting complexes required for transport)途徑和非依賴ESCRT途徑內折形成腔內囊泡(intraluminal vesicles,ILVs),多囊泡體攜帶內部ILVs抵達質膜后,與質膜融合釋放出內部ILVs于細胞外形成外泌體[9]。研究發現,肌動蛋白細胞骨架調節蛋白-皮質素在調節外泌體分泌中扮演了重要角色,皮質素、Rab27a和coronin 1b共同調節多泡晚期內體中皮質肌動蛋白對接位點的穩定性,此過程被認為對外泌體的分泌起到了重要的調節作用。外泌體被靶細胞攝取主要通過3種方式:受體配體相互作用、直接膜融合和內吞作用,根據機體器官類型、炎性狀況以及靶細胞不同,攝取方式也存在很大差異[10-14]。

由于外泌體大小、質量、密度和沉降力等有所不同,目前外泌體的提取方法主要包括超速離心法、聚合物沉淀法和梯度離心法。在外泌體的鑒定方面,通常使用電子顯微鏡、納米粒子追蹤分析(nanoparticle trafficking analysis,NTA)、流式分析(flow cytometric analysis)、免疫印跡(Western blot,WB)等方法對外泌體的形態、數量、粒徑和標志物進行鑒定[15];在進行流式及WB鑒定時,常用CD90、CD105、CD73,、CD34、TSG101、ALIX、CD63、CD9、HSP70等分子作為標志物進行分析[16]。雖然外泌體分離及鑒定技術已逐漸成熟,但如何快速、有效、大量、高純度地制備特定外泌體以用于臨床疾病的治療,仍需進一步研究。

2 外泌體在緩解IDD進程中的作用及機制

作為細胞間交流的有效物質,外泌體內容物的多樣性影響著外泌體功能的多樣性,調節著細胞從核酸復制、轉錄到蛋白質合成、修飾等眾多細胞功能事件。外泌體磷脂雙分子層膜結構的穩定性保證其內容物在運輸過程中不易被破壞[17],從而確保了外泌體在細胞中發揮作用的有效性和及時性。外泌體結構的簡單性與穩定性,為“工程化”外泌體在臨床中的廣泛應用提供了可能。

隨著社會人口的老齡化,LBP在社會人群中的負面影響越來越引起重視。IDD作為LBP的主要病因,其發生機制尚不明確。目前認為,IDD的發病因素主要與衰老、機械因素、化學因素和遺傳因素息息相關。椎間盤微環境中的氧化應激和炎癥因子等加速了髓核細胞(NPC)凋亡和ECM分解,從而降低了椎間盤結構的穩定性,引起椎間盤突出癥、椎管狹窄癥等。因此,如何緩解NPC的凋亡、避免ECM降解,成為緩解甚至逆轉IDD的關鍵點[18-19]。本文將結合外泌體的生物學功能及其分子機制,從多角度闡述外泌體對NPC功能的影響,為外泌體在IDD臨床治療中的應用提供參考。

2.1 外泌體抑制NPC氧化應激

氧化應激(oxidative stress,OS)是指體內氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態,是導致衰老和疾病的一個重要因素。多項研究表明氧化應激是IDD發生發展的重要因素,能夠引起NPC凋亡和炎性因子、MMP等促ECM分解代謝產物的表達和釋放增加。細胞凋亡是一種細胞程序性死亡方式,被認為是NPC減少的主要方式之一。線粒體損傷產生的ROS是細胞內源性氧化應激的主要來源,最終引起NPC內源性凋亡和ECM降解。越來越多的研究表明,通過抑制氧化應激可以有效抑制NPC在各種應激條件下的凋亡水平,并在動物模型中緩解IDD進展[20]。Hu等[21]將骨髓間充質干細胞來源的外泌體(BMSCs-Exos)與壓力模型SD大鼠的NPC共培養,隨后通過CCK-8分析、MDA分析、TUNEL染色、JC-1染色、DCFH-DA分析等發現,隨著BMSCs-Exos濃度升高(0、20、50、100 μg/mL),壓力模型大鼠退變NPC的細胞活力顯著增強;同時,壓力誘導的線粒體損傷明顯減輕,ROS生成也顯著降低?？梢夿MSCs-Exos能有效減輕壓力對NPC的毒性作用,減輕細胞的氧化應激損傷,抑制壓力引起的NPC凋亡。

2.2 外泌體抑制NPC內質網應激

內質網(endoplasmic reticulum,ER)是蛋白質合成與折疊的場所,同時也參與維持鈣離子平衡。細胞內環境紊亂會導致內質網應激,引起內質網腔內錯誤折疊與未折疊蛋白聚集以及鈣離子平衡紊亂。新近研究表明,內質網應激與椎間盤退變的發生發展密切相關。Xiang等[22]在健康成年人尿液中挑選出CD29、CD44、CD73陽性的尿源性干細胞(urine-derived stem cells,USCs),并提取出大小在50～100 nm,且CD63和TSG101標志蛋白高表達的外泌體,與壓力條件下造模的NPC共培養。結果發現,外泌體共孵育組中內質網應激相關蛋白(GRP78和GRP94)及其相關蛋白表達水平顯著下降,內質網應激的凋亡調節因子(CHOP)表達降低,NPC凋亡相關蛋白Caspase-3、Caspase-12的表達明顯降低。上述結果表明USCs能通過抑制內質網應激有效緩解壓力誘導下NPC的凋亡,伴隨著未折疊蛋白反應(UPR)的分支蛋白激酶R樣內質網激酶(PERK)、肌醇依賴性激酶1α(IRE1α)的磷酸化水平降低,以及蛋白激酶B(Akt)和細胞信號調節激酶(ERK)的磷酸化水平升高。他們隨后對大鼠進行為期0、4、8周的壓力造模,同時進行或不進行外泌體注射治療,最后通過MRI、CT掃描和特征性TOCSY二維光譜檢測發現,外泌體的體內注射具有良好的抑制NPC凋亡作用?？偟膩碚f,USCs能通過Akt和ERK信號通路來抑制壓力誘導下髓核細胞內質網的應激和凋亡,從而在體內有效地減輕椎間盤退變。

2.3 外泌體調節NPC自噬

自噬(autophagy)是一種細胞內重要的分解代謝過程。在炎癥、營養缺乏、壓力條件下,正常水平的自噬通過降解和回收受損成分、有毒蛋白和細胞器,有助于細胞內質量控制和維持細胞存活。研究發現,增強的自噬流能有效降低細胞IL-6,IL-1β和TNFα的表達和分泌,抑制細胞衰老和凋亡[23]。研究表明,外泌體能夠促進自噬流水平,增加P62蛋白的表達[24]。Luo等[25]采用叔丁基過氧化氫(tert-butyl hydroperoxide,TBHP)進行IDD造模并收集正常軟骨終板干細胞(CESC)外泌體與退變軟骨終板干細胞外泌體,發現相比于退變組,正常組的CESC外泌體能夠通過PI3K/Akt自噬通路顯著增強NPC自噬活性,降低NPC凋亡水平。

2.4 外泌體抑制NPC的炎性小體激活

焦亡(pyroptosis)是細胞程序性死亡的一種形式,可被多種炎性小體激活。而炎性小體一旦激活,可導致多種促炎物質,如IL-1β和IL-18等炎性因子不斷釋放,并影響多種ECM分解代謝酶,如MMP、解聚蛋白樣金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs,ADAMTs)的表達,從而促進蛋白聚糖和膠原蛋白的分解代謝,進而影響IDD進程。細胞焦亡過程會伴隨著細胞質膜破壞和大量炎性因子分泌,因此抑制細胞焦亡是對抗炎性損傷的重要手段[26]。

Zhang等[27]研究發現,脂多糖可以誘導NLRP3介導的髓核細胞焦亡,同時引起cleaved Caspase-1、IL-18、IL-1β和NLRP3水平顯著上升。他們對MSCs與LPS誘導的髓核組織進行共培養后發現,MSCs能有效抑制NPC焦亡進程;當加入GW4869共培養48 h后,MSCs外泌體分泌被抑制,其對NPC焦亡的抑制作用被消除。而進一步研究證實,MSCs外泌體中miRNA-410水平極高,miRNA-410能直接與NLRP3炎性小體結合并抑制其下游信號,從而阻止細胞內焦亡反應,抑制IDD進展。

2.5 外泌體促進干細胞向髓核細胞轉化

隨著再生醫學、干細胞治療、基因工程研究的不斷深入,誘導全能干細胞分化成特定組織細胞,從而治療組織缺損、組織變異和組織退變等相關疾病,一直是臨床醫學研究的熱點。Zhang等[28]篩選出富含miR-15a的間充質干細胞外泌體,并將其與退變NPC共培養,發現ADAMTS4/5及MMP-3/-13蛋白轉錄和翻譯水平顯著下降,伴隨著蛋白聚糖、Ⅱ型膠原蛋白mRNA及蛋白水平顯著上升。進一步研究表明,miR-15a可直接通過PI3K/Akt和Wnt3a/β-catenin軸調節MMP-3水平,從而抑制細胞凋亡,促進ECM的生成并抑制ECM降解。他們通過甲苯胺藍染色證實,miRNA-15a能夠促進間充質干細胞軟骨分化。Luo等[29]研究發現,軟骨終板干細胞源性外泌體在0、20、40 μg/mL水平下與軟骨終板干細胞共培養后,趨化因子、SOX9、Ⅱ型膠原蛋白、Ⅰ型膠原蛋白和Acan的表達水平升高。他們發現外泌體可通過自分泌形式增強軟骨終板細胞的侵襲、遷移和分化能力。軟骨終板干細胞外泌體可有效提高軟骨終板干細胞中HIF-1α水平,通過促進Wnt信號傳導、增加GATA結合蛋白4(GATA binding protein 4,GATA4)及轉化生長因子β(transforming growth factor,TGF-β)的表達,促進軟骨終板干細胞向NPC轉化。

2.6 外泌體通過circRNA/miRNA調控IDD

miRNA是一種廣泛存在于真核細胞中、長度約為20～24個核苷酸的單鏈非編碼RNA分子,可以調節特定基因的表達水平。miRNA主要是與靶基因mRNA的3′ UTR通過堿基互補配對原則結合并抑制轉錄后翻譯,進行基因表觀遺傳學修飾和調節相關蛋白表達及信號通路的轉導,是基因轉錄后調節的關鍵因子。circRNA是一種閉環結構的ncRNA,其結構穩定且不易受RNA外切酶的影響,廣泛存在于真核細胞的細胞質及外泌體中。circRNA最常見作用是與miRNA結合,抑制相關miRNA功能,從而有效調節相關蛋白的表達及功能。miRNA/circRNA廣泛存在于外泌體中。由于細胞穩態不同、存在環境差別和細胞種類差異,miRNA/circRNA在外泌體中表達量及類型也千差萬別[30-31]。多項研究表明,外泌體能有效保護miRNA/circRNA在細胞傳遞過程中的穩定性,miRNA/circRNA也能有效抑制NPC凋亡、促進細胞增殖、抑制炎性反應,從而促進ECM合成,緩解IDD。因此,外泌體憑借其包含的miRNA/circRNA,在治療IDD上具有良好的臨床應用前景。

Yuan等[32]研究發現,人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell,hucMSC)外泌體包裹的miR-26a-5p能夠下調甲基化轉移酶14(METT14)表達,降低NLRP3、IL-1β和IL-18表達水平,抑制細胞焦亡及炎性反應,從而緩解IDD進程。Xu等[33]研究發現,來源于富含血小板血漿的包裹miR-141-3p的外泌體與過氧化氫(H2O2)誘導的退變NPC共培養后,miR-141-3p能夠與Kelch樣ECH聯合蛋白1(keap1) mRNA的3′ UTR結合,降低keap1的表達,引起核因子E2相關因子2(Nrf2)從keap1-Nrf2復合小體中釋放并從細胞質向細胞核轉位,從而發揮其抗氧化的生物學功能,最終抑制NPC凋亡;體內研究也表明,miR-141-3p可以通過keap1-Nrf2通路延緩IDD進展。Zhang等[34]的研究發現,自噬可以促進NPC來源外泌體的分泌,其包裹的miR-27a可靶向MMP-13,并抑制MMP-1、3、9、13以及ADAMTs 4、5基因的表達,最終增加蛋白聚糖、Ⅱ型膠原蛋白的表達,促進ECM穩定性。Xie等[35]分離包裹miR-31-5p的間充質干細胞源性外泌體,并將其與TBHP造模的退變NPC共培養。他們發現miR-31-5p顯著降低內質網應激激活作用轉錄因子6(ATF6)的表達水平,同時,NPC凋亡相關蛋白和鈣化相關蛋白顯著下降,內質網應激標志性表達產物下調。包裹miR-31-5p的外泌體能通過ATF6/ER-Stress通路減輕髓核細胞凋亡及鈣化,維持NPC活性,減緩IDD進展,從而對椎間盤組織起到保護作用。

3 外泌體與生物材料結合的新發展

目前,越來越多的研究表明,不同干細胞來源的外泌體能夠顯著延緩IDD進展。外泌體對于抑制NPC凋亡、代謝紊亂、ECM降解等作用亦日趨明確。通過干細胞來源的外泌體途徑治療IDD雖有效果,但無法避開干細胞外泌體被體內清除和破壞的弊端。干細胞來源外泌體無法在體內持久發揮作用是外泌體在臨床治療應用中遇到的一大阻礙,找到一種合適的方法促進外泌體的緩釋并減少其降解,成為外泌體研究的熱點方向。水凝膠(hydrogel)是一種親水類聚合物,具有通過共價鍵和氫鍵作用交聯形成的三維網絡結構[36]。水凝膠具有良好的生物相容性、較大的比表面積以及良好的生物可控性,是藥物和生物化學產物良好的載體,同時具有良好的生物支撐性[37]。水凝膠優良的特性,提示了其在臨床治療領域發揮作用的可能性。生物材料與外泌體的強強聯合,為抑制NPC凋亡和ECM代謝紊亂,延緩IDD進展打開了新的思路。

Xing等[38]采用脂肪間充質干細胞(ADSC)制備表達外泌體標志蛋白ALIX、TSG101的外泌體,同時采用新型方法制備了一種具有良好熱敏性、脫細胞成分的ECM水凝膠,這種新型水凝膠不含有毒的交聯劑,其特性更類似于髓核組織。他們將富集得到的外泌體固定于ECM水凝膠上,形成富含脂肪間充質干細胞外泌體的熱敏脫細胞ECM水凝膠(dECM@exo)。這種外泌體水凝膠在37℃時具有高粘度,同時其緩釋曲線表明,在28 d里dECM@exo逐漸釋放了大部分的外泌體,這表明其具有良好的緩釋性和持續性。他們將dECM@exo與NPC共培養,并進行免疫熒光、細胞活力測試和熒光染色等實驗,發現dECM@exo具有良好的生物相容性。而MMP13作為ECM降解的主要分解代謝酶之一,dECM@exo能有效抑制其表達,從而減少ECM降解。dECM@exo還降低了NLRP3、cleaved Caspase-1、NT-GSDMD和IL-1β的表達,并降低了細胞焦亡水平。在動物實驗中,他們通過針刺進行大鼠尾巴退變造模,在培養0、4、8、16周后進行椎間盤高度和免疫組化等檢測,發現dECM@exo能夠有效地維持椎間盤高度、抑制蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白分解,從而顯著延緩IDD進程。

4 總結與展望

目前的研究顯示,外泌體具有良好的抗炎、抗細胞凋亡、抗細胞外基質降解、促進干細胞分化、促細胞增殖的作用。外泌體還能通過非編碼RNA的細胞間遞送,進行表觀遺傳修飾并調節蛋白質表達及細胞功能。在IDD的治療中,外泌體能夠通過多種途徑抑制NPC凋亡并維持ECM合成和分解的穩定。雖然外泌體具有抑制IDD進展的作用,但其具體機制尚不完全明確。部分研究表明,外泌體具有“雙刃劍”功能,既可延緩退變進程,也可能加重退變[12],主要取決于外泌體來源的細胞。同時,如何有效地篩選、制備、存儲和運輸外泌體,也是外泌體研究的一大難題。其次,如何保證外泌體在椎間盤高滲、低氧環境下保持活性并長期有效釋放,從而持續發揮抵抗退變進展的作用,目前尚未得到答案。令人振奮的是,通過外泌體與生物技術有效結合,將外泌體與生物材料進行優勢互補,提高了外泌體在臨床實際應用的可能性。相信隨著對外泌體作用機制的不斷研究,外泌體在治療椎間盤退變及其他醫學領域的應用前景將更加光明。