雙生病毒AC4基因的克隆及原核表達

郝浩永,王 紅,劉 縉,關正君,李文清,楊先先

(1.運城學院 理科實驗中心;2.運城學院 生命科學系,山西 運城 044000)

雙生病毒是在世界范圍內廣泛存在的一類植物病毒[1],可侵染多種作物引起嚴重的病害,造成重大的經濟損失,并經常危及糧食安全[2,3]。雙生病毒具有小的單組份(DNA-A)或雙組份(DNA-A和DNA-B)單鏈環狀基因組DNA (約2.5～5.2 nt),編碼4～8個基因。

在雙生病毒科14個屬中,有4個屬,即甜菜曲頂病毒屬(Curtovirus) (3種)、番茄偽曲頂病毒屬(Topocuvirus) (1種)、蕪菁曲頂病毒屬(Turncurtovirus) (3種)和菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus) (>420種)均含有一個小基因AC4,該基因完全疊加在AC1基因中[4]。雙組份雙生病毒DNA-A上的C4基因被稱為AC4基因,單組份雙生病毒DNA-A上的C4基因被稱為C4基因或AC4基因,對其他基因的稱謂類似[4]。AC1基因在整個雙生病毒科的基因組位置和功能上是保守的[4]。AC4基因覆蓋在AC1基因靠近5′端的部分,AC4的密碼子相對于AC1的密碼子向后移動1個堿基,即+1位移碼[5-7]。AC4可能起源于AC1內的重疊機制,基因重疊允許病毒增加編碼能力,隨后增加遺傳變異,同時保持小而緊湊的基因組。這可以解釋AC4基因功能變異,并有助于雙生病毒多樣化和宿主跳躍。AC4基因相當大的變異不僅表現在序列上,而且也表現在其編碼的蛋白質長度上(58～140 aa);有趣的是,一些氨基酸殘基是保守的[8]。

在系統發育上,Begomovirus病毒的基因中AC4基因最易變異[8]。雖然AC4基因在少數Begomovirus中不發揮作用[9,10],但在大多數Begomovirus中具有多種生物學功能,例如病毒運動[11]、 RNA沉默的抑制[12-14]、癥狀誘導[15]、促進過敏反應[16]、誘導增生[17-19]、增加病毒積累[19]、提高耐旱性[20]、維持β衛星分子(betasatellite)的存在[21],以及增強番茄對白粉病的抗性[22]等。AC4基因還表現出與人類病毒“致癌基因”相似的功能[23, 24]。

有文獻[25]報道,中國番茄黃化曲葉病毒TYLCCNV-Y10分離物編碼的AC4蛋白和煙草曲莖病毒TbCSV-Y35分離物的AC4蛋白都是RNA沉默抑制子, 而 Y35 AC4 蛋白是一個比 Y10 AC4 蛋白更強的抑制子,推測 TbCSV-Y35 和 TYLCCNV-Y10 致病性差異可能與二者AC4蛋白的功能差異有關。

通常雙生病毒IR區的變異最大[26-29]。我們在前期研究中[30],將Begomovirus病毒分離物SXYC-X4(GenBank登錄號:KY499720)與其他25種病毒分離物的DNA-A及ORFs的序列比對,發現AC4蛋白氨基酸序列變異(32.9%～97.9%)大于IR區(61.5%～99.7%)及其他ORFs氨基酸序列的變異。在系統發育上,SXYC-X4與TbCSV-India(KF551584)的進化關系在DNA-A全序列水平較遠,在IR區水平稍近,在AC4氨基酸序列水平最近。由此推測,自然界中番茄黃化曲葉病毒(TomatoYellowLeafCurlVirus,TYLCV)與煙草曲莖病毒(TobaccoCurlyShootVirus,TbCSV)在AC4基因處可能已經發生了廣泛的重組,TYLCV有可能會獲得更強的致病性。

SXYC-X4AC4基因預期編碼一個約10 KD的蛋白質,其功能目前尚不明確。我們克隆了AC4基因,構建了AC4基因的原核表達載體,進一步優化了誘導表達條件,研究結果為下一步大量制備并分離純化AC4蛋白、制備抗血清及研究SXYC-X4AC4基因的功能奠定基礎,同時對解析雙生病毒的致病機制及開發綠色防控技術也具有指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料

確認已感染雙生病毒科菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)的番茄病株,于2016年8月采自運城學院新校區,主要癥狀為新葉黃化、卷曲,節間縮短等[30]。參照文獻[31],提取病株葉片基因組DNA作為病毒毒源,-20℃保存。以健康番茄葉片作為對照材料。

大腸桿菌DH5α、BL21(DE3),原核表達載體pGEX-4T-1為運城學院分子生物學實驗室保存;DNA Marker為合肥博美生物有限公司產品;克隆載體pGM-T為北京天根生物公司產品;蛋白質Marker、EX Taq、限制性內切酶EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ為TaKaRa公司產品;T4 DNA Ligase為GenView公司產品;引物合成委托生工生物工程(上海)有限公司完成;其余藥品為國產分析純。

1.2 AC4基因的克隆

根據TYLCV分離物SXYC-X4(GenBank登錄號:KY499720)序列,合成一對特異性引物TYAC4-F(5’-GAATTCACGAGAATGGGGAAC-3’,方框中ATG為起始密碼子,下劃線處為EcoR I酶切位點,)和TYAC4-R(5’-GTCGACTATAGTCCTTTGGGG-3’,與AC4基因終止密碼子下游10～25 bp處互補,下劃線處為Sal I酶切位點)。以番茄病株基因組DNA為模板,利用EX Taq對AC4基因進行PCR擴增,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR反應體系為:模板1 μL,EX Taq DNA 聚合酶(2.5 U/μL)1 μL,10×Buffer 5 μL,上下游引物(10 μM)各1 μL,dNTP Mixture(2.5 μM Each)10 μL,加入ddH2O補足至50 μL。PCR反應條件為:94℃ 5 min;94℃ 60 s,47℃ 45 s,72℃ 45 s,35個循環;72℃ 5 min。

PCR產物經切膠回收、純化后,依說明書連接至克隆載體pGM-T,轉化大腸桿菌DH5α,在LB固體培養基(含100 μg/L氨芐西林)上37℃培養12—16h進行藍白斑篩選,挑取白色單克隆菌落培養,堿裂解法提取質粒DNA,經EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ雙酶切鑒定重組質粒正確后,由生工生物工程(上海)有限公司進行測序?？寺〕晒Φ妮d體命名為pGM-AC4。

1.3 原核表達載體的構建

將重組克隆載體pGM-AC4與pGEX-4T-1分別用EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ雙酶切,回收目的片段后用T4 DNA Ligase進行連接并轉化DH5α,挑取部分單克隆培養,用測序引物GEX5(5’-GCAAGCCACGTTTGGTG-3’)和GEX3(5’- GAGCTGCATGTGTCAGAGG -3’) 做菌液PCR篩選陽性重組子。PCR反應體系同1.2。PCR反應條件為:94℃ 5 min;94℃ 60 s,50℃ 45 s,72℃ 45 s,35個循環;72℃ 5 min。將菌液PCR篩選為陽性重組質粒送生工生物工程(上海)有限公司進行測序,分析是否有移碼突變。序列正確的重組表達載體命名為pGEX-4T-AC4。

1.4 誘導表達

利用熱激法,將重組表達載體pGEX-4T-AC4轉化BL21(DE3)并進行涂板培養,挑取單菌落接種到LB液體培養基中(含100 μg/L氨芐西林),37 ℃振蕩培養至OD600nm≈0.6,加入IPTG至終濃度為0.50 mol/L,于28 ℃下誘導4 h(200 rpm),取1 mL菌液加入1.5 mL EP管中,離心1 min(12000 rpm),棄上清,重復三次,富集菌體。用200 μL滅菌蒸餾水重懸,再加入200 μL 2×SDS凝膠上樣緩沖液,沸水中裂解5 min,溫度降至室溫后,12000 rpm離心5 min,上清液立即進行SDS-PAGE,檢測GST-AC4可溶性融合蛋白,或-20℃保存備用。含pGEX-4T-1的BL21(DE3)菌液作為對照做相同處理。

1.5 誘導條件的優化

為獲得最佳的誘導條件,分別對IPTG誘導濃度、誘導時間及誘導溫度進行優化,使用SDS-PAGE檢測。

IPTG誘導濃度優化。細菌培養及處理方法同1.4,IPTG終濃度梯度設為0、0.10、0.25、0.50、1.0、2.0 mmol/L,28℃振蕩培養4 h(200 rpm)。

誘導時間優化。細菌培養及處理方法同1.4,時間梯度設為0、2、3、4、5、6 h,IPTG誘導濃度為0.5 mmol/L,28℃振蕩培養(200 rpm)。

誘導溫度優化。細菌培養及處理方法同1.4,溫度梯度設為25℃、28℃、32℃、35℃、37℃,IPTG誘導濃度為0.5 mmol/L,200 rpm振蕩培養4 h。

2 結果與分析

2.1 PCR檢測結果

以病株樣品和健康番茄基因組DNA為模板,利用引物TYAC4-F和TYAC4-R進行PCR擴增,從病株中擴增出大小約為330 bp的條帶,與預期大小一致,而健康植株中未擴增出,初步確認擴增出的條帶為番茄黃化曲葉病毒AC4基因(圖1)。

M:DNA marker; 1—2:健康番茄樣品; 3:感病番茄樣品。圖1 用引物TYAC4-F和TYAC4-R進行PCR擴增的結果

2.2 AC4基因測序結果

經測序,克隆到的AC4基因長294 bp,重組克隆載體暫命名為pGM-AC4。通過BLAST比對分析,克隆到的AC4基因與番茄黃化曲葉病毒分離物SXYC-X4的AC4基因序列完全一致。

2.3 AC4基因原核表達載體的構建及檢測

經菌液PCR檢測,部分重組原核表達載體能擴增出大小約為500 bp的條帶,而空載體僅能擴增出約170 bp的條帶,與預期大小一致(圖2),表明AC4基因片段已插入到載體pGEX-4T-1。重組成功的原核表達載體暫命名為pGEX-4T-AC4。經測序比對,pGEX-4T-AC4的序列未發生變異,讀碼框正確,可以進行下一步的誘導表達。

2.4 pGEX-4T-AC4的誘導表達

采用熱激法,將pGEX-4T-AC4和空載體pGEX-4T-1分別轉化大腸桿菌BL21(DE3)。經0.50 mol/L的IPTG在28℃下誘導培養4 h(200 rpm),SDS-PAGE檢測發現,pGEX-4T-AC4表達出大小約為36 KD的蛋白,與預測大小一致,未經過誘導的樣品則沒有該蛋白,含pGEX-4T-1的菌株在誘導后出現大小約為26 KD的蛋白。BL21(DE3)空菌株經IPTG誘導前后無明顯差異,說明pGEX-4T-AC4成功表達GST-AC4融合蛋白(圖3)。

2.5 最優誘導條件的篩選

菌體經過0.10～2.0 mmol/L IPTG誘導后均有目的蛋白表達,未經IPTG誘導的菌體幾乎無目的蛋白表達(圖4)。通過Tanon Image凝膠分析軟件測定(下同),隨著IPTG濃度的增加,GST-AC4融合蛋白的表達量呈先增加后穩定的趨勢。當IPTG濃度為0.50 mmol/L時,該蛋白表達量最高,繼續增加IPTG濃度后GST-AC4表達量基本不再增加。從經濟角度考慮,0.50 mmol/L是IPTG的最佳誘導濃度。

加入0.50 mmol/L IPTG后誘導不同時間的重組載體表達結果如圖5所示,經過2 h、3 h、4 h、5 h、6 h誘導后的菌體均有目的蛋白表達。通過凝膠分析軟件測定,結果顯示,隨著誘導時間的增加,GST-AC4融合蛋白的表達量呈先增加后降低的趨勢。當誘導時間為3 h時,該蛋白表達量最高,繼續增加誘導時間后表達量逐步降低,即誘導3 h是最佳誘導時間。

M:Premixed Protein Marker(Broad);1—6:誘導時間分別為0 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h。圖5 不同誘導時間對GST-AC4融合蛋白表達的影響

加入0.50 mmol/L 的IPTG后在不同溫度下誘導GST-AC4融合蛋白表達結果如圖6所示,分別在25℃、28℃、32℃、35℃、37℃下誘導3 h后的菌體均有目的蛋白表達。通過凝膠分析軟件測定,結果顯示,隨著誘導溫度的增加, GST-AC4融合蛋白的表達量呈先增加后降低的趨勢。當誘導溫度為32℃時,該蛋白表達量最高,繼續提高誘導溫度后表達量逐步降低,即32℃為最佳誘導溫度。

3 結果與討論

病毒的非結構蛋白在寄主體內的含量通常很低,一般很難從寄主體內提純這些蛋白。本文利用基因工程手段,克隆了雙生病毒非結構蛋白基因AC4,構建了原核表達載體,在BL21(DE3)菌株中成功表達了GST-AC4融合蛋白,進一步優化了誘導表達條件, 為大量制備AC4蛋白及研究AC4功能奠定基礎。

前期研究中[30],我們是分段擴增病毒DNA-A片段并將PCR產物直接測序的,本實驗只能以病株總DNA為模板擴增AC4基因,重復性不太好,非特異性片段也經常出現,增加了工作難度。在后期優化誘導表達條件時(圖4、圖5、圖6),效果不如最初(圖3),再重復優化前的實驗時,效果仍不理想,需進一步查找原因并改進。

本實驗使用原核表達載體pGEX-4T-1表達的GST-AC4融合蛋白,其活性還需進一步研究。下一步計劃構建AC4基因的真核表達載體,在畢赤酵母中表達AC4蛋白,比較在不同體系中表達的蛋白的差異。