一種玫瑰本草酵素的制備及其抗皮膚衰老功能的研究

惠美星,宋 虹,余 萍,閔祥博,矯艷平,趙 迪

(1. 江西仁仁健康微生態科技有限公司,江西 樟樹 331200;2. 渤海大學 食品科學與工程學院,遼寧 錦州 121013)

酵素是一種由酵母、乳酸菌和霉菌等多菌種發酵果蔬、菌菇和中草藥等原料而成的功能產品,因含有大量的生物活性物質(如維生素、礦物質、多糖、多酚、氨基酸、酶及一些次生代謝產物等),在食品、醫藥以及環境等領域應用相當廣泛[1-2]。據報道,全球酵素消費市場達27.4億美元,主要集中在美國和歐洲地區,而且酵素的發展空間和增長潛力非常大,預計年增長率在7%以上[3]。

酵素具有廣泛的生物學活性。Ahn等[4]發現,酵素在非細胞系統中對1,1-二苯基-2-苦?；伦杂苫?DPPH·)、羥基自由基(·OH)和H2O2自由基具有清除活性,并具有較高的螯合能力和還原能力;在細胞系統中,它表現出顯著的活性氧清除能力,抑制脂質過氧化,并誘導谷胱甘肽水平升高。Ahrén等[5]研究發現,植物乳桿菌DSM 15313發酵的藍莓粉具有顯著的降壓作用,可降低大鼠心血管疾病風險。Nam等[6]發現,攝入大豆酵素提取物能顯著降低空腹血糖和糖化血紅蛋白水平,同時保持較高的胰島素水平,這與Lim等[7]的研究一致,表明大豆酵素提取物在非胰島素依賴性糖尿病小鼠模型中具有抗糖尿病作用。Takagi等[8]發現,發酵的豆奶有降低乳腺癌風險的潛力。Abd Razak等[9]發現,以黑曲霉和少孢霉發酵碎米可能產生具有顯著抗氧化活性的成分,該酵素提取物有作為藥妝配方中抗衰老和/或抗色素沉著劑的潛力。

玫瑰(RosarugosaThunb)是一種落葉灌木,屬于薔薇科,具有重要的經濟和藥用價值,在我國許多地區都有栽培。玫瑰中含有維生素C、必需氨基酸(賴氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、纈氨酸和蘇氨酸)、脂肪酸、礦物質和其他生物活性物質[10],具有改善皮膚、抗衰老、抗氧化、免疫調節以及驅蟲的藥理作用[11-12]。然而,隨著花的枯萎,大部分的營養物質很容易流失,所以玫瑰常被加工成各種消費品,如食品工業中的果汁、果醬、果醋、酒和蛋糕原料等[13]。桑葚是桑樹的果實,含有豐富的維生素、微量元素、氨基酸、多酚及多糖等營養成分。桑葚可以緩解皮膚方面的問題,如減少隨著年齡增長出現的斑點和瑕疵,抑制自由基相關的氧化活性,從而使皮膚更健康和有光澤[14]。另外,桑葚具有良好的酪氨酸酶抑制活性,已經成為美白護膚產品的主要成分之一[15]。玫瑰茄富含生物活性物質,如花青素和其他類黃酮、有機酸和多糖,具有抗氧化、抗菌、抗炎、護肝和美白養顏的功效[16]。消費者日益豐富的需求將極大地促進酵素行業產品盡快實現多樣化。

本研究主要選擇3種具有抗氧化、美白潤膚功效且是藥食同源的重瓣紅玫瑰、桑葚及玫瑰茄為原料,利用植物乳桿菌(HCS03-001)、羅伊氏乳桿菌(HCS02-001)和鼠李糖乳桿菌(HCS01-013)益生菌進行發酵獲得玫瑰酵素,測定其理化成分、酶活性及其體外抗氧化活性,并通過人群實驗考察玫瑰酵素對膚色(美白)、淡斑、肌膚紋理及肌膚彈性的改善作用,以期科學評價該玫瑰酵素的理化品質和抗氧化能力,并為高附加值玫瑰酵素產品研發及玫瑰酵素功能性評價研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳植桿菌(LactobacillusplantarumHCS03-001)、羅伊氏粘液乳桿菌(LactobacillusreuteriHCS02-001)、鼠李糖乳酪桿菌(LactobacillusrhamnosusHCS01-013),以上菌株均篩選自健康嬰兒腸道或傳統發酵食品;重瓣紅玫瑰、桑椹、玫瑰茄,市售;低聚果糖、低聚異麥芽糖,保齡寶生物股份有限公司;無水葡萄糖,石藥集團圣雪葡萄糖有限責任公司;酵母蛋白胨、酵母浸出物,安琪酵母股份有限公司;L-蘋果酸,常茂生物化學工程股份有限公司;一水檸檬酸,濰坊英軒實業有限公司;KH2PO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O,江蘇科倫多食品配料有限公司;無水CaCl2,焦作市冠通化工有限公司;DPPH·,上海麥克林生化科技有限公司;羥自由基清除能力測定試劑,北京索萊寶科技有限公司;無水乙醇、鄰二氮菲、磷酸鹽緩沖液(PBS)、FeSO4·7H2O、乙二胺四乙酸(EDTA)、雙氧水(H2O2),國藥集團化學試劑有限公司,均為分析純。

1.2 儀器與設備

DNP- 420型培養箱,北京市永久光明醫療器械有限公司;PHS-25B型酸度計,上海大普儀器有限公司;JH723PC型可見分光光度計,上海菁華科技儀器有限公司;50 L發酵罐,沈陽升順機械設備有限公司;H1650型醫用離心機,長沙湘儀離心機儀器有限公司,Chromameter CR-400型三刺激比色計,日本美能達照相機有限公司;Mexameter MX18型皮膚黑色素和血紅素測試儀、SV600型皮膚圖像分析系統,德國Courage &Khazaka公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

活化培養基(質量分數):無水葡萄糖4.0%、酵母浸出物1.5%、酵母蛋白胨1.0%、L-蘋果酸 0.3%、一水檸檬酸 0.2%、KH2PO40.2%、無水CaCl20.05%、MgSO4·7H2O 0.006%、MnSO4·H2O 0.001%。

培養基配制:按照配方比例進行原料處理,配制培養基,pH調至5.0～7.0;115 ℃滅菌30 min后備用。

菌粉添加比例為0.05%(質量分數),使用常溫無菌水溶解菌粉,投入培養基中,發酵16～20 h,制得菌液。

1.3.2 酵素的制備

發酵培養基(質量分數):重瓣紅玫瑰5%、低聚異麥芽糖5%、桑椹1.5%、玫瑰茄0.5%、低聚果糖1%,加適量水,打漿后分裝,每瓶用飲用水補足至100 mL;接種量為5%(體積分數);37 ℃發酵72 h;發酵液在13 000 r/min下進行離心,60～70 ℃濃縮,65 ℃巴氏滅菌30 min,無菌灌裝。

1.3.3 理化指標的測定

多酚含量檢測主要參照GB/T 31740.2—2015 附錄A;前花青素(以前花青素B1計)含量檢測參照 GB/T 22244—2008;乳酸含量檢測參照GB 5009.157—2016;γ-氨基丁酸(GABA)含量檢測參照QB/T 4587—2013;超氧化物歧化酶(SOD)酶活檢測參照GB/T 5009.171—2003 第一法;游離氨基酸含量檢測參照GB 5009.124—2016。

1.3.4 抗氧化活性測定

取適量樣品經過濾及稀釋(10倍)后,用于抗氧化活性評定。按照姜峰等[17]的方法,測定不同發酵時間的玫瑰本草酵素發酵液對DPPH·和OH·的清除能力。

1.3.5 纖維素酶活力測定

參照《纖維素酶制劑》(QB 2583―2003)的標準方法進行。

1.3.6 果膠酶活力測定

采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法測定該酵素發酵過程中果膠酶酶活的變化[18]。

1.3.7 人群試驗

樣品:玫瑰本草酵素,35 mL,無安慰劑對照。

受試者:隨機邀請25周歲至55周歲人群,根據自身皮膚情況填報信息,以自愿原則篩選116名受試者,試驗過程中退出12人,最終有效樣本共計104人(男8人、女96人,平均年齡36.7歲)參與玫瑰酵素改善膚質人群試驗。

試驗周期:30 d。

測試方法:①試驗組每人每日早晚服用1袋玫瑰本草酵素(35 mL),試驗期間不使用任何化妝品;②受試者在連續飲用酵素在30 d后,采用三刺激比色計、皮膚黑色素和血紅素測試儀、皮膚色度及皮膚圖像分析系統,分別測試受試者面部皮膚色度、黑色素含量、皮膚紋理及彈性變化,受試者0 d面部皮膚情況作為空白對照。

2 結果與討論

2.1 玫瑰本草酵素基本成分

玫瑰本草酵素基本成分的分析結果見表1。由表 1 可知:玫瑰本草酵素中含有多種活性物質,如多酚、SOD、前花青素、乳酸、GABA、游離氨基酸,其中多酚含量、SOD酶活及前花青素含量分別為38 mg/g、33.2 U/mL和244 mg/kg,這與該酵素具有抗氧化能力密切相關[19-21]。玫瑰本草酵素作為一種功能性產品,通過乳酸菌發酵可更好地賦予其顯著的乳酸風味[22],其乳酸含量為5.5×103mg/kg,滿足現代消費者對健康的追求。特別是該酵素發酵過程中產生了GABA,含量為562 mg/kg。GABA作為營養補充劑及智力輔助劑被應用于功能食品,引起了廣泛的關注[23]。GABA主要由微生物細胞內谷氨酸脫羧酶(GAD)催化L-谷氨酸或其鹽類而進行生物合成。乳酸菌通常被認為是最安全有效的產GABA菌株[24],乳酸菌發酵會降低發酵系統的pH,更能提高GAD活性。在本研究中,乳酸菌發酵使酵素的pH有效降低,為提高GABA的產量提供了有利條件。另外GABA具有緩解焦慮、降血壓、改善睡眠、祛皺和美白的功效;在祛皺時,GABA可放松緊繃的肌肉神經組織,快速穿透皮膚,淡化細紋,增強肌肉本身的放松機能,起到快速祛皺功效[25]。此外,此酵素產品中游離氨基酸含量為0.68 mg/g,它對于細胞分裂、傷口復原和分泌激素等方面均起著重要的作用,而且能夠提高機體免疫力并促進肌肉合成[26]。

表1 玫瑰本草酵素主要成分測定

2.2 玫瑰本草酵素發酵液對DPPH·清除率的影響

DPPH·常用于體外抗氧化活性的評價[27]。因此,考察不同發酵時間的玫瑰本草酵素對DPPH·的清除能力,結果如圖1所示。由圖1可知:與未發酵樣品相比,發酵樣品清除DPPH·能力均顯著提高(P<0.05)。同時,該樣品清除DPPH·的能力隨著發酵時間的延長而增加。植物經乳酸菌發酵后,其抗氧化能力會顯著提高,抗氧化能力的增加與SOD酶活提升、多酚和前花青素類物質的轉化與代謝有關[2,19-20]。與未發酵底物相比,玫瑰本草酵素對DPPH·的清除能力提高了0.43倍(從61.80%提高到88.71%)。當發酵時間從40 h延長到50 h時,酵素抗氧化性趨于平衡,這是因為前期乳酸菌代謝旺盛,繁殖迅速,隨著發酵時間的延長,各營養物質迅速被代謝,生長pH發生變化,導致其發酵能力逐漸下降,在發酵后期DPPH·清除能力增加緩慢[28]。

圖1 玫瑰本草酵素發酵時間對DPPH·的清除能力Fig.1 Effects of rose enzyme fermentation time on DPPH radicals scavenging

2.3 玫瑰本草酵素發酵液對·OH清除率的影響

不同發酵時間的玫瑰本草酵素對·OH的清除能力如圖2所示。由圖2可知:與DPPH·清除效果相似,在考察條件下的發酵樣品對DPPH·的清除能力與未發酵樣品相比均顯著提高(P<0.05)。與未發酵底物相比,發酵50 h時,玫瑰本草酵素對·OH的清除能力提高了1.09倍(從20.72%提高到43.37%)。這可能是因為發酵引起底物的結構破壞,導致各種抗氧化化合物的釋放或合成[17,9]。

圖2 玫瑰本草酵素發酵時間對·OH的清除能力Fig.2 Effects of rose enzyme fermentation time on hydroxyl radicals scavenging

2.4 玫瑰本草酵素發酵過程中SOD酶活的變化

SOD酶是細胞防御系統中的一種主要抗氧化酶,存在于動物、植物和微生物中,是國際公認的細胞防御系統的主要抗氧化酶,具有延緩機體衰老、預防腫瘤生長及預防免疫系統性疾病等作用[29]。玫瑰本草酵素發酵過程中SOD酶活的變化如圖3所示。由圖 3 可知:在玫瑰花本草酵素發酵最初,SOD酶活為(6.12±2.16) U/mL,隨著時間延長,SOD酶活逐漸增強;在50 h時SOD酶活最高,為(41.55±3.21) U/mL,較起始提升了5.79倍,且具有顯著性差異(P<0.05),這與夏國燈等[27]研究結果類似。這可能因為在發酵過程中,微生物不斷繁殖,SOD酶得到了有效積累。此外,發酵后期(30～50 h),SOD酶活增長緩慢。王瑜等[30]研究發現,SOD 酶活不穩定且容易衰退,另外發酵后期微生物代謝速率有所下降,最終導致SOD酶活增長緩慢。

圖3 發酵過程中 SOD 酶活力的變化 Fig.3 Variation of SOD activity with fermentation time

2.5 玫瑰本草酵素發酵過程中總酚含量的變化

玫瑰酵素的總酚含量隨時間變化曲線如圖4所示。由圖4可知:在發酵過程中,酚類含量逐漸增加,直到最高產量(發酵40 h)。與未發酵底物相比,該玫瑰本草酵素中總酚含量從8.68 mg/mL增至90.62 mg/mL,提高了9.44倍,這一結果與Dulf等[31]的研究結果相一致,可見發酵可提高產品中酚類化合物的水平。Ajila等[32]認為,酚含量和成分的增加可以歸因于β-葡萄糖苷酶的作用,這是一種能夠水解β-葡萄糖苷鍵的酶類,因此可以從其結合形式釋放酚化合物。發酵過程中產生的酚類物質的變化取決于底物類型、使用的微生物以及發酵條件等[33]。

圖4 發酵過程中總酚含量的變化Fig.4 Variation of total phenol content with fermentation time

2.6 玫瑰本草酵素發酵過程中果膠酶酶活的變化

玫瑰本草酵素發酵過程中果膠酶酶活的變化如圖5所示。由圖5可知:隨發酵時間延長,果膠酶酶活呈現先升高再降低的趨勢,并基本于發酵30 h后略有浮動;在玫瑰本草酵素發酵第20 h,果膠酶活力達到最大值,為(50.28±3.87) U/mL,較起始提高了3.55倍。發酵結束玫瑰花本草酵素果膠酶酶活為(48.21±4.43) U/mL。

圖5 果膠酶酶活隨發酵時間變化規律Fig.5 Variation of pectinase activity with fermentation time

2.7 玫瑰本草酵素發酵過程中纖維素酶酶活的變化

玫瑰本草酵素發酵過程中纖維素酶酶活的變化如圖6所示。

圖6 纖維素酶酶活隨發酵時間變化規律Fig.6 Variation of cellulose activity with fermentation time

由圖6可知:隨發酵時間延長,玫瑰本草酵素的纖維素酶酶活先升高后降低,發酵至40 h時纖維素酶酶活從發酵初期的(4.32±1.18) U/mL升高至(30.80±1.63) U/mL,達到最高值,提高了6.13倍。

2.8 相關性分析

玫瑰酵素在發酵過程中均表現出相應的抗氧化能力,這可能是與玫瑰酵素中含有的SOD酶、總酚代謝產物有關,其相關性分析如表2所示。由表2可知:在玫瑰酵素發酵過程中,DPPH·清除率與·OH清除率之間呈極顯著的正相關性(P<0.01);SOD 酶活與DPPH·清除率和·OH清除率相關系數分別為0.945和0.866(P<0.01),總酚含量與DPPH·清除率和·OH清除率相關系數分別為0.884和0.746(P<0.01)。纖維素酶活力與SOD酶活力和總酚含量相關系數分別為0.967和0.952(P<0.01),而果膠酶酶活與SOD酶活和總酚含量相關系數分別為0.669(P<0.01)和0.527(P<0.05)。這說明發酵過程中,產生的纖維素酶和果膠酶隨發酵時間延長,酶活增加;SOD酶活和總酚含量水平與纖維素酶和果膠酶的酶活呈正相關性;與此同時,對應發酵時間的抗氧化性(DPPH·和·OH的清除率)表現出正相關性。

表2 相關性分析

2.9 玫瑰本草酵素膚質改善率的變化

皮膚是由活性氧和活性氮等活性物質引起的氧化應激的主要目標。這些活性反應成分(活性氧和活性氮)是皮膚色素沉著和皮膚老化的主要因素。一般認為具有抗氧化活性的物質具有抗衰老、美白和抗炎作用。紫外線輻射可誘導皮膚形成活性氧,如單線態氧和超氧陰離子,通過鐵催化氧化反應促進暴露組織的生物損傷。這些活性氧自由基(ROS)可促進黑色素生物合成,損傷DNA,并可誘導黑色素細胞增殖。Yamakoshi等[34]發現氧化應激在皮膚疾病發病機制中作用的證據。眾所周知,ROS清除劑或抑制劑如抗氧化劑可以減少色素沉著。此外,SOD是最重要的抗氧化酶之一,它催化超氧化物陰離子裂解為H2O2和分子氧。因此,本研究利用人群試驗評價該玫瑰酵素對志愿者的膚色、淡斑、肌膚紋理及肌膚彈性等指標的影響,結果如圖7所示。由圖7可知:使用添加該玫瑰本草酵素后,30 d內受試者膚色、淡斑、肌膚紋理及肌膚彈性等指標均有所改善;該酵素可有效改善受試者膚色水平53.33%,淡斑改善可達42.67%,皮膚的紋理和彈性分別改善36.27%和25.43%。本實驗結果將為評價酵素在抗皮膚衰老產品的功效、抗皮膚衰老產品原料的開發方面提供一定的理論和實驗依據。

圖7 玫瑰本草酵素對膚質改善率的影響Fig.7 Effects of rose enzyme on skin improvement rate

3 結論

在本研究中,使用植物乳植桿菌、羅伊氏粘液乳桿菌及鼠李糖乳酪桿菌對重瓣紅玫瑰、桑椹、玫瑰茄等進行發酵,制備了玫瑰本草酵素。該酵素的多酚、前花青素、乳酸、GABA、SOD酶活和游離氨基酸含量分別為38 mg/g、244 mg/kg、5.5×103mg/kg、562 mg/kg、33.2 U/mL和0.68 mg/g;與未發酵底物相比,玫瑰本草酵素對DPPH·及·OH的清除能力分別提高了0.43和1.09倍;抗氧化物質SOD酶活及總酚含量分別提升了5.79和9.44倍;果膠酶與纖維素酶的酶活分別提高了3.55和6.13倍。發酵過程中產生的纖維素酶和果膠酶隨發酵時間延長,酶活增加;SOD酶活和總酚含量水平與纖維素酶和果膠酶的酶活呈正相關;與此同時,對應發酵時間的抗氧化性(DPPH·和·OH的清除率)表現出正相關性。通過30 d人群實驗發現,該酵素可有效改善膚質(膚色水平53.33%,淡斑42.67%,皮膚紋理36.27%,皮膚彈性25.43%)?？梢?玫瑰本草酵素具有美白抗氧化的功能,可通過乳酸菌發酵有效地用于生產高價值產品,預見其在保健、美容和醫藥行業具有潛在的用途。