不同添加劑對越冬后許氏平鲉生長、抗氧化及免疫性能的影響

王曉艷，王成強，孫曉宇，李培玉，郝甜甜，黃利娜，李寶山，黃炳山

（1.山東省海洋資源與環境研究院/山東省海水漁用飼料工程技術研究中心/水生動物營養與飼料研發創新示范平臺/山東省海洋生態修復重點試驗室/煙臺市海珍品質量安全控制與精深加工重點實驗室，山東 煙臺 264006；2.濟寧市任城區行政審批服務局，山東 濟寧 272000）

許氏平鲉（Sebastes schlegelii）隸屬于鲉形目(Scorpaeniformes)鲉科(Sebastidae)平鲉屬(Sebastes)，主要分布于我國渤海、黃海、東海，以及朝鮮半島、日本、鄂霍次克海，是一種近岸冷水肉食性魚類，具有耐低溫、抗病強的特點，適宜人工魚礁資源增殖和網箱養殖[1]。近年來，隨著深水網箱養殖技術的快速發展，許氏平鲉網箱養殖的規模和產量也在逐年增加。我國北方海域冬季嚴寒，越冬期間不投喂，在長期低溫和饑餓的雙重壓力下，魚類免疫系統會發生重大調整以適應環境變化[2]。長達4個月的低溫和饑餓應激會對魚體健康產生明顯損傷，而在越冬后通過普通飼料投喂很難在短時間內幫助機體恢復健康[3]，因此迫切需要尋找能夠快速恢復魚體機能的方法。目前已有魚類越冬期間的生理變化及死亡率[4-5]的研究，但未見關于海水網箱養殖魚類越冬后營養調控的研究報道。因此，本研究針對越冬后許氏平鲉生理特點，分別通過復合菌制劑、抗菌肽及植物多酚3 種不同的營養策略對越冬后的許氏平鲉進行營養干預，以期尋找快速恢復魚體機能的方式，提高網箱養殖效率，同時為網箱養殖魚類越冬后功能飼料的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料

以魚粉、酪蛋白和發酵花生粕為主要蛋白源，以魚油為主要脂肪源，設計粗蛋白質量分數約為52%，粗脂肪質量分數約為11%的基礎飼料（對照），在對照組飼料表面使用復合益生菌[丁酸梭菌（Clostridium butyricum）10 mL/kg、復合乳酸菌15 mL/kg、芽孢桿菌（Bacillus）15 mL/kg，與等體積水混勻后，均勻裹在飼料表面]為復合益生菌組，在基礎配方中添加質量分數分別為0.5%抗菌肽（山東深海生物股份有限公司提供）和0.05%植物多酚（山東禮恩生物科技有限公司提供），為抗菌肽組和植物多酚組?；A飼料組分質量分數見表1，飼料常規成分組成見表2。

表1 基礎飼料組分質量分數Table1 Mass fraction of basic diet components %

表2 實驗飼料常規成分質量分數及能量（干基）Table 2 Mass fraction of nutrients and energy of experimental diets(dry mass basis)

1.2 實驗對象及飼養管理

養殖實驗在山東省海洋資源與環境研究院循環水養殖系統內進行，選用同一批次在自然海域網箱中越冬約4 個月(12 月初至次年4 月初)的許氏平鲉作為實驗對象，用對照組飼料馴養2 周以適應養殖系統及飼料。正式實驗開始前挑選出144尾初體質量（Initial body mass,IBM）為(249.13±0.58)g、大小均勻、體質健壯的許氏平鲉，隨機分為4組，每組3個重復，每個重復12 尾魚。養殖實驗進行21 d，每天定時定量投喂兩次(8:00 和16:00)，初始投喂量約為體質量的1%，根據攝食情況調整投喂量至表觀飽食，投喂30 min 后排殘餌。馴養及實驗期間控制水溫(14±1)℃，溶氧＞6 mg/L，pH 7.6～8.2，氨氮和亞硝酸氮質量濃度均小于0.1 mg/L。

1.3 樣品采集與實驗方法

養殖結束后，禁飼24 h，MS-222 (100 mg/L)麻醉后，每桶魚計數并稱末體質量（Final body mass,FBM），以計算增重率（Weight gain rate,WGR）和存活率（Survival rate,SR）。每桶隨機取6 尾魚，尾靜脈取血，分離腸道用于炎癥相關基因相對表達量的測定。所有操作均在無菌冰盤內完成，腸道樣品置于無菌凍存管中經液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱待測，血液于4 ℃靜置4 h 后離心(4 000 r/min,10 min)，取上清液保存于-20 ℃冰箱待測。

血清總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、溶菌酶（LZM）、酸性磷酸酶（ACP）、免疫球蛋白M（IgM）、補體3（C3）、總蛋白(TP)、白蛋白（ALB）、谷丙轉氨酶（ALT）及谷草轉氨酶（AST）活性均使用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定。

1.4 qPCR測定

根據本實驗室轉錄組測序結果及許氏平鲉基因組（CNP0000222）數據，查找白介素（Interleukin,IL）IL-1β、IL-15、IL-12b，Toll 樣受體8(Toll-like receptors,TLR8)基因序列，在NCBI Nucleotide BLAST 進行同源性比對，確定同源性較高的基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件設計引物（序列見表3），以核糖體蛋白L17 (RPL17) 為內參基因。使用SPARKeasy Improved Tissue/Cell RNA Kit 進行腸道樣本總RNA 提取，使用Nanodrop?2000 (Thermo Fisher Scientific,USA)檢測RNA 濃度及純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性及基因組污染情況，使用SPARKscript II RT Plus Kit（with gDNA Eraser）去除基因組DNA 并反轉錄成cDNA。使用2X SYBR Green qPCR Mix（with ROX)進行qPCR（LightCycler?480II）分析。按照2-ΔΔCt計算目的基因相對表達量。

表3 許氏平鲉腸道相關基因引物序列Table 3 Sequence of primers for gut related genes of Sebastes schlegelii

1.5 數據統計

所有數據采用SPSS 18.0 進行單因素方差分析（one-way ANOVA），用Duncan’s 檢驗進行多重比較分析，P ＜0.05 時認為差異顯著。統計數據以平均值±標準差表示。

2 結果

2.1 不同添加劑對越冬后許氏平鲉生長性能的影響

由表4 可見，抗菌肽組和植物多酚組末體質量和增重率顯著高于對照組和復合益生菌組（P ＜0.05），復合益生菌組與對照組差異不顯著（P ＞0.05）；各組間存活率差異不顯著（P ＞0.05）。

表4 不同添加劑對越冬后許氏平鲉生長性能的影響Table 4 Effects of different additives on growth performance of Sebastes schlegelii after overwintering

2.2 不同添加劑對越冬后許氏平鲉抗氧化性能的影響

由表5 可見，不同添加劑對越冬后許氏平鲉的血清抗氧化性能具有顯著影響?？咕慕MT-AOC顯著高于對照組、復合益生菌組（P ＜0.05），植物多酚組與其他各組差異不顯著（P ＞0.05）；植物多酚組SOD 活性顯著高于其他各組（P ＜0.05），復合益生菌組、抗菌肽組與對照組差異不顯著（P ＞0.05）；各添加組MDA 含量顯著低于對照組（P ＜0.05），以植物多酚組含量最低。

2.3 不同添加劑對越冬后許氏平鲉非特異性免疫性能的影響

由表6 可見，植物多酚組血清LZM 活性顯著高于對照組、復合益生菌組（P ＜0.05），復合益生菌組、抗菌肽組與對照組差異不顯著（P ＞0.05），但抗菌肽組顯著高于復合益生菌組（P ＜0.05）；各組間ACP 活性差異不顯著（P ＞0.05）；各處理組IgM 與對照組差異不顯著（P ＞0.05），但抗菌肽組、植物多酚組顯著高于復合益生菌組（P ＜0.05）；植物多酚組C3顯著高于其他各組（P ＜0.05），復合益生菌組、抗菌肽組與對照組差異不顯著（P ＞0.05）。

表6 不同添加劑對越冬后許氏平鲉血清非特異性免疫的影響Table 6 Effects of different additives on serum non-specific immunity of Sebastes schlegelii after overwintering

2.4 不同添加劑對越冬后許氏平鲉血清生化指標的影響

由表7 可見血清總蛋白、白蛋白受不同飼料添加劑影響顯著（P ＜0.05），植物多酚組總蛋白、白蛋白顯著高于其他各組（P ＜0.05），復合益生菌組、抗菌肽組與對照組差異不顯著（P ＞0.05）；各組間谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶活性差異均不顯著（P ＞0.05）。

表7 不同添加劑對越冬后許氏平鲉血清生化指標的影響Table 7 Effects of different additives on serum biochemical indexes of Sebastes schlegelii after overwintering

2.5 不同添加劑對越冬許氏平鲉腸道炎癥因子和抗炎因子基因表達的影響

由圖1可見，不同飼料配方對許氏平鲉腸道炎癥因子IL-1β基因相對表達量影響不顯著(P ＞0.05)；復合益生菌組和抗菌肽組IL-15表達量有下調趨勢，但與對照組差異不顯著(P ＞0.05)，植物多酚組顯著低于其他各組（P ＜0.05）；各處理組TLR8均下調，抗菌肽組和植物多酚組顯著低于對照組（P ＜0.05）；抗菌肽組IL-12b表達量顯著高于對照組、復合益生菌組（P ＜0.05），植物多酚組與各組無顯著差異(P ＞0.05)。

圖1 不同添加劑對越冬后許氏平鲉腸道炎癥因子和抗炎因子基因相對表達量的影響Fig.1 Effects of different additives on the relative expression levels of intestinal inflammatory factor and anti-inflammatory factor genes of Sebastes schlegelii after overwintering

3 討論

3.1 生長性能

在我國北方網箱養殖過程中，冬季魚類需要同時面對低溫和饑餓雙重挑戰，魚類處于免疫低下狀態，生長停滯。本實驗探究復合益生菌、抗菌肽、植物多酚3種添加劑對越冬后許氏平鲉生長性能的影響，結果顯示，在越冬后恢復投喂階段，相比較普通飼料投喂，在基礎配方中添加抗菌肽和植物多酚顯著提高了越冬后許氏平鲉的生長性能，且二者的促生長作用均優于復合益生菌。本研究添加的抗菌肽是從微生物中提取的小分子多肽，在消化道內易被蛋白酶降解成氨基酸，是環保、高效、無毒的新型抗生素替代品[7]。湘云鯽（Carassius auratus）[8]和大口黑鱸（Micropterus salmoides）[9]飼料中添加抗菌肽均顯著提高了生長性能，與本研究結果一致。本研究所使用的植物多酚中含有鼠尾草酸、白藜蘆醇、單寧、槲皮素、地榆素等植物多酚，這幾種植物多酚在魚類上研究較少，對珍珠龍膽石斑魚（Epinephelus fuscoguttatus♀×Epinephelus lanceolatus♂）[10]研究發現，質量分數為0.1%的水解單寧能顯著提高實驗魚生長性能，茶多酚等其他多酚可以提高馬口魚（Opsariichthys bidens）[11]和團頭魴（Megalobrama amblycephala）[12]等魚的生長性能。據報道，益生菌的添加能提高中華鱉（Pelodiscus sinensis）和草魚（Ctenopharyngodon idella）的生長性能[13]，但本研究中，復合益生菌組實驗魚的生長性能并未與對照組產生顯著差異，可能是因為復合菌中的丁酸梭菌具有酸臭味道，影響魚類攝食積極性，進而影響實驗魚的生長性能。

3.2 抗氧化性能

機體正常代謝中會保持抗氧化系統的動態平衡，一旦平衡被打破，過多自由基會對機體造成氧化損傷。魚類在低溫和饑餓條件下會增加脂肪酸過氧化[14]，而脂質過氧化不僅會降低細胞膜的流動性，還會產生大量MDA，損害機體健康。在魚類越冬后恢復投喂階段若不及時清除自由基、恢復機體抗氧化功能，會影響魚類生產效率。本研究相比較對照組，復合益生菌組雖然T-AOC 和SOD 活性并未有明顯升高，但MDA 含量顯著降低，其原因一方面可能是益生菌的代謝產物如丁酸等短鏈脂肪酸抑制了氧化應激，另一方面可能是益生菌通過Nrf2-Keap1-ARE途徑上調涉及活性氧簇（ROS）解毒的基因，保護機體免受氧化應激，從而抑制了氧化產物MDA 的產生[15]。本研究抗菌肽和植物多酚均顯著提高了魚體抗氧化能力、降低了MDA含量?？咕牡目寡趸δ苤饕善涮囟ńY構域決定，其肽鍵或肽鏈的構象和氨基酸組成密切相關[16]。湘云鯽飼料中添加天蠶素抗菌肽，血清SOD 活性顯著提高，MDA 含量顯著降低[8]；采用抗菌肽浸泡（84 U/mL）及飼料添加（50 mg/kg）兩種處理方式處理虹鱒(Oncorhynchus mykiss)初孵仔魚均顯著提高SOD 活性[7]。植物多酚的抗氧化功能可歸因于其含有酚羥基結構，其鄰位酚羥基易被氧化成醌類結構，具有很強捕捉自由基能力[17]。1～20 mg/mL 白藜蘆醇強化鹵蟲12 h后投喂斑馬魚（Barchydanio rerio），顯著提高了腸道抗氧化能力[18]；松浦鏡鯉（Cyprinus carpio）飼料添加160 mg/kg 白藜蘆醇，肝臟SOD 活性顯著升高，MDA 含量顯著降低[19]；500 mg/kg 茶多酚可緩解四氯化碳誘導的團頭魴急性肝應激損傷，顯著提高肝腸組織SOD 水平，降低MDA 含量[20]。以上研究均證明了植物多酚在抗氧化方面的有效性。

3.3 非特異性免疫

血清LZM、ACP、IgM 及C3 是魚類重要的非特異性免疫指標。有研究證明，益生菌可通過調節腸道菌群、黏膜屏障功能及炎癥反應來提高機體非特異性免疫，大口黑鱸(M.salmoides)飼料中添加質量分數為1%的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）制劑，血清ACP 和LZM 活性顯著升高[21]。而本研究復合益生菌并未表現出提高機體免疫力的作用，這與復合益生菌組較低的生長性能相呼應。對斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）[22]、雜交鱘（Acipenser gueldenstaedti♀×Acipenser schrenckiBrandt♂）[23]等魚的研究證明，抗菌肽可增強魚類免疫器官活力，提高LZM活性，增強機體非特異性免疫[24]，從枯草芽孢桿菌中提取的抗菌肽（質量分數0.2%）添加在飼料中，團頭魴血清補體C3顯著提高[25]，本研究中抗菌肽的添加顯著提高了血清IgM 水平，對LZM 活性也有一定程度的提高，提示了抗菌肽對提高魚類非特異性免疫的積極作用。植物多酚對機體免疫力的作用在許氏平鲉[26]、馬口魚[11]、草魚[27]、奧尼羅非魚（Oreochromis aureus×O.niloticus）[28]、松浦鏡鯉[19]等魚類上均得到證實：茶多酚的添加顯著提高了許氏平鲉[26]、馬口魚[11]和奧尼羅非魚[28]血清或血漿LZM 活性；20、40 mg/kg的α-苯基苯并吡喃（植物多酚）提高了草魚血清LZM 活性[27]。本研究中，添加植物多酚組血清LZM、IgM、C3 得到顯著提高，提示植物多酚對越冬后許氏平鲉的抗病力具有明顯的促進作用。

3.4 血清生化指標

血清TP是血清各種蛋白質的復合物，具有維持血管內正常膠體滲透壓和酸堿度的功能，ALB 是血液中的主要蛋白成分，具有結合和運輸內源性與外源性物質、維持血液膠體滲透壓、清除自由基等功能，二者水平高低可體現機體蛋白質代謝水平的高低[29]。本研究中，復合益生菌和抗菌肽的添加對血清TP 和ALB 水平均無顯著影響，但植物多酚組TP、ALB均顯著高于其他各組。復合益生菌的添加對中華鱉血清TP 和ALB 也沒有顯著影響[13]，與本研究結果一致。將枯草芽孢桿菌中提取的抗菌肽（質量分數0.2%）添加在飼料中，團頭魴血清TP 顯著提高；在斜帶石斑魚上也證明了抗菌肽能提高血清TP 和ALB 水平[22]，本研究得到不一致的結果，可能是因為抗菌肽種類不同。對仔豬（Sus scrofadomesticus）[30]、肉雞（Gallusdomesticus）[31]的研究均證明植物多酚能有效提高血清TP、ALB 水平，提示植物多酚在促進肝臟合成代謝方面的有效作用。

AST是活性最高的轉氨酶，參與肝細胞內的氨基酸代謝，ALT是催化轉氨酶的特異性酶，正常情況下二者在血清中含量較低，在肝細胞損傷時會出現血清中含量異常升高[32]。對中華鱉[13]、鯉（C.carpio）[32]和許氏平鲉[26]的研究分別證明了飼料中益生菌、抗菌肽和植物多酚的添加不影響實驗魚血清AST、ALT 活性，本研究獲得了一致結果，提示本研究中復合益生菌、抗菌肽及植物多酚的添加未引起肝細胞損傷。

3.5 腸道炎癥因子和抗炎因子基因相對表達量

炎癥過程特點是免疫細胞從血管向炎癥部位遷移，同時大量釋放促炎介質，包括細胞因子、趨化因子和氧化劑(如ROS)等[33]。據報道，益生菌可通過調節腸道免疫相關基因的表達來調節免疫功能：復合益生菌[枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）及紅法夫酵母(Phaffia rhodozyma)]可有效抑制嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)引起的鯉魚腸道炎癥基因IL-1β的過表達，并上調抗炎因子IL-10的表達量[34]；枯草芽孢桿菌顯著抑制了2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)誘導的大口黑鱸腸道IL-1β、IL-15、IL-8等促炎因子的表達，上調抗炎因子1L-10的表達[21]。本研究中，雖然復合益生菌的添加對IL-1β、IL-15及TLR8的表達量有一定下調趨勢，但與對照組差異不顯著，且IL-12b的表達也未上調，提示本實驗中復合益生菌在炎癥調節方面無明顯優勢。

目前普遍認為抗菌肽一方面能通過膜滲透作用直接殺滅微生物，另一方面能通過免疫調節作用發揮其抗菌功能，即通過刺激免疫信號通路和相關受體蛋白的表達，調節多種免疫相關基因和細胞因子，中和巨噬細胞和單核細胞等釋放的促炎細胞因子，從而減輕炎癥反應[35-36]；本研究中，抗菌肽的添加顯著下調了TLR8的表達量，上調了IL-12b的表達量，證實了以上觀點。

研究證明，NF-κB信號通路能促進黏附分子、細胞因子和其他促炎介質的表達，而NF-κB是多種植物多酚的首選分子靶點之一，植物多酚主要通過抑制NF-κB信號通路發揮抗炎作用[33]。研究發現，綠茶多酚可抑制促炎細胞因子TLR4 信號通路而減輕腸道炎癥[37]；單寧酸等植物多酚能夠減輕葡聚糖-硫酸鈉(DSS)誘導的小鼠潰瘍性結腸炎，炎癥細胞因子水平降低[38]；槲皮素能通過調節雞胚胎自噬和程序性細胞死亡來改善脂多糖誘導的十二指腸炎癥[39]。本研究得到的結果與上述結果類似。本研究中，相比較對照組，抗菌肽和植物多酚在抗炎功能上具有明顯優勢。

4 結論

本實驗條件下，相比較對照組飼料，植物多酚和抗菌肽的添加能顯著提高越冬后許氏平鲉生長、抗氧化及非特異性免疫性能，促進肝臟合成代謝，調節炎癥因子和抗炎因子基因表達，復合益生菌則效果不明顯。