黑藻多肽亞鐵螯合物的制備及其抗氧化活性研究

唐裕芳，呂 秀，王 唯，石 宇

(湘潭大學 化工學院，湖南 湘潭 411105)

0 引言

多肽一般由2～100個連續氨基酸組成，為蛋白質水解中間產物，具有很高的營養價值.目前，越來越多的研究表明，多肽具有抗氧化[1]、降血壓[2]、抑菌[3]、免疫調節[4]等多種生物活性.多肽的生物活性一般受蛋白一級結構的影響，如果要進一步提高多肽的生物學效用，有必要對多肽結構進行相應的修飾處理，即在多肽的氨基和羧基上引入糖類、脂類、微量元素等基團，增強多肽的功能活性或賦予多肽其他的優良性質.分子修飾是解決制約活性肽發展與應用問題行之有效的策略之一，也是近年來食品科學和藥學領域研究中的一個重要發展方向.目前已報道的多肽的化學修飾大多集中在抗菌肽上，抗氧化肽的化學修飾研究相對較少.多肽氨基酸序列上富含氨基和羧基，通過其氨基氮原子或羧基上氧原子與金屬螯合反應是多肽化學修飾的策略之一[5-7].目前，多肽螯合的金屬種類主要有鐵、鈣、鋅、硒等，且研究發現多肽螯合金屬后，其抗氧化活性顯著增強，如豌豆低聚肽螯合硒后對1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)、2，2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽自由基(ABTS+·)和羥基自由基(·OH)的清除能力高于豌豆低聚肽[8]，大竹蟶多肽螯合鈣后抗氧化性增強，相當于α-生育酚的71.08%[9]，大豆多肽螯合亞鐵后對DPPH·、ABTS+·及·OH的清除能力增強[10].同時，相比傳統的補鐵劑、補鋅劑、補鈣劑，多肽螯合鐵、鋅、鈣、硒等金屬后，使鐵、鋅、鈣、硒穩定性增加，生物效價提高，更易于被腸道吸收.因此，多肽金屬螯合物不僅能滿足人們對氨基酸的需求，還能促進鐵、鋅、鈣、硒離子的吸收，對維持機體健康起著非常重要的作用.同時，多肽金屬螯合物較強的抗氧化性能還能激活機體中的抗氧化信號通路，緩解機體因環境脅迫而造成的氧化損傷.

黑藻屬于水鱉科黑藻屬植物，蛋白含量約有25%，小部分被用作魚類餌料、飼料，農田綠肥外，大部分直接被丟棄.所以，對黑藻深入開發研究，進行高附加值轉化可解決資源浪費和環境污染問題.目前，本課題組已制備了黑藻多肽并研究了黑藻多肽的抗氧化活性，發現黑藻多肽具有較強的自由基清除性能[11]，但利用黑藻多肽制備黑藻多肽亞鐵螯合物增強黑藻多肽抗氧化性的研究鮮見報道.因此，本研究通過單因素實驗確定制備黑藻多肽亞鐵螯合物的最佳條件，并對黑藻多肽亞鐵螯合物的結構和抗氧化活性進行了探究.本研究以期為黑藻高值化提供基礎數據和理論參考.

1 材料與方法

1.1材料與試劑

黑藻粗蛋白粉，西安朗德生物科技有限公司；1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2，2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、氯化亞鐵、無水乙醇、鹽酸羥胺、乙酸鈉、鄰二氮菲、L-抗壞血酸(VC)，上海麥克林生化科技有限公司；其余試劑均為國產分析純.所用到的水均為去離子水.

1.2 儀器與設備

THZ-82型水浴恒溫振蕩器；Agilent Cary 3500型紫外-可見分光光度計；Nicolet 380型傅里葉紅外光譜儀；DZF-6050AB型真空干燥箱；H1850型醫用離心機.

1.3 方法

1.3.1 黑藻多肽亞鐵螯合物的制備

1)黑藻多肽的制備：黑藻多肽制備參照本課組前期研究[11].黑藻粗蛋白粉以料液比1∶10充分溶于去離子水中，過濾，所得濾液中加入80%硫酸銨飽和溶液，充分攪拌后分裝于離心管中，于4 ℃靜置12 h后離心10 min(8 000 r/min).然后，收集離心管底的沉淀，并用去離子水溶解后裝于透析袋中于4 ℃條件下透析48 h.最后，透析袋中的溶液經冷凍干燥后得黑藻蛋白粉.黑藻蛋白粉先充分溶于去離子水中，以酶底比8.6%加入胰蛋白酶，將溶液pH值調到7.3后，于37 ℃條件下水解5.9 h，水解液冷凍干燥后得到黑藻多肽.

2)黑藻多肽亞鐵螯合物制備：黑藻多肽溶于去離子水中，充分溶解后加入抗壞血酸，攪拌均勻，然后調整pH值，并加入氯化亞鐵，恒溫條件螯合反應完成后，用無水乙醇沉淀反應物，離心.所得濾渣用無水乙醇清洗3次后，真空干燥獲得黑藻多肽亞鐵螯合物.

3)黑藻多肽亞鐵螯合物螯合工藝優化：考察黑藻多肽螯合亞鐵反應中多肽和氯化亞鐵質量比(1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、8∶1、10∶1)、反應溶液pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)、螯合溫度(20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃)、抗壞血酸添加量(1.5 mg/mL、4.5 mg/mL、7.5 mg/mL、10.5 mg/mL、13.5 mg/mL)、時間(20 min、30 min、40 min、50 min、60 min)對螯合率的影響，以確定黑藻多肽與亞鐵螯合反應的最佳條件.

4)黑藻多肽亞鐵螯合物純度檢測：①取一定量制備的黑藻多肽亞鐵螯合物加入50 mL乙醇，攪拌30 min后離心，取適量上清，加入過量的硫化鈉試劑，沒有黑色沉淀(FeS)生成，說明螯合物中游離亞鐵離子已除凈；②取適量黑藻多肽亞鐵螯合物于燒杯中，用蒸餾水溶解，加3～5滴茚三酮，加熱煮沸2～3 min，溶液顏色沒有變為藍色，說明螯合物中游離多肽已除凈.

5)多肽螯合亞鐵離子螯合率的測定：采用鄰菲羅啉比色法測定多肽亞鐵螯合物的亞鐵離子質量，以不加亞鐵離子的標準液為空白對照，在波長510 nm處測定吸光值，根據所得標準曲線y=0.04x+0.000 2(R2=0.999 9)，計算多肽亞鐵螯合物中的亞鐵離子質量.螯合率(η)的計算公式如式(1)所示：

(1)

式中：m0為反應溶液中亞鐵離子起始質量的數值，單位mg；m為多肽亞鐵螯合物中的亞鐵離子質量的數值，單位mg.

1.3.2 黑藻多肽亞鐵螯合物的表征

1)紫外-可見分光光譜分析：將黑藻多肽、黑藻多肽亞鐵螯合物和Vc配置成100 μg/mL的溶液，進行紫外全波長掃描(掃描范圍為200～400 nm).

2)傅里葉紅外光譜分析：取少量黑藻多肽、黑藻多肽亞鐵螯合物和Vc分別與干燥的溴化鉀研磨混合均勻，然后將混合粉末壓成1 mm的薄片，并進行紅外光譜掃描(掃描范圍為4 000～500 cm-1).

1.3.3 抗氧化活性測定

1)DPPH·清除率的測定：DPPH·清除率的測定參照唐裕芳等[11]、周蓉等[12]描述的方法，稍做修改.配制0.1 mmol/L 的DPPH-甲醇溶液，0.5 mg/mL的多肽、多肽亞鐵螯合物及VC溶液，VC為正對照.測試組，先分別取樣品液25 μL、50 μL、100 μL和200 μL，再依次分別加入475 μL、450 μL、400 μL和300 μL水，最后再加入500 μL DPPH-甲醇溶液，使得體系溶液總體積為1 mL；陰性對照組，以500 μL的甲醇溶液代替500 μL DPPH-甲醇溶液；空白組，依次加入500 μL水和500 μL DPPH-甲醇溶液.各組搖勻混合后室溫避光靜置30 min，于517 nm處測定吸光值.DPPH·清除率(r)的計算如式(2)所示.

(2)

式中：Ai為測試組樣品的吸光度值；Aj為陰性對照組樣品的吸光度值；A0為空白組樣品的吸光度值.

2)ABTS+·清除率的測定：ABTS+·清除率的測定參照唐裕芳等[11]描述的方法，稍做修改.取0.2 mL 7.4 mmol/L ABTS儲備液和0.2 mL 2.6 mmol/L過硫酸鉀儲備液混合均勻后，避光室溫放置12 h.臨用前混合液用pH 7.4的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋40～50倍，使其在734 nm處的吸光值為0.7±0.02，即得ABTS+·工作液.配制0.66 mg/mL的多肽、多肽亞鐵螯合物和VC溶液，VC為正對照.測試組，先分別取25 μL、50 μL、100 μL和200 μL樣品溶液，再分別依次加入800 μL ABTS+·工作液，最后往各管中補加一定體積的水，使得體系溶液總體積為1 mL；陰性對照組，以800 μL的磷酸鹽緩沖液代替ABTS+·工作液；空白組，依次加入200 μL的磷酸鹽緩沖液和800 μL ABTS+·工作液.各組混合均勻后室溫避光反應10 min，在734 nm處測定吸光值.ABTS+·清除率的計算如式(2)所示.

3)·OH清除率的測定：·OH清除率的測定參照唐裕芳等[11]述的方法，稍做修改.配制9 mmol/L的水楊酸-乙醇、9 mmol/L的FeSO4·7H2O和8.8 mmol/L H2O2溶液以及4 mg/mL的多肽、多肽亞鐵螯合物和VC溶液，VC為正對照.測試組，先分別取37.5 μL、75 μL、150 μL和300 μL樣品溶液，依次加入300 μL FeSO4·7H2O溶液，300 μL H2O2溶液，最后再補加入一定體積水，使得體系溶液總體積為900 μL；陰性對照組，以300 μL水代替300 μL H2O2溶液；空白組，依次加入300 μL水，300 μL FeSO4·7H2O溶液和300 μL H2O2溶液.各組搖勻10 min后，再加入300 μL的水楊酸-乙醇溶液，37 ℃水浴30 min，避光冷卻到室溫，在510 nm處測定吸光值.·OH清除率的計算如式(2)所示.

1.4 數據分析

所有試驗均重復3次，利用Origin 2018進行數據的統計分析和繪圖，數據結果均表示為平均值±標準差.

2 結果分析與討論

2.1 單因素試驗

根據文獻調研，螯合溫度、pH、時間、多肽與氯化亞鐵質量比和抗壞血酸添加量都會影響黑藻多肽與金屬的螯合率[13]，所以本文探究了以上幾個因素對黑藻多肽亞鐵螯合物螯合率的影響，實驗結果如圖1所示.

由圖1(a)可知，溫度對螯合率有顯著影響.當溫度從20 ℃升到30 ℃，螯合率從32.99%迅速提高至64.20%并達到最大.當溫度繼續升高至50 ℃，螯合率下降至32.97%.溫度進一步上升至60 ℃，螯合率輕微上升.在一定的溫度范圍內，溫度越高，分子間運動加快，有利于螯合反應的進行.但溫度太高，分子間運動過于劇烈，不利于螯合反應進行[14].螯合反應屬于放熱反應，且高溫會改變多肽構象，使得多肽的結合位點發生改變，進而影響多肽和亞鐵離子的結合[15]，這可能是螯合率在60 ℃有輕微上升的原因.這與劉晶晶等[16]的研究結果一致，過高或過低的溫度都不利于螯合反應的進行.因此，選定30 ℃為黑藻多肽螯合亞鐵的最佳溫度.

圖1 不同因素對黑藻多肽亞鐵螯合物螯合率的影響：(a)溫度；(b)pH；(c)時間；(d)多肽與氯化亞鐵質量比；(e)抗壞血酸添加量Fig.1 The effect of different factors on the chelation rate of HVR polypeptide Ferrous-chelate：(a)Temperature；(b)pH；(c)Time； (d)Mass ratio of polypeptide to FeCl2；(e)Amount of ascorbic acid

由圖1(b)可知，隨著pH的升高，螯合率呈現先上升后下降的趨勢.在pH 4.0～7.0范圍內，螯合率由36.52%上升至62.83%.隨著pH值繼續上升，螯合率下降.在偏酸性條件下，溶液中存在大量的氫離子，導致其和二價鐵離子形成競爭關系，不利于二價鐵離子和多肽的螯合反應[17].在偏堿性條件下，溶液中大量存在的氫氧根離子與二價鐵離子生成氫氧化亞鐵，氫氧化亞鐵極易被氧化成氫氧化鐵而生成沉淀，導致較少的二價鐵離子和多肽進行螯合反應[16].在鈣離子和豬骨肽及南極磷蝦蛋白水解物的螯合中也發現了類似的結果[18].因此，選定pH 7.0為黑藻多肽螯合亞鐵最佳pH值.

由圖1(c)可知，隨著反應時間的延長，螯合率先上升后下降.在第30 min，螯合率達到最大為63.83%.在較短時間內，二價鐵離子和黑藻多肽反應不充分，導致螯合率較低.但螯合時間較長，螯合上的二價鐵離子又會解離下來，導致螯合率下降.這和Zhang等[19]的研究結果一致.這結果也說明黑藻多肽能快速螯合亞鐵離子.因此，選定的最佳黑藻多肽螯合亞鐵時間為30 min.

由圖1(d)可知，在多肽和氯化亞鐵質量比為8：1時，螯合率達到最大為63.43%.再增加質量比時，螯合率反而會下降.這可能是因為當質量比小于8：1時，螯合體系中沒有足夠的多肽和二價鐵離子進行反應，導致螯合率偏低.當質量比大于8：1時，反應液離子強度增大，黏度增大，含鐵量較小，多肽和亞鐵離子接觸面積較小，導致螯合率降低，且易造成原料的浪費[14].因此，選定的最佳黑藻多肽和氯化亞鐵質量比為8：1.

由圖1(e)可知，VC濃度由1.5 mg/mL增加到4.5 mg/mL時，螯合率由42.12%升高64.53%，并達到最大.但隨著VC濃度進一步增加，螯合率下降.二價鐵離子不穩定易轉變為三價鐵離子，而VC是一種抗氧化劑，可以防止這種轉變.在VC濃度較低時，抗氧化作用弱，二價鐵離子容易生成了氫氧化鐵沉淀，導致螯合率下降.在VC濃度太高時，不僅增加VC用量，并且降低螯合反應體系的pH，導致螯合率下降[20].因此，選定的最佳VC添加量為4.5 mg/mL.

2.2 黑藻多肽亞鐵螯合物的表征

圖2(a)為黑藻多肽亞鐵螯合物、黑藻多肽、氯化亞鐵和Vc的紫外光譜圖.從圖2(a)可知，氯化亞鐵在紫外區域沒有吸收.黑藻多肽的最大吸收峰206.2 nm處，而黑藻多肽亞鐵螯合物的最大吸收峰藍移至200.7 nm，推測可能是由于多肽螯合亞鐵離子后，螯合物中多肽的某些基團結構改變，使基團的電子躍遷能級發生改變所致[21].上述結果與楊玉蓉等[22]的研究結果相似，表明黑藻多肽和亞鐵離子發生了配位螯合反應生成了新物質，即黑藻多肽亞鐵螯合物.Vc溶液的最大吸收峰在240～260 nm，而黑藻多肽亞鐵螯合物在此范圍內并沒有出現吸收峰，說明黑藻多肽亞鐵螯合物中沒有殘留的Vc.

圖2(b)為黑藻多肽亞鐵螯合物、黑藻多肽和Vc的FT-IR光譜圖.由圖2(b)可知，多肽與二價亞鐵離子螯合后，在3 700～3 000 cm-1的羥基和氨基伸縮振動導致的疊加峰[23]信號增強，可能是黑藻多肽中的羥基和氨基與二價鐵進行了螯合；1 400 cm-1左右的黑藻多肽氨基酸殘基側鏈基團-COO-伸縮振動峰[24]紅移至1 408 cm-1，并且信號減弱，表明羧基氧也是亞鐵離子螯合位點之一[25].酰胺Ⅰ帶(1 700～1 800 cm-1)是由C=O伸縮振動引起的，酰胺Ⅱ帶(1 600～1 500 cm-1)是由N-H的彎曲振動和C-N的伸縮振動引起的.黑藻多肽和二價鐵螯合后在酰胺Ⅰ帶吸收峰沒有發生位移，而在酰胺Ⅱ帶的吸收峰位置由1 551.07 cm-1藍移至1 500.29 cm-1，表明亞鐵離子和多肽酰胺鍵上的N-H和C-N鍵配合，這一研究結果在桃仁多肽中也有類似發現[22].羧基離子的反對稱振動峰在1 650 cm-1附近，對稱振動峰在1 400 cm-1附近，這兩波數處的吸收峰信號在螯合前后均出現強弱變化，推測羧基可能以共價鍵的方式和鐵離子結合[14，26].這些結果表明黑藻多肽中的氨基、羧基、羥基、酰胺鍵可能參與了與亞鐵離子的螯合反應，進一步證實了螯合物的形成.1 300～1 400 cm-1是指紋區，每個化合物都有相對應的指紋吸收.1 322 cm-1處的吸收峰為Vc的C-O-C不對稱伸縮振動模式，1 764 cm-1處的吸收峰為Vc的C=O伸縮振動模式，1 027 cm-1處的吸收峰為Vc的C-O-C對稱伸縮振動模式[27]，但在黑藻多肽亞鐵螯合物中并沒有發現這些特征吸收峰，說明黑藻多肽亞鐵螯合物中沒有殘留的Vc.

圖2 黑藻多肽亞鐵螯合物及黑藻多肽的紫外光譜圖(a)和傅里葉紅外光譜圖(b)Fig.2 (a)UV-Vis and (b)FT-IR spectra of HVR polypeptide Ferrous-chelate and HVR polypeptide

2.3 黑藻多肽亞鐵螯合物的抗氧化活性評價

2.3.1 DPPH·清除作用

本工作探索了黑藻多肽亞鐵螯合物的抗氧化活性，其對DPPH·、ABTS+·、·OH的清除率如圖3所示.

由圖3(a)可知，隨著螯合物的濃度從12.5 μg/mL增大至100 μg/mL，螯合物對DPPH·清除率從4.32%增加至80.51%，而黑藻多肽在此測試濃度范圍內對DPPH·清除率最高僅有0.19%.黑藻多肽亞鐵螯合物濃度為100 μg/mL時，對DPPH·清除率(80.51%)高于李文軍等[10]研究的大豆多肽鐵螯合物在4 000 μg/mL時的清除率(78.37%).這可能是因為不同來源的多肽和亞鐵離子結合后，空間構象發生變化不一致，暴露出來的可為DPPH·提供電子或質子基團的種類不同導致[28].黑藻多肽亞鐵螯合物的DPPH·清除活性IC50值為66.06 μg/mL，而段秀[29]研究的羅非魚皮膠原蛋白肽亞鐵螯合物的DPPH·清除活性IC50值為840 μg/mL.黑藻多肽亞鐵螯合物的DPPH·清除率雖弱于陽性對照VC，但仍呈現出較高活性.

2.3.2 ABTS+·清除作用

由圖3(b)可知，隨著螯合物濃度從16.5 μg/mL增大至66 μg/mL，螯合物對ABTS+·清除率從28.09%增大至97.14%.而黑藻多肽在此測試濃度范圍內對ABTS+·清除率最高僅有28.29%.黑藻多肽亞鐵螯合物對ABTS+·的清除能力高于李文軍等[10]制備的大豆多肽亞鐵螯合物和龐忠莉[30]制備的牡蠣亞鐵螯合物.黑藻多肽和黑藻多肽亞鐵螯合物對ABTS+·的IC50值分別為119.52 mg/mL和27.77 mg/mL.而段秀[29]研究的羅非魚皮膠原蛋白肽亞鐵螯合物的IC50值520 mg/mL.因此，黑藻多肽亞鐵螯合物的ABTS+·清除能力與文獻中報到的螯合物相比具有較大的優越性.

2.3.3 ·OH清除作用

由圖3(c)可知，在125～500 μg/mL范圍內，隨著濃度增加，黑藻多肽和黑藻多肽亞鐵螯合物的·OH清除率呈增長趨勢.而在500～1 000 μg/mL范圍內，黑藻多肽和黑藻多肽亞鐵螯合物的·OH清除率增長緩慢，且在1 000 μg/mL兩者的·OH清除率分別達到59.91%和63.26%.在測試濃度范圍內，黑藻多肽亞鐵螯合物對·OH的清除率顯著高于黑藻多肽對·OH的清除率，這結果表明黑藻多肽亞鐵螯合物的抗氧化能力高于黑藻多肽.黑藻多肽亞鐵螯合物濃度為500 μg/mL時，對·OH的清除率(61.75%)明顯高于2倍濃度下(1000 μg/mL)大豆多肽亞鐵螯合物的·OH清除能力(約24%)[10].這可能是因為黑藻多肽和二價鐵螯合后，氨基酸的組成和排列發生變化；或者是因為氨基酸的相互作用增強從而導致供氫能力增強，最終使得螯合物的·OH清除能力增強[28，31].然而相比于黑藻多肽亞鐵螯合物對其他自由基的清除活性，其對·OH的清除活性較低，這可能是因為二價鐵是過渡金屬離子，在此條件下，超氧陰離子和過氧化氫可以產生·OH，使得螯合物的·OH清除能力較弱[29].

注：圖中不同小寫字母表示相同物質下不同濃度的清除率之間差異顯著(p<0.05)；圖中不同大寫字母表示相同濃度下不同物質的清除率之間差異顯著(p<0.05).圖3 黑藻多肽亞鐵螯合物、黑藻多肽和Vc的清除率：(a)DPPH·；(b)ABTS+·；(c)·OHFig.3 The scavenging rate of HVR polypeptide Ferrous-chelate，HVR polypeptide and Vc：(a)DPPH·；(b)ABTS+·；(c)·OH

3 結論

通過單因素實驗，確定了黑藻多肽螯合亞鐵離子的最佳螯合工藝為螯合溫度30 ℃、螯合pH 7.0、螯合時間30 min、多肽和氯化亞鐵質量比8∶1、抗壞血酸添加量4.5 mg/mL，螯合率達64.53%.對螯合前后的物質進行光譜分析可知，二價鐵和黑藻多肽中的羥基、氨基、羧基及酰胺鍵以共價鍵的形式結合.黑藻多肽螯合亞鐵離子對DPPH·、ABTS+·和·OH的清除率顯著提升.研究結果為研發具有更強抗氧化活性的黑藻多肽產品提供理論基礎和技術支持.