體外人多能干細胞向間充質樣細胞分化、鑒定和純化方法的研究進展

王成剛, 李生振, 史嘉敏, 周 平

（1. 蘭州大學口腔醫院頜面外科，甘肅 蘭州 730000； 2. 甘肅省牙頜面重建與生物智能制造重點實驗室，甘肅 蘭州 730000； 3. 蘭州大學生命科學學院動物學與生物學系，甘肅 蘭州 730000）

腫瘤、創傷和先天畸形引起的組織器官喪失通常采用移植技術進行修復，但在臨床實踐中，存在組織來源有限、二次手術、免疫原性和倫理道德等諸多問題。近年來，組織工程技術的快速發展實現了骨、軟骨和肌腱等多種器官的再生，為臨床治療帶來了新的思路［1］。種子細胞是組織工程技術三大基本要素之一，目前最常用的種子細胞為多能干細胞（pluripotent stem cells，PSCs）［2］。間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs） 是一種經典的PSCs，分布于脂肪、臍帶和纖維組織等組織和器官中［3］。MSCs 來源于胚胎早期中胚層和外胚層，具有在體內外分化為三胚層譜系細胞的能力，如骨骼、軟骨和脂肪［4］。同時，MSCs具有較強的擴增能力，使其成為再生醫學和組織工程中應用最多的種子細胞。MSCs 還參與免疫調節、抑制炎癥、組織修復和分泌細胞生長因子等生命過程［5-6］。研究［7-8］表明：MSCs 具有修復骨關節炎軟骨、修復創傷缺損、治療冠狀動脈疾病和治療移植后并發癥等功效，在基礎研究及臨床治療方面具有廣闊的應用前景。但人體來源的MSCs 存在取材不便、來源有限和容易老化等缺點，限制了其應用。

MSCs 也可由人胚胎干細胞 （human embryonic stem cells， hESCs） 或人誘導PSCs（human induced PSCs，hiPSCs） 誘導分化為人PSCs 來源間充質干細胞（human PSCs-derived mesenchymal stem cells，hPSCs-MSCs）［9］。hESCs是受精3~6 d 后胚胎內的正常細胞，主要來源于囊胚內細胞團，早期體外培養hESCs 需破壞胚胎，存在倫理問題。研究者［10］在化學成分明確的培養基中誘導體外受精胚胎的卵裂球單細胞分化為hESCs，且不會引起胚胎破裂，因此由hESCs 向MSCs 分化的研究成為了熱點。hiPSCs 與hESCs 相似，是由人體細胞經重編程技術編輯得到的一類高度未分化細胞，其來源廣泛，具有自我更新及多向分化潛能，且不具有免疫原性［11］。hPSCs-MSCs具有與成體MSCs 相似的組織學特點和功能，有效克服了成體MSCs 的不足，其體外增殖能力強、來源豐富且免疫原性風險低，因此具有重要的科學研究意義和臨床應用價值［12］。但hPSCs-MSCs 也存在誘導效率低和鑒定標準不明確等問題?，F就hPSCs-MSCs 的分化、鑒定和純化方法進行綜述，分析目前存在的問題和不足，并展望其應用前景，以期為hPSCs-MSCs 在組織工程中的應用提供理論依據。

1 hPSCs 向間充質樣細胞分化方法

1.1 hPSCs 向間充質樣細胞分化將hESCs 和hiPSCs 向MSCs 進行誘導分化目前已經過多次嘗試。2005 年，BARBERI 等［13］報道：將hESCs 與小鼠骨髓基質細胞OP9 共培養以促進其間充質向分化，共培養40 d 后，采用流式細胞術分離得到CD73+細胞，于含胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的基礎培養基中培養1~2 周，誘導獲得具有成纖維細胞樣形態表現且陽性表達MSCs 表面標記物的細胞，即間充質樣細胞。隨后，收集hPSCs 培養過程中分化的細胞和使用間充質培養基誘導分化的方法被廣泛應用。

為了提高誘導分化效率，研究［14］對誘導分化的過程進行了優化，分為擬胚體（embryoid bodys，EBs）法和單層法。hPSCs 細胞團在懸浮培養過程中形成EBs，并可模擬體內胚胎發育過程，自發分化為三胚層細胞，其中中胚層細胞和外胚層細胞可進一步分化為間充質樣細胞。XU 等［15］采用EBs 法獲得hESCs-MSCs，將H1 hESCs 消化為小團塊并于超低黏附培養板中懸浮培養4 d 后獲得EBs，將EBs 轉移至明膠包被培養板上培養，將EBs周圍爬出細胞連續傳代，獲得間充質樣細胞；懸浮培養5、 7、 10 或14 d 亦可獲得hPSCs-MSCs。SHEYN等［16］利用從EBs 中爬出時間差異獲得2 種間充質樣細胞，均具有多向分化潛能，且早期爬出的細胞具有更強的成骨分化能力。

將干細胞培養基中已自發分化的間充質樣細胞轉移至MSCs 培養基中純化，以獲得足夠數量的細胞，稱為直接誘導法或單層法。不同實驗在此基礎上進行改進，以提高實驗效率。OLIVIER 等［17］在使用單層法培養hESCs 的過程中，去除培養基中維持細胞干性的因子以促進細胞分化，將hESCs克隆邊緣或中央自發分化的細胞機械分離出來，于DMDM+10% FBS+1% 青-鏈霉素+1% 非必需氨基酸的D10 培養基中培養4 周以上，直至形成較厚和多層的上皮細胞樣結構，分離該結構即可得到MSCs。該方法具有不需要滋養層細胞和避免異種細胞污染的優點，但手工挑選缺乏客觀標準，MSCs 中可能混有其他細胞。研究［18］通過延長干細胞培養基的換液時間以提高hESCs 的自分化效率，或直接采用間充質培養基，簡化實驗步驟，從而提高獲得MSCs 的效率。ESCs 培養于含FBS 和堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth facto，bFGF）的間充質培養基中，培養后可獲得大量hESCs-MSCs［19］。LIAN 等［20］在DMEM 中添加血清替代物（serum replacement，SR）、bFGF和血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）培養hESCs 1 周，獲得與MSCs 類似形態和表面標志物的細胞，且具有多向分化能力。然后在上述培養基中添加了表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF），誘導hiPSCs 分化為MSCs［21］。該方法的優點是可采用不含滋養層和不含血清的培養基誘導獲得MSCs，避免了外源性細胞污染的可能。盡管直接誘導法獲得MSCs 較為方便且實驗過程簡單，但存在分化周期長、分化效率低和無法模擬體內胚胎發育過程等問題。

近年來，經三維培養獲得hPSCs-MSCs 的方法受到關注。YAN 等［22］將消化后的hESCs 置于含Y-27632 的mTeSR1培養基中懸浮培養，經BMP4 和A83-01 誘導分化及MSCs 培養基培養后，于第20 天消化獲得MSCs 微球。研究［23］顯示：與二維培養比較，三維培養的MSCs 活性更強，并有較好的血管生成能力、抗炎能力和組織再生能力。

1.2 功能化合物促進hPSCs 向間充質樣細胞分化常規方法中誘導hPSCs 分化為MSCs 的效率較低，可在培養基中添加營養物質以提高hPSCs 的自發分化效率。營養血清中含有促進細胞向中胚層和內胚層分化的物質，且容易獲得，由此血清通常被添加至培養基中以促進細胞分化，最常用的為FBS［24］。此外，常使用血清替代物（knockout serum replacement，KSR）和白蛋白產品誘導分化細胞形成EBs［25］。但這些物質均含有動物源成分，存在微生物感染、免疫原性風險和選擇殺傷作用低等問題，因此尋找可促使細胞向中內胚層分化的功能性化合物成為了研究熱點。

LI 等［26］將重編程的鼠誘導PSCs （induced PSCs，iPSCs） 轉移至超低黏附培養板形成EBs，于不含白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）的ES 培養基中懸浮培養3 d 后轉移至含維甲酸（retinoic acid，RA） 的ES 培養基培養2 d，后分別于含轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β1、TGF-β3、bFGF 及骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）-2的ES 培養基中培養3 d，均可誘導iPSCs 向間充質樣細胞分化，且RA+TGF-β1 和RA+TGF-β3 可提高MSCs 的成骨分化效率，RA+BMP-2 可提高成軟骨分化效率，表明TGF-β 家族的細胞因子對干細胞分化具有重要作用。LIAN 等［21］在培養基中加入EGF 和bFGF 富集MSCs，促進其生長增殖。此外，血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）也可能有利于促進干細胞向MSCs分化，提高細胞增殖能力［14］。BRUSCHI 等［27］發現：生長因子Wnt3a 和激活素A 在BMP4 的協同作用下， 培養4 d 即可獲得大量hiPSCs-MSCs。ZHANG 等［28］發現： 聯合使用 LLY-507 和AZD5153 可以使hESCs 或hiPSCs 高效地向MSCs轉化，獲得的hPSCs-MSCs 具有CD73 和CD105 高表達特征，并表現出多譜系分化潛能、良好的細胞活力、促血管生成和免疫調節特性。研究［27，29-30］顯示：在hPSCs 的干性維持培養基中加入抑制劑可促進hPSCs 分化。CHEN 等［29］在含TGF 途徑抑制劑SB431542 的hiPSC 培養基中培養hPSCs，10 d 后發現細胞的中胚層基因表達上調而多能性基因表達下調，并將分化的細胞常規轉入MSCs 培養基中誘導分化。LIU 等［30］在hPSCs 培養基中加入ROCK抑制劑，后更換為MSCs 基礎培養基，成功使3 種干細胞分化為MSCs。研究［27］將hPSCs 培養于含Y-27632 的干性維持培養基中，去除Y-27632 后成功獲得了hPSCs 誘導生成MSCs 的中間產物EBs。

2 hPSCs-MSCs 的純化和鑒定

hPSCs-MSCs 具有較強的自我更新能力，可在傳代過程中被純化［31］。目前最常用的純化方法是將獲得的細胞轉入MSCs 培養基后連續傳代5~7 次［32］。經4 次傳代后，培養皿中的細胞便呈現均勻的長梭形［33］。此外，石倫剛等［34］將hESCs 懸浮培養10 d 后形成的擬胚體貼壁培養5~7 d，機械去除中心高密度部分細胞，保留周圍剩余細胞連續傳代， 提高了 hESCs-MSCs 的純化效率。MOORE 等［35］通過細胞過濾器對產生的MSCs 進行純化，細胞過濾器一般使用不同大小的微孔過濾細胞從而達到純化的目的。細胞過濾的方法可以相對縮短分化周期，但目前尚無統一且高效的hPSCs-MSCs 純化方法，使不同實驗獲得的細胞純度難以保障［36］。

2006 年，國際細胞療法學會間充質和組織干細胞委員會提出了鑒定hMSCs 的最低標準［37］。目前大部分hPSCs-MSCs 鑒定方法均參照此標準或改進此標準進行。但hPSCs-MSCs 作為一種特殊來源的MSCs， 需對其特性做出明確的界定。CHOUDHERY 等［38］在上述標準的基礎上提出了鑒定hPSC-MSCs 的最低標準，主要包括：梭形的成纖維細胞樣形態；標準培養條件下貼壁生長；陽性表達CD29、CD44、CD73、CD90 和CD105 等表面標志物，且不表達CD45、CD34、CD14 或CD11b、 CD79a 或CD19 及人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-DR 等造血干細胞表面標記物； 不表達OCT4、 SOX2、 Klf4、Nanog、Lin28、TRA-1-60、TRA-1-81 和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP） 等iPSCs 誘導因子；可以在體外進行成脂、成骨及成軟骨分化；不形成畸胎瘤；可以分泌MSC 相關旁分泌因子。除上述標準中所提出的表面標記物外，CD49、CD54、CD146、CD166 和HLA-ABC 也被認為是MSCs 的陽性表面標記物。與傳統的MSCs 相似，即使是同一批次細胞，hPSC-MSCs 內部也存在表型和功能差異的亞細胞群。應明確與hPSC-MSCs質量和功能相關的標記物，生產高質量的hPSC-MSCs，以滿足臨床應用的需求。

3 hPSCs-MSCs 與成體MSCs 性能比較

與成體MSCs 比較，hPSCs-MSCs 具有來源廣泛、質量可控制、可大量生產、低成本和高純度等優點。但hPSCs-MSCs 的分化效率較低，EBs 法和單層法均為利用hPSCs 的自發分化獲得間充質樣細胞，仍未實現高效的定向誘導分化。目前大多使用基質膠、FBS、小鼠胚胎成纖維細胞（mouse embryonic fibrolast，MEF）和明膠等動物源性成分誘導分化，但其具有成分復雜、批次差異及病毒污染等問題，長期誘導可能引起細胞性狀改變，與臨床應用存在較大差距。目前hPSCs-MSCs 尚缺乏高效的細胞純化方法，且無特異性標記物對獲得的間充質樣細胞進行鑒定，部分方法獲得的間充質樣細胞可能混雜殘留的hPSCs，有產生畸胎瘤的風險，對其進行細致監測難度較大。因此，大規模和高效地獲得高度純化、均一、穩定和生物安全性好的間充質樣細胞是亟待解決的關鍵問題。

4 hPSCs-MSCs 的應用前景

單純的iPSCs/ESCs 理論上可無限增殖并具有良好的分化能力，能夠滿足大數量細胞需求，但細胞的自我更新和多能性也可能會導致腫瘤發生和體內移植后的不穩定性。將hPSCs 誘導為MSCs 樣細胞可有利于后續定向分化，降低致瘤性，且細胞數量也可無限獲得。目前，hPSCs-MSCs 的應用潛能已表現在多個方面。

與成體來源的MSCs 比較，hPSCs-MSCs 具有更強的增殖能力、較低的免疫原性和更好的免疫調節能力［19，30］。hPSCs-MSCs 的免疫調節作用已在動物實驗中被廣泛證實。研究［39］顯示：hiPSCs-MSCs 與納巴霉素聯合作用可有效延長胰島移植存活時間，甚至誘導50%的受體產生免疫耐受。二者協同作用可以抑制炎癥細胞的滲透，并促進胰島素持續釋放。YU 等［40］發現：hiPSCs-MSCs 在心肺復蘇中具有免疫調節作用，小鼠心肺復蘇后注射定量hiPSCs-MSCs 可提高其生存率。研究［41］顯示：hiPSCs-MSCs 能夠影響巨噬細胞M1 表型和M2 表型之間的平衡，使可增加細胞損傷的M1 表型相關標記物水平降低和清除碎屑、促進血管化及組織重塑的M2 表型相關標記物水平升高，證實hiPSCs-MSCs 的免疫調節作用，并為缺血再灌注所造成腦損傷提供新的治療思路。CHUNG 等［42］研究顯示：由脂肪源性干細胞分化的iPSCs-MSCs仍保持MSCs 良好的分化能力，iPSCs-MSCs 與TGF-β 共同作用可治療肌肉和骨骼損傷，TGF-β可下調組織相容性Ⅰ類復合物表達，降低免疫排斥反應。 QIN 等［43］發現： hESCs-MSCs 可降低B10.RⅢ小鼠嚴重實驗性自身免疫性葡萄膜炎的發生。YANG 等［44］發現：將hiPSCs-MSCs 注射至腹膜內，可增加結腸長度并減小潰瘍面積，且hiPSCs-MSCs 可通過腫瘤壞死因子誘導蛋白6（tumor necrosis factor-induced protein-6， TSG-6）上調腸上皮表面標記物CD44 的表達，促進黏膜愈合，證實hiPSCs-MSCs 的黏膜治療作用。此外，MSCs 的旁分泌機制在血管化和肌肉再生中也可發揮作用［21］。

除調節免疫作用，hPSCs-MSCs 也可修復各類組織缺損。研究［45］顯示：hiPSCs-MSCs 生長于磷酸鈣支架上可促進成骨分化并引導骨再生。應用BMP-2 基因修飾hiPSCs-MSCs 的磷酸鈣支架對骨礦化能力具有促進作用［46］。 通過移植hiPSCs-MSCs 可減輕小鼠后肢缺血和改善肝功能［47］。QI 等［48］構建hiPSCs-MSCs 釋放谷胱甘肽過氧化物酶3 （glutathione peroxidase 3，GPx3），hiPSCs-MSCs-GPx3可有效抑制肝衰老，降低肝損傷。 JIANG 等［49］發現： 經玻璃體腔移植的hiPSCs-MSCs 可有效地將功能線粒體提供給視網膜神經節細胞，防止線粒體損傷所致的視網膜神經節細胞退變。GUO 等［50］發現：在心肌梗死小鼠模型中多次靜脈注射hiPSCs-MSCs 可不同程度地恢復小鼠的心臟功能。YOON 等［51］研究顯示：hESCs-MSCs 可恢復順鉑損傷后卵巢的結構和功能，通過向小鼠腹腔連續10 d 注射順鉑，建立卵巢早衰模型，靜脈注射hESCs-MSCs 后發現其可有效保護雌鼠卵巢功能并保留生育能力，為hESCs-MSCs 治療女性卵巢早衰的臨床應用提供了新的思路。

5 總結與展望

綜上所述，hPSCs 可通過EBs 法和單層法分化為間充質樣細胞，hPSCs-MSCs 表現出與成體MSCs 相似的生物學特點與功能，還具有來源廣泛、低成本和免疫原性更低等優點，進一步彌補了成體MSCs 的不足，具有重要的科研意義和臨床應用價值。同時，hPSCs-MSCs 可促進血管化和組織重塑，用于修復各類組織缺損，并具有抗炎、免疫調節和免疫抑制能力等作用，使其成為再生醫學和組織工程中應用最多的種子細胞。hPSCs-MSCs 能夠在再生醫學領域和組織工程領域展現出更大的優勢與價值，具有巨大的科研價值和廣闊的臨床應用前景。