在膿毒癥相關急性腎損傷中FOXM1靶向調控NLRP3表達*

孫 甜,張振旺

(1.湖北科技學院醫學部藥學院,湖北 咸寧 437100;2.湖北科技學院糖尿病心腦血管病變湖北省重點實驗室;3.湖北科技學院醫學部醫藥研究院)

膿毒癥是一種宿主對感染反應失調,導致危及生命的器官功能障礙綜合癥,約45%～70%膿毒癥患者會發生急性腎損傷[1]。膿毒癥相關急性腎損傷(sepsis-induced acute kidney injury,SA-AKI)預示著比單獨的任何一種綜合征都有更差的預后,并且與重癥監護病房(ICU)時間、住院時間、長期殘疾率、致死率、人群生活質量相關[2]。長期以來人們對于SA-AKI在診斷和指導治療的生物標志物方面仍然缺乏描述[3],使得臨床上對SA-AKI患者缺乏切實有效的早期風險分層和治療監測方案。

既往研究表明,NLRP3炎性小體的激活可促進SA-AKI[4],且靶向NLRP3炎癥小體已被證明對急性腎損傷具有明確的治療作用,激活FOXM1通路可以促進炎癥因子分泌[5],沉默FOXM1能夠降低糖尿病小鼠腎臟炎癥因子的表達[6],然而FOXM1能否通過靶向調控NLRP3表達而影響SA-AKI的發生發展尚無相關報道。因此,本文擬從免疫組化、免疫印跡、雙熒光素酶報告基因和qRT-PCR等途徑探討在LPS誘導的SA-AKI中炎性因子的表達變化及炎癥相關因子的可能調控機制,以期篩選出新的生物損傷標志物,應用于SA-AKI的早期診斷和疾病干預。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物與細胞

10只SPF級C57BL/6雄性小鼠購自斯貝福(北京)生物技術有限公司[許可證號為SCXK(京)2019-0010]。MPC5細胞由北京北納創聯生物技術研究院細胞系傳代而來。

1.1.2 主要試劑與儀器

LPS(脂多糖)和FOXM1單克隆抗體購自Beyotime公司;NLRP3和IL-1β單克隆抗體購自Affinity Biosciences公司;IL-6多克隆抗體、一抗稀釋液、二抗稀釋液和Dual-Lumi雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自Servicebio公司;α-tubulin多克隆抗體購自Beyotime公司;組織裂解液(10×)購自Biosharp公司;RNA isolater購自Vazyme公司;ToloScript All-in-one RT EasyMix for qPCR和2×Q3 SYBR qPCR Master Mix (Universal) 購自TOLOBIO公司;NeofectTMDNA transfection reagent購自北京碼因科技有限公司。

熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司);凝膠成像分析系統(美國Bio-Rad公司);NanoDrop 2000(中國賽默飛世爾科技有限公司)。

1.2 實施方法

1.2.1 動物模型制備

將10只C57小鼠于SPF級動物房[SYXK(鄂)2018-0071]適應性喂養1周后,隨機分為正常對照組(CON,n=5)和LPS組(LPS,n=5)。LPS組小鼠按照10mg/kg體重一次性腹腔注射1mg/mL的LPS溶液;正常對照組注射等體積的生理鹽水,兩組小鼠均于給藥24h后取材。眼球取血用于ELISA檢測,4%多聚甲醛固定雙腎,左腎用于免疫組化染色,右腎用于免疫印跡檢測。

1.2.2 細胞培養及轉染

采用含10%FBS和抗生素的DMEM完全培養基,將MPC5細胞培養在含5%CO2、恒溫37℃的條件下的培養箱中。待細胞密度達到80%左右,換新鮮完全培養基,將細胞分組為空白對照組、pCMV-Vector組、pCMV-FOXM1(1μg)組、pCMV-FOXM1(2μg)組和空白對照組、SiCTL組、SiFOXM1(1μg)組、SiFOXM1(2μg)組。2h后將各組質粒DNA加入100μL無血清DMEM,充分混勻后制成DNA稀釋液,再向其中直接加入2μL NeofectTMDNA transfection reagent,輕柔混勻,室溫靜置20min后將轉染復合物加入細胞培養基中,混勻后繼續培養36h收取細胞。

1.2.3 血清生化指標

各組小鼠眼球取血,室溫自然凝固20min,2000rpm,15min(4℃條件下),收集上清液。采用全自動生化分析儀(深圳雷杜生命科技,Chemray 240)測定血清中尿酸(UA)、尿素(UREA)和肌酐(CREA)的含量。

1.2.4 免疫組化法染色

腎組織石蠟切片烤片脫蠟至水化,于3%H2O2溶液浸泡15min,阻斷內源性過氧化物酶,高壓抗原修復,室溫封閉30min后分別加入IL-1β、IL-6和NLRP3一抗(1∶200)4℃孵育過夜,次日加入相應種屬的二抗,室溫搖床孵育1h,充分洗滌后DAB顯色,蘇木素復染、脫水、透明、封片,顯微鏡下觀察IL-1β、IL-6和NLRP3的免疫組化染色結果。

1.2.5 Western blot檢測

在10mg小鼠腎臟組織中加入300μL組織裂解液,研磨珠配平后于超速破碎儀充分研磨,所得組織勻漿液置冰上裂解30min,4℃,12 000rpm離心10min后,取上清液測BCA進行蛋白定量,加入5×loading buffer充分混勻,于98℃煮沸7min行蛋白變性,10%SDS-PAGE電泳,250mA轉膜2h,5%脫脂牛奶封閉1h,4℃搖床過夜孵育一抗稀釋液FOXM1(1∶1000)、NLRP3(1∶1000)、IL-6(1∶1000)和α-tubulin(1∶1000)。次日1×TBST快搖洗膜3次,10min/次,于相應種屬的二抗稀釋液(1∶1000)室溫孵育1h,再次快搖洗膜3次,10min/次,配制ECL發光顯影液顯影。使用ImageJ軟件分析各蛋白條帶灰度值,目的蛋白表達水平(%)=目的蛋白灰度值/α-tubulin灰度值×100%。

1.2.6 生物信息學預測和雙熒光素酶實驗驗證FOXM1與NLRP3的靶向關系

利用HumanTFDB網站分析(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/)預測FOXM1與NLRP3的靶向結合情況。在此基礎上,設計合成NLRP3啟動子(1～2000bp)熒光素酶報告載體pNLRP3-pro-Luc。培養MPC5密度達到80%～90%后,將其以每孔1×105細胞傳代于12孔板培養24h,使用轉染試劑進行轉染。轉染熒光素酶檢測相關重組載體pNLRP3-pro-Luc(實驗室構建)、pRL(renilla luciferase reporter vector)和pCMV-FOXM1(實驗室構建)等質粒,繼續培養48h后移除培養基,無菌0.01mmol/L的PBS洗滌1次。將雙熒光素酶檢測試劑盒中1×PLB(passive lysis buffer)裂解液分別以每孔200μL加入12孔板,劇烈搖動20min。將裂解液收集于1.5mL離心管,于離心機12 000rpm離心30s,收取上清液待檢測。取雙熒光素酶試劑盒中LARII 10μL于1.5mL離心管。加入上述細胞裂解液10μL于離心管輕輕混勻,采用GLOMA檢測儀獲取數值A。取出1.5mL離心管再加入10μL Stop&Glo Reagent溶液,輕輕混勻,置于GLOMA檢測儀獲取數值B。計算樣本的A/B(每組重復3次)值即為熒光素酶相對表達量,代表基因的相對轉錄活性。

1.2.7 實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)

棄去培養基,用37℃無菌PBS洗滌2～3次,用RNA isolater提取各組MPC5 RNA,NanoDrop2000測定RNA總濃度,用ToloScript RT EasyMix for qPCR (with 2-Step gDNA Erase-Out)去除基因組DNA和逆轉錄為cDNA,使用2×Q3 SYBR qPCR Master Mix (Universal)進行定量檢測,條件:95℃ 5min,95℃ 10s,58℃ 30s,72℃ 30s,總共35個循環。以GAPDH為內參定量NLRP3和FOXM1表達,采用2-△△Ct計算相對表達量。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 統計學方法

2 結 果

2.1 UA、UREA和CREA在SA-AKI血清中的濃度

UA、UREA和CREA的產生增加是LPS誘導的SA-AKI小鼠模型的一個重要標志[7]。實驗結果顯示,與對照組相比,LPS組血清中UA、UREA和CREA的濃度明顯增加,見圖1。

與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,n=5。

2.2 IL-1β、IL-6和NLRP3在SA-AKI腎組織中表達情況

通過免疫組織化學染色法檢測LPS誘導的SA-AKI小鼠模型腎組織中IL-1β、IL-6和NLRP3的表達情況。實驗結果顯示,與對照組相比,LPS組可見數量較多的胞質、胞核呈大量棕黃色的陽性細胞,由此表明LPS組小鼠腎臟組織中IL-1β、IL-6和NLRP3表達增加,見圖2。

圖2 免疫組化檢測LPS誘導的SA-AKI腎組織中IL-1β、IL-6和NLRP3的表達(標尺:20μm)

A.免疫印跡檢測LPS誘導SA-AKI模型中IL-6和NLRP3表達水平變化;B.IL-6和NLRP3蛋白條帶灰度值分析(與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01,n=5)。

2.3 IL-6和NLRP3在SA-AKI模型中表達情況

通過免疫印跡檢測LPS誘導的SA-AKI模型中腎組織炎癥因子的表達情況。實驗結果顯示,與對照組相比,LPS組小鼠腎臟組織中的IL-6和NLRP3表達水平上調,與免疫組化檢測結果一致,見圖3。

2.4 FOXM1與NLRP3的靶向關系及結合位點

HumanTFDB網站分析顯示,FOXM1-NLRP3啟動子區域通過堿基互補配對的方式結合,且二者之間有“-219 to -227bp、-388 to -394bp、-396 to -402bp和 -462 to -470bp”4個結合位點,見圖4。

圖4 FOXM1和NLRP3的靶向結合位點

2.5 轉錄因子FOXM1對NLRP3基因表達的影響

雙熒光素酶實驗結果顯示,高表達FOXM1后熒光活性升高,提示FOXM1靶向結合NLRP3啟動子,說明轉錄因子FOXM1能夠轉錄調控NLRP3基因表達(P<0.05),見圖5。

與對照組比較,**P<0.01,***P<0.001,n=3。

2.6 FOXM1在SA-AKI模型中表達情況

A.免疫印跡檢測Lps誘導的Sa-Aki模型中Foxm1表達水平的變化;B.Foxm1蛋白條帶灰度值分析(與對照組比較,***P<0.001,n=5)。

通過免疫印跡檢測LPS誘導的SA-AKI模型中FOXM1的表達情況。實驗結果顯示,與對照組相比,FOXM1在LPS誘導的SA-AKI模型中高表達,見圖6。

2.7 FOXM1對NLRP3基因表達的影響

qPCR檢測結果顯示,與空白對照組相比,pCMV-FOXM1組在MPC5細胞中過表達FOXM1,NLRP3 mRNA水平隨之升高,且隨著濃度梯度的升高而升高。與空白對照組相比,SiFOXM1組在MPC5細胞中沉默FOXM1的表達,FOXM1的表達明顯降低,同時NLRP3 mRNA水平也隨之降低,且隨著濃度梯度的降低而降低,表明FOXM1能調控NLRP3基因表達,并呈現出濃度梯度依賴性,見圖7。

與空白對照組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,n=3。

3 討 論

根據急重癥質量倡議(acute disease quality initiative,ADQI)提出膿毒癥診斷后7天內發生AKI,同時存在符合共識標準的脹毒癥和AKI標準,可定義為SA-AKI,SA-AKI是危重患者的常見并發癥,可以使其死亡風險提高16倍[8]。近些年,新興的生物標志物已在腎臟相關應激和(或)損傷中顯示出巨大的開發潛力,能夠提供更多的SA-AKI病理生理情況,作為功能性檢查的重要補充。

SA-AKI的發病機制是多因素且復雜的,涉及炎癥、微循環功能障礙和代謝重編程之間的相互作用,其中炎癥失調尤其是NLRP3炎癥小體的異?；罨?是導致系統性炎性介質和細胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的過度釋放、誘發一系列外周至中樞的炎性級聯反應[9]、加重腎臟細胞壞死、引起全腎和局部的腎臟炎癥反應的常見病因。NLRP3炎性小體的激活可促進SA-AKI,且靶向NLRP3炎癥小體已被證明對急性腎損傷具有明確的治療作用。比如:通過迷迭香酸(RA)治療阻斷炎癥小體信號通路可減輕小鼠急性腎損傷[10],瑞德西韋(RDV,GS-5734)可以通過調節巨噬細胞炎癥小體激活和炎癥免疫反應來改善急性腎損傷[11]。蟾蜍靈通過抑制NLRP3炎性體減輕細胞焦亡產生的急性腎損傷,但其在SA-AKI中的作用機制尚不明確。

本文通過生物信息學軟件分析發現NLRP3是FOXM1的靶基因,且熒光素酶實驗驗證了該結果,確認FOXM1可靶向調控NLRP3表達。轉錄因子FOXM1能夠直接或間接調控炎癥反應過程中多種信號分子Wnt/β-catenin[12]、JAK/STAT[7]、NF-κB[13]和P38MAPK[14]、炎癥相關介質(IL-1β、IL-6和TNF-α[15])及細胞趨化因子(MCP-1、CCL2和CX3CL1)的表達。比如,FOXM1的表達受到TNF-α/ROS/HIF-1途徑的調節[16],抑制FOXM降低了CCL11、CCL24以及趨化因子受體CCR2和CX3CR1的表達,導致嗜酸性粒細胞和巨噬細胞的募集減少[17]。高表達FOXM1能夠增加Th1和Th2細胞因子的分泌、促進PI3K/AKT/GSK-33和p38MAPK信號通路所介導的炎癥反應[18]。此外,Wnt/β-catenin信號通路可誘導FOXM1去泛素化,穩定FOXM1的結構和表達,從而驅動β-catenin入核,促進炎癥生物學行為相關基因的轉錄。若抑制FOXM1則可以阻止細胞凋亡、炎癥、NF-κB和JAK/STAT信號通路活化的影響[19],且FOXM1與p38MAPK、NF-κB的表達量呈正相關關系,通過p38MAPK/NF-κB信號通路來啟動炎癥因子的表達、誘導炎癥反應級聯放大[20],而miR-4429靶向FOXM1可以降低SMAD3的表達水平[21],阻礙細胞的細胞增殖、遷移、侵襲和上皮-間質轉化過程,從而抑制炎癥進展[22]。為進一步確認FOXM1在LPS誘導的SA-AKI模型中的表達變化,本研究采用免疫印跡分析技術,結果顯示FOXM1在LPS誘導的SA-AKI模型中呈現高表達。為了更為直觀地揭示NLRP3與FOXM1二者之間的關系,本研究選用研究急性腎損傷常用的腎足細胞(MPC5)作為研究載體,在MPC5中瞬時轉染FOXM1干擾質粒,通過qRT-PCR檢測干擾FOXM1后對NLRP3表達的影響。實驗結果顯示,與對照組相比,在MPC5中FOXM1的表達水平顯著升高,同時,NLRP3 mRNA水平也隨之上升,且隨濃度梯度升高而上升。相反,在MPC5中FOXM1表達明顯下降,同時NLRP3 mRNA水平也隨之降低,且隨濃度梯度下降而降低。這提示NLRP3炎癥小體的激活可能通過FOXM1的特異性上調來實現,且FOXM1與NLRP3之間存在正向調控作用。因此,推測FOXM1可能通過靶向NLRP3影響其下游炎性因子的表達,進而參與膿毒癥相關腎損傷的發生發展(圖8)。

在LPS誘導的膿毒癥相關急性腎損傷模型中,FOXM1通過轉錄激活NLRP3炎癥小體促進下游炎癥因子的釋放,從而加劇膿血癥相關急性腎損傷的發展。

綜上所述,FOXM1在MPC5中對NLRP3基因表達具有靶向調控作用,且上調FOXM1表達后NLRP3表達增加,下調FOXM1表達后NLRP3表達隨之降低,且呈現出濃度梯度依賴性。因此,FOXM1、NLRP3有望成為膿毒癥相關腎損傷進展過程中生物治療新靶點。然而,目前尚未明確FOXM1調控膿毒癥相關腎損傷發展是否還涉及其他因子的參與,需要進一步研究來闡明。