溶劑梯度雙柱循環色譜在微量雜質分離制備中的應用

郝思怡，朱群英

（陜西省藥品和疫苗檢查中心, 陜西 西安 710075）

0 引 言

雜質是除了藥物中的活性成分以外的化學成分，其對藥物的療效與穩定性具有不良影響，同時還會產生毒副作用，從而影響藥物的臨床安全性。由于雜質的鑒定閾值比較低，傳統的分離方法如溶劑萃取等只能用于溶液的預分離，目前比較常用的雜質分離技術為色譜分離法[1-2]。常見的色譜分離技術包括柱色譜、循環色譜、薄層色譜等方法。其中薄層色譜法(Thin Layer Chromatography,TLC)是將固定相均勻涂抹在玻璃板上(或其他支物上，如塑料片或鋁制薄板)成膜，然后用適當的點樣器將樣品點加在薄層的起始線上，待溶劑揮發后，置入展開槽中，用一定的溶劑展開，當展開到適當距離時取出，晾干，顯色后定性、定量。

柱色譜包括高壓、中壓以及常壓制備柱色譜，制備柱色譜是目前應用最為廣泛的分離技術，其結構簡單，且具有很強的靈活性。但該方法要求各組分間必須存在較大的分離度，否則會導致產率不高等情況發生。此外該方法還存在非線性的吸附現象從而導致產品被過度稀釋[3]。模擬移動床（Simulated Moving Bed，SMB）技術主要通過改變樣品進出的方式實現固液兩相“模擬”逆流，實際上是實施色譜分離的高度工程化過程。相比于柱色譜技術，SMB 的處理規模大、分離效率高，但其工藝較為復雜且成本較高[4]。因此，綜合考慮制備工藝、設備成本以及分離效率，研究在雙柱循環色譜的基礎上引入了溶劑梯度，并將其應用于微量雜質的提取制備中，期望此方式能為雜質分離提取提供新思路。

1 溶劑梯度雙柱循環色譜的雜質分離與制備

1.1 溶劑梯度雙柱循環色譜的雜質分離

常見的色譜分離技術中的TLC 具有能同時分離多種樣品、固定相和流動相的選擇與變換靈活性大、可利用多種定性檢測技術(如物理和化學方法等)特點。但該方法操作量大且精度較低，因此應用較少。單柱循環色譜主要是通過閥門切換技術使譜帶在單色譜柱內進行循環往復流動，其能夠在不外加壓力的條件下延長等效柱長。但其易產生展寬現象，從而導致分離失敗，故研究對其進行改進并應用于雜質分離中，改進后的單柱型閥切換循環色譜改變了原溶質譜帶的經過路徑，其不再流入貯存池而是直接流入溶劑泵。該技術減小了柱外死體積，在一定程度上提升了分離效率。此外，零死體積循環色譜技術通過使用二位4 通閥形成了閉合回路，并在循環回路外設置了溶劑泵，該方法能夠有效避免由柱外死體積所造成的譜帶展寬現象，但目前該技術尚未應用到色譜的制備中[5-6]。交替泵雙柱循環色譜主要通過二位6 通閥來進行色譜柱的位置切換，且每個色譜柱的出口處都安裝了檢測器以對溶液譜帶的洗脫情況進行監測，其結構如圖1。

圖1 交替泵雙柱循環色譜Fig. 1 The alternating pump dual column cyclic chromatography

由圖1 所示，當檢測器1 監測信號值上升，且檢測器2 監測到信號值降低時，二位6 通閥將進行閥門的切換使譜帶流入色譜柱2 中。該色譜能夠在不使用泵的情況下使譜帶在兩個色譜柱間循環流動，且能夠避免由泵腔死體積引起的譜帶擴展情況發生，但其存在容納譜帶寬度不夠長的問題[7]。因此，研究基于此引入了捕集系統，并在循環系統中設置了捕集柱，由此形成了帶捕集系統的雙柱型循環制備液相色譜。該系統主要將純水注入捕集柱中以增加流動相的含水率，從而使溶液富集在捕集柱中，具體的裝置結構如圖2 所示。

圖2 帶捕集柱的雙柱型循環色譜Fig. 2 The dual column cyclic chromatography with capture column

帶捕集柱的雙柱型循環色譜處理起到富集作用，還可以在六通閥與十通閥之間進行耦合切換。但該系統要求流動相的含水率不能過高，否則可能會導致固定相的塌陷以及流失，從而造成捕集能力下降。此外，通過改進雙柱型循環結構基本能夠避免柱外死體積的情況發生，但在實際的雜質提取過程中，仍然存在渦流擴散、傳質阻力以及譜帶展寬等不良現象。其中，譜帶展寬主要是由非線性吸附和一些非理想因素造成的，其為雜質的分離過程帶來了嚴重的負面影響。譜帶展寬會對合格的流份進行稀釋從而導致其濃度降低，且容易引起分解變質。而譜帶壓縮機制能夠使譜帶前沿的遷移速度低于譜帶后沿，形成溶劑梯度，進而起到對譜帶的壓縮作用[8-9]。因此，研究進一步引入了溶劑梯度，并將其應用到雙柱循環色譜之中。該技術主要通過在雙柱之間不斷注入一種弱溶劑，從而在上下游的流動相間形成了洗脫強度差，使得處于上游柱中的譜帶后沿速度加快。這種方式很大程度地提升了循環色譜的分離性能，且有利于產品濃度的增加以及產量的提高，提高產率并增大產品濃度，與傳統的雙柱型色譜相比具有顯著優勢。因此研究將該技術運用到微量雜質的分離制備中，以解決雜質分離效率過低等問題。

1.2 基于溶劑梯度的雙柱循環色譜實驗

研究將引入了溶劑梯度的雙柱循環色譜應用到實際的關鍵前雜分離中，并設計了相應實驗進行測試。實驗選用的材料為奧利司他原料、乙腈、甲醇以及純凈水。實驗采用反相色譜對奧利司他進行分離制備，并選取甲醇與水的混合溶液作為流動相、C8 柱作為固定相。同時，實驗選用的裝置為溶劑梯度雙柱循環色譜裝置，該裝置的組成部分包括2 根色譜柱、1 個二位10 通閥、1 個檢測器和3 個高壓恒流泵，其具體裝置如圖3 所示。

圖3 溶劑梯度循環色譜裝置Fig. 3 The solvent gradient cyclic chromatography device

目標雜質的體積主要由洗脫劑中的水含量決定，通過增大循環色譜的下游水含量可以使譜帶收縮。但由于增加洗脫劑中的水含量可能會導致溶劑消耗增大、分離時間過長等問題，因此實驗將甲醇與水的比例設為了87/13 至89/11 之間。要實現目標雜質的分離與純化，必須保證雜質譜帶處于循環色譜系統的整個循環周期內，其中，譜帶的前沿不能流出下游色譜柱，而后沿必須從上游色譜柱被洗脫出來，具體表示如式（1）所示。

式（1）中，F1代表上游的洗脫劑流量，F2指的是下游流量，VR，up、VR，down分別表示上下游流動相組成下的關鍵雜質的保留體積，△t 代表循環周期。其中，上游流量不能過高，否則會對檢測器造成破壞，因此其流量設為3 mL/min，下游流量過大也會對譜帶的壓縮作用造成抵消，因此實驗將其設為了3.08 mL/min，同時，修飾劑流量設為了0.08mL/min。奧利司他的關鍵前雜分離實驗一共分為了三個階段，分別是進料階段、循環階段以及回收階段。其中進料階段是指在色譜裝置處于位置A 狀態時將原料全部注入到色譜柱1 中。在循環階段中，先添加洗脫液，再在設備中添加弱溶劑，使其成為改性劑。這時，前雜波段將由1 號柱子移入2 號柱子，閥將轉換到B 位。在此過程中，奧利司他的波段向下游移動，并向外排出，此時，目的波段由第2 色譜柱向第1 色譜柱傳遞，形成一個循環。在此基礎上，通過多個開關，可以將非靶標雜質排出體系，并將靶標雜質與整個能譜的前線分離?；厥针A段中，一般是在前雜與目標組分分離到一定程度時，對目標譜帶的前沿和后沿進行切割處理，并收集中間純度最高的部分作為最終產品。

溶劑梯度循環色譜分離技術需要對溶劑梯度、循環周期、洗脫劑含水率以及循環次數進行研究。實驗選取關鍵雜質的純度、產率以及收率幾個指標來對分離效果進行評價。收率計算表示如式（2）所示。

式（2）中，VProduct、VFeed分別代表產品以及原料的體積，AProduct、AFeed分別表示關鍵雜質在產品與原料中的峰面積。產率的計算如式（3）所示。

式（3）中，CFeed代表關鍵雜質在原料中的濃度，T表示運行時間，其中包括了進料、循環以及回收階段所消耗的時間。為了直觀看出濃度譜帶的收縮程度，還需要計算相對濃度，其計算如式（4）所示。

2 溶劑梯度循環色譜在雜質分離中的應用分析

研究為驗證溶劑梯度循環色譜分離技術的有效性，分別采用不同的洗脫劑含水率、溶劑梯度、循環周期，以及循環次數進行實驗對比，實驗條件及結果如表1 所示。

表1 溶劑梯度循環色譜分離技術的實驗條件及結果Table 1 The experimental conditions and results of solvent gradient cyclic chromatography separation technology

由表1 可得，洗脫劑含水率分別為11%、12%、13%，原料進料體積分別為52.9mL、62.4mL、73.3mL，循環周期時長分別為18.5min、21.5min、24.5min，溶劑梯度均為1.0%。不同洗脫劑含水量情況下的純度、收率與產率結果如圖4 所示。由圖4可知，洗脫劑含水率越高，產品的純度、收率以及產率均隨之提升。相比于11%的洗脫劑含水率，13%的洗脫劑含水率的純度、收率及產率分別提升了15.2%、7%、5.2%。說明洗脫劑含水量的增加有利于關鍵雜質與奧利司他的分離。同時可以看出，產率與收率隨水含量增加的趨勢逐漸變緩，說明循環周期對其影響逐步增加，倘若繼續增加含水量可能造成產率與收率降低且會增加溶劑消耗，因此研究選用的洗脫劑含水率為13%。此外，從三次實驗的關鍵雜質相對濃度的數據來看，可以說明溶劑梯度能夠實現對關鍵雜質的分離以及富集。

圖4 不同洗脫劑含水量的純度、收率與產率Fig. 4 The purity, yield, and productivity of different eluents with different water contents

實驗3~實驗5 主要考察了溶劑梯度對分離過程的影響，其中，實驗設置的洗脫劑均為13%，原料體積為73.3mL，循環次數均為8 次，循環周期均為24.5min，溶劑梯度依次為1.0%、2.0%、1.5%。同時需要保證在修飾劑流量不變的條件下改變修飾劑的含水量以調整溶劑梯度大小。由表1 可知，目標組分的相對濃度溶劑隨著溶度梯度的增大而增加，說明譜帶受到的壓縮力隨著梯度的增加而有所提升。溶劑梯度對產品純度、收率以及產率的影響效果如圖5 所示。由圖5 可知，產品的純度在溶劑梯度為1.5%時達到最高，其值為52.3%。因此研究選用的溶劑梯度為1.5%。

圖5 不同溶劑梯度的純度、收率與產率Fig. 5 The purity, yield, and productivity of different solvent gradients

實驗5~實驗7 主要考察了循環周期對分離效果的影響，其中，實驗設置的洗脫劑含水量均為13%，溶劑梯度均為1.5%，循環次數均設為了8 次，循環周期分別設為了24.5min、26.5min、28.5min。循環周期時長對產品純度、收率以及產率的影響效果如圖6 所示。由圖6 可知，產品的純度以及收率隨著循環周期的加長而增大，其中循環周期為28.5min 的產品純度為72.5%，相比于24.5min 的循環周期增長了20.4%。同時，循環周期為28.5min 的產品收率高達90.1%，說明隨著循環周期時長的增加，奧利司他與關鍵雜質的分離效果也隨之提升。但產率波動不大，主要原因在于其受到循環周期與收率的限制。此外，循環周期不宜過長，否則會導致目標組分流出下游的色譜柱，因此研究選用28.5min 作為循環周期。

圖6 不同循環周期下的純度、收率與產率Fig. 6 The purity, yield, and productivity under different cycle cycles

實驗7~實驗9 主要考察循環次數對分離過程的影響，其中，實驗設置的洗脫劑含水量均為13%，溶劑梯度均為1.5%，循環周期時長為28.5min，循環次數依次為8 次、10 次以及12 次。圖7 為循環次數對的純度、收率以及產率的影響結果。

圖7 不同循環次數下的純度、收率與產率Fig. 7 The purity, yield, and productivity under different cycles

通過圖7 可得，當循環次數為8~10 次時，隨著循環次數的增加，雜質的純度和收率均隨著循環次數的增加而提升，但循環次數從10 次到12 次的增長較為平緩。主要原因在于奧利司他以及關鍵前雜的總寬度會隨著循環系數的增加而增大，而譜帶壓縮機制會抑制總譜帶的展寬。因此當循環次數繼續增加到12 次時，譜帶的壓縮與總譜帶的展寬會趨于動態平衡，因此，研究選擇10 次作為最終的循環次數。

3 結 論

藥物微量雜質的分離提取對藥物的安全性具有重要影響作用。研究將溶劑梯度與雙柱循環色譜技術相結合，設計出了一種藥物雜質分離新方法。結果表明，在探究循環周期對分離效果的影響實驗中，產品的純度以及收率隨著循環周期的加長而增大，其中循環周期為28.5min 的產品純度為72.5%，相比于24.5min 的循環周期增長了20.4%。在探究洗脫劑含水率對分離效果的影響實驗中，產品的純度、收率以及產率隨洗脫劑含水率的提升而增加。在考察洗脫劑含水率對分離過程的影響實驗中，關鍵雜質的純度和收率隨著循環次數的增加而提升。說明溶劑梯度雙柱循環色譜技術能夠有效解決雜質分離效率過低、分離純度不高等問題。但研究對于溶劑梯度在雙柱循環色譜技術中的應用只考慮到反相層面，因此有待進一步改進。