外源獨腳金內酯對煙草腋芽伸長及獨腳金內酯代謝途徑相關基因表達的影響

田慧源，唐博希，王原秀，劉 帆，郭凱陽，劉國琴

(貴州大學煙草學院 / 貴州省煙草品質研究重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

煙草Nicotianatabacum是以葉片為主要收獲物的經濟作物和潛在的生物能源，也是研究植物基本生物過程的重要模式植物[1]。在生長過程中，煙草的枝條結構受頂端優勢和發育過程的控制。通過去除頂端優勢(在開花前去除花序)，腋芽迅速長成枝條，這會嚴重降低煙草經濟產量[2]。如何有效減少腋芽的產生從而提高煙葉產質量仍然是如今煙葉生產中面臨的難題。因此，有必要了解煙草腋芽的生長機制，以制定抑制腋芽伸長的有效策略。在包括煙草在內的多種植物中，腋芽的生長均始于植物葉腋處分生組織(Axillary meristerm，AM)的發育。從細胞學上看，在腋芽的生長過程中，其腋分生組織形態、細胞數量及體積在不同生育時期存在差異[3]。AM 發育形成腋芽后，可分為兩種發育情況：一種是由于頂端優勢的存在或其他因素的影響，誘導腋芽休眠，使得腋芽進入生長停滯狀態；第二種是腋芽持續生長發育形成側枝，在該生長發育過程中會受到遺傳因素、環境因素和植物激素的影響，其中植物激素對其生長發育發揮著關鍵的作用[4]。植物激素是在植物體內合成的一類微量信號分子，在低濃度下可以調控植物腋芽的生長發育[5]。吲哚乙酸(IAA)是最早被發現的植物激素，于頂芽或幼嫩組織中產生，并由植物頂端向植物基部進行極性運輸，在植物腋芽的生長發育過程中發揮著重要的作用[6]。細胞分裂素(CTK)參與調控植物腋芽生長，在擬南芥Arabidopsisthaliana中，CTK 水平與腋芽生長速率正相關[7]。此外，油菜素內酯(BR)作為一種重要的植物甾醇類激素，在調控植物腋芽生長方面同樣發揮著重要作用，能促進腋芽生長[8]。但關于BR 對煙草腋芽生長的影響尚不清楚。獨腳金內酯(Strigolactone，SL)是繼IAA、CTK、BR 之后發現的一類新型植物激素，參與植物生長發育并調控植物腋芽生長及分枝的形成[9]，在調控植物腋芽生長的過程中與BR 存在拮抗作用[10]。

GR24 是一種SL 生物合成類似物，能夠抑制植物腋芽生長[11]。TIS-108 作為SL 的生物合成抑制劑，能夠抑制水稻Oryzasativa內源SL 的生物合成水平[12]。研究發現，SL 能夠抑制植物腋芽的生長[13]，其代謝途徑相關基因在SL 抑制腋芽伸長過程中發揮著重要的調控作用[14]。AtD27基因是SL 生物合成的正調控因子，能夠正調控SL 的生物合成[15]，與植物腋芽的生長密切相關[16]。D14為SL 信號轉導途徑中的一個正調控因子，編碼一種能使SL 釋放小分子活性的蛋白，在腋芽起始發育中發揮作用，能夠抑制植物分枝的形成[17]。DAD2作為水稻和擬南芥D14的同源基因，與D14具有相同的作用機制，能夠正調控SL 的信號轉導[18]。SMAX1/SMAX1-LIKE蛋白在SL 信號轉導過程中發揮作用，SMAX1/SMAX1-LIKE 蛋白與MAX2 等因子進行相互作用，以調節植物側枝的生長[19]。然而，關于SL 代謝途徑相關基因在煙草腋芽生長過程中的調控作用研究較少。

迄今為止，大多數關于植物腋芽生長的研究都是采用模式植物進行，如菊花Chrysanthemum morifolium‘Jinba’[20]和 番 茄Solanum lycopersicum[21]，而對煙草的研究較少[22]。目前，關于SL 對煙草腋芽生長發育影響的研究主要集中在生理代謝方面[23]，少有參與SL 代謝途徑相關基因的研究。因此，本研究探究打頂后煙草腋芽的分生組織發育變化以及在SL 處理下煙株腋芽長度的變化，運用轉錄組分析SL 生物合成及信號轉導相關基因的表達譜，采用qRT-PCR 技術分析煙草打頂后SL 相關基因在腋芽不同生長發育階段的表達模式變化，探討SL 相關基因與腋芽伸長的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

供試煙草品種為K326。

主要試劑：獨腳金內酯人工合成類似物GR24(C17H14O5，分子量298.29，純度＞98%)購于上海翊圣生物科技有限公司；BR (C28H48O6，分子量490.68，純度＞98.05%)購于北京酷來博生物公司；SL 生物合成抑制劑TIS-108 (C20H21N3O2，分子量335.40，純度＞98%)購于北京索萊寶生物技術公司。

1.2 方法

1.2.1 材料培養

將煙草種子播種在12 孔育苗盤(長72 mm、寬49 mm、高62 mm)中，基質為0.85 L 水，每個育苗孔種植1 株幼苗。幼苗盤置于晝夜平均溫度約26 ℃/17 ℃的人工氣候箱中培養。煙草幼苗長至五葉一心階段時，隨機選取生長一致的煙苗移栽到外口徑235 mm、高140 mm 的塑料花盆中培養，每盆基質10 kg。煙苗移栽后，按照常規栽培措施進行灌溉、施肥及病蟲害管理。

1.2.2 試驗設計

于2020 年6 月～2022 年9 月開展試驗。

試驗1：煙苗移栽14 d 后，選擇生長條件相同的煙株進行打頂處理，將此時設為打頂0 h 并取樣，將頂端切口下方第一節位腋芽連同其葉柄完整取下，去除葉片。然后在打頂2、4、6、8、10、12 和14 h 分別進行取樣作為其他處理，總共8 個處理，每處理5 個重復，9 株為一個重復，每處理45 株。

試驗2：煙株移栽50 d 后，選擇生長一致、無病蟲害的煙草植株進行外源激素處理。處理1：打頂后不對腋芽部位施加任何外源激素；處理2：打頂后第0～6 d，于每日上午8 點在腋芽部位外源施加10 μmol·L-1GR24 溶液100 μL，每日處理一次；處理3：打頂后第0～6 d，于每日上午8 點外源施加10 μmol·L-1TIS-108 溶液100 μL；處理4：打頂后0～6 d，于每日上午8 點在植株的腋芽部位外源施加5 μmol·L-1BR 溶液100 μL。外源激素在使用前，將體積分數0.2%吐溫20 加入到10 μmol·L-1GR24、BR 溶液和TIS-108 溶液中。每處理設3 個重復，每重復30 株。

1.2.3 腋芽長度測定

在激素處理0、2、4、6 d 時，用直尺測量植株頂端打頂切口下方的第1～3 節位的腋芽長度，并取3 個節位的腋芽-80 ℃保存。

1.2.4 腋分生組織發育解剖結構觀察

采用常規石蠟切片方法研究煙草腋芽處的分生組織發育變化[3]。

1.2.5 轉錄組測序

轉錄組測序所用樣品為上述試驗2 中煙株打頂后0 d、2 d、6 d 時第1 至3 節位的混合腋芽。樣品總RNA 由Trizol 試劑進行提取，RNA 的完整性和純度用Agilent 2100 RNA 6000 Nano 試劑盒進行檢測[24]。轉錄組測序以 K326 全基因組(http://solgenomics.net/organism/Nicotiana_tabacum/genome/Edward 2017)作為參考基因組。

1.2.6 實時熒光PCR

根據基因CDS 序列用Primer5 軟件設計引物(表1)。引物合成由重慶擎科生物科技公司完成。內參基因是L25(基因庫登錄號L18908)[25]，反應體系按照Talent qPCR PreMix (SYBR Green)說明進行統一配置，檢測步驟由Bio-Rad CFX96 實時熒光定量PCR 儀完成。試驗共設置3 個技術重復，每個基因的相對表達量計算均采用2-△△CT方法[26]。

表1 用于表達分析的基因及其引物Table 1 Genes and their primers used in expression analysis

1.3 數據整理及圖表制作

運用LSD 法對數據進行統計學分析，利用TBtools、Figdraw 等進行圖表制作。

2 結果與分析

2.1 煙草腋分生組織的發育變化

煙草腋分生組織由中央母細胞區(CM)、周緣分生組織(PM)和肋狀分生組織(RM)三個細胞區域組成(圖1)。CM 位于整個腋分生組織頂端，該區域細胞高度液泡化、細胞體積較大，CM 側面及基部的細胞可通過分裂產生PM 和RM。其中，PM 位于CM 兩側，細胞體積較小，細胞排列致密。RM 處于CM 的基部及PM 內側的位置，該區域的細胞呈縱向排列(圖1)。煙草腋分生組織的細胞學分區主要反映分生組織中各部分細胞分裂的差異，PM 細胞分裂較CM 細胞快，因此從細胞體積上看，PM 細胞較CM 細胞小。

圖1 煙草打頂10 h 后腋分生組織結構Fig. 1 Anatomical structure of tobacco axillary meristem at 10 h after decapitation

如圖2 所示，打頂0 h 時，腋分生組織中CM區域的細胞向側面和基部分裂，產生PM 的內層及RM 組織(圖2 A)。打頂2 h 時，CM 區域的細胞數量增加，細胞由1 層分裂成為7 層，初步形成腋芽原基(圖2 B)。4 h 后，CM 繼續進行分裂，由于細胞分裂數量的增加，整個分生組織顏色加深(圖2 C)。6 h 時，CM 區域的細胞體積增大，PM、CM 區域細胞數量增加明顯(圖2 D)。8 h～14 h 時，PM 區域的細胞均向葉腋處兩側繼續分裂，促進葉原基發育，RM 縱向分裂促進腋芽原基徑向生長，促進腋芽的伸長(圖2 E～H)，腋芽原基發育形成芽狀。

圖2 煙草K326 打頂后腋分生組織的發育變化Fig. 2 The dynamics of axillary meristem of Nicotiana tabacum K326 after decapitation

2.2 不同植物生長調節劑對煙草腋芽伸長的影響

打頂后，腋芽長度增加，其中第1 節位的腋芽長度增長量最大，其次為第2 節位和第3 節位。處理6 d，第1～3 節位腋芽伸長量達到最大值(圖3)。說明打頂能夠促進煙草腋芽的伸長，尤其在處理6 d時增幅最大。

圖3 GR24 和TIS-108 對煙草不同節位腋芽伸長的影響Fig. 3 The effects of GR24 and TIS-108 on the elongation of tobacco axillary buds in the section different position

不同植物生長調節劑(BR、GR24、TIS-108)對煙草腋芽長度的影響不同(圖3)。在BR 處理中，第1～3 節位中的腋芽長度均保持在較高水平，在處理2 d 時顯著高于CK、GR24 和TIS-108 處理，而在BR 處理4 d 時，第1～2 節位的腋芽長度與CK、TIS-108 處理無顯著差異；TIS-108 處理與CK、BR、GR24 處理相比，第3 節位的腋芽在處理4 d 和6 d時長度顯著增加；GR24 處理后，第1～2 節位腋芽長度的增長在處理2 d 時受抑制，與CK 和BR 處理差異顯著，尤其在第2 節位中腋芽長度的降幅最大，較CK 和BR 處理分別下降52%和69.2%(圖3)?？梢?，SLs 能夠抑制煙草腋芽的伸長，且同一生長階段不同節位煙草腋芽對GR24 的響應存在差異，而BR 與GR24 的作用效應相反，能夠促進腋芽的伸長。

2.3 SL 生物合成及信號轉導基因的轉錄組分析

在SL 的生物合成過程中，異素異構酶 D27 把all-trans-β-類胡蘿卜素轉化為9-cis-β-類胡蘿卜素，而后由CCD7 (MAX3)將9-cis-β-類胡蘿卜素轉化為9-cis-β-apo-10′-類胡蘿卜醛，CCD8 (MAX4)催化該物質轉化為己內酯(Carlactone, CL)，通過P450 等酶的催化作用，最終形成SL 進入SL 信號轉導途徑[27]。此時，D14 與F-box 蛋白MAX2、SMXLs 形成SCF復合體，該復合體存在開放式的空腔來容納SL，受到刺激后，可將SL 水解為小分子活性物質CLIM(Covalently linked inter mediate molecule)，進而激活SL 的信號傳導，促進D53 降解，最終抑制植物分枝的生長[28]。

通過序列比對和注釋參考發現了12 個與獨腳金內酯相關的差異基因，其中D27、CCD7、CCD8基因與獨腳金內酯生物合成有關，D14、DAD2和SMAX1、SMAX1-LIKE4、SMAX1-LIKE6基因與獨腳金內酯信號轉導有關(表2)。在處理2～6 d 時，在CK 和 GR (GR24)比較組中，CCD7(Nitab4.5_0003110g0040)、D27(Nitab4.5_0002828g0040)、DAD2(Nitab4.5_0000164g008) 、D14(Nitab4.5_0000279g0060)、SMAX1-LIKE4(Nitab4.5_0000056g 0010)呈上調表達，而SMAX1(Nitab4.5_0000244g 0070)的表達模式相反，呈下調表達。其中，CCD7(Nitab4.5_0003110g0040)的表達量上調 0.95～1.60倍，D27(Nitab4.5_0002828g0040)上調0.36～0.60倍，DAD2的表達量增加0.47～1.84 倍。在TIS(TIS-108) 與 GR24 比較組中，D27、D14僅在處理2 d 上調表達，DAD2僅在處理6 d 受到GR24 的誘導，而SMAX1-LIKE4在處理2～6 d 上調表達。CCD8(Nitab4.5_0001894g0040)和另一個CCD7基因(Nitab4.5_0004415g0050)的表達在兩組間無顯著變化?？梢奡L 影響煙草腋芽的伸長可能是通過調控其代謝途徑相關基因的表達來實現的(圖4)。

圖4 SL 生物合成及信號轉導基因在煙草腋芽中的表達譜Fig. 4 Expression profiles of strigolactone biosynthesis and signal transduction genes in tobacco axillary buds

表2 獨腳金內酯合成和信號轉導相關基因篩選與功能注釋Table 2 Screening and functional annotation of genes related to strigolactone synthesis and signal transduction

2.4 SL 代謝途徑相關基因表達驗證

2.4.1 SL 相關基因在煙草腋芽生長過程中的表達變化

qRT-PCR 結果顯示，在CK 中，打頂后，腋芽伸長過程中D27、DAD2、D14、SMAX1-LIKE4的相對表達量在處理2～6 d 均保持在低水平，顯著低于GR24 和TIS-108 處理；相反，SMAX1基因呈高表達，在打頂2～4 d 均顯著高于GR24 處理(圖5)。GR24 處理后，與CK 和TIS-108 相比，D14、SMAX1-LIKE4基因的表達在處理2 d 受到GR24 的誘導，D27和DAD2在處理4 d 時高表達，而SMAX1在GR24 處理中低表達。在TIS-108 處理中，D14、DAD2、SMAX1-LIKE4和SMAX1的相對表達量與CK 之間無顯著差異。說明D27、DAD2、D14、SMAX1-LIKE4基因可能在響應SL 抑制煙草腋芽伸長的過程中發揮正調控的作用，而SMAX1可能正調控煙草腋芽的伸長(圖5 A～E)。

圖5 GR24 和TIS-108 處理下SL 代謝途徑相關基因的表達與qRT-PCR 驗證Fig. 5 Expression and qRT-PCR validation of SL metabolic pathway-related genes under GR24 and TIS-108 treatments

2.4.2 qRT-PCR 與轉錄組數據的相關性分析

隨機挑選5個參與SL生物合成及信號轉導途徑的基因進行qRT-PCR 驗證，引物序列詳見表1。結果發現，這些基因的表達模式高度符合RNA-Seq 結果，相關系數(R2)＞0.91 (圖5 F～I)，從而驗證了RNA-Seq 結果的可靠性。

3 結論與討論

研究表明，馬尾松Pinusmassoniana腋芽分生組織由中央母細胞區(CM)、周緣分生組織(PM)和肋狀分生組織(RM)組成[29]，本研究發現煙草腋芽的分生組織細胞區域與之相似。CM 位于腋分生組織的頂端，CM 細胞向下和兩側進行分裂產生PM 和RM，即CM 是產生所有組織的原細胞[30]。腋分生組織三個區域的細胞體積、排列形式存在差異，CM 細胞高度液泡化，細胞體積較大，而PM 細胞體積較小、排列致密，RM 細胞呈縱向分布。細胞的形態和排列方式影響其分裂特性，煙草腋芽分生組織的細胞學分區實際上是反映了腋分生組織中各部分細胞分裂的差異性，PM 細胞體積較CM 小，說明PM 細胞分裂比CM 快[3]。打頂后，腋分生組織分裂迅速，K236 的腋分生組織在打頂0～4 h 后細胞數量明顯增多，而木本植物在打頂4 h 后其腋分生組織細胞數量才開始增加，這可能是受物種特異性的影響[30]。

腋芽是植物株型的重要構成元素之一，在多種影響腋芽生長發育的因素中，除了受自身發育的影響(腋分生組織的發育)，植物激素也發揮著關鍵的作用[31]。GR24 是應用最廣泛的SL 合成類似物，具有與內源性SL 相似的生物活性[32]，可以抑制各種植物的腋芽生長[33]。GR24 對各種植物影響的研究主要集中在側芽休眠上[34—35]、腋芽的萌發和生長[36]、芽分枝[37]或分蘗的形成與發育[36]。本研究更多地關注GR24 對腋芽伸長的影響。在第一節位的腋芽中，當不同生長調節劑處理6 d 后，與CK、BR 和TIS-108處理植株相比，GR24 處理植株的腋芽伸長率顯著降低。研究表明 GR2 4 也能抑制擬南芥和豌豆Pisumsativum腋芽的生長和發育[38—39]，這與本研究結果一致，說明GR24 能夠抑制煙草腋芽的伸長。然而，腋芽在生長發育過程中，并不是受單一植物激素的影響，不同植物生長調節劑對腋芽生長的影響不同。TIS-108 對煙草腋芽生長的影響與SL 相反，與CK、BR、GR24 處理相比，在TIS-108 處理4 d和6 d 時，觀察到第3 節位的腋芽長度顯著增加，說明TIS-108 作為SL 合成抑制劑[10]，可與P450s血紅蛋白結合，如MAX1 酶(SL 生物合成酶)，從而影響SL 代謝水平，削弱SL 對腋芽的抑制效應[10]。BR 作為一種重要的參與調控植物腋芽生長的植物激素，能夠促進擬南芥和番茄腋芽的生長與側枝的形成[40—41]。在本研究中，與CK、GR24、TIS-108處理相比，BR 處理2 d 時，煙草第1～3 節位腋芽的長度顯著增加，說明BR 能促進煙草腋芽伸長，在共同調控煙草腋芽伸長的過程中，與SL 之間可能存在一定的拮抗作用[42]。在煙草腋芽生長過程中SL與BR、TIS-108 之間的互作機制還有待進一步研究。

相關研究表明，SL 調控腋芽生長過程中，其代謝途徑相關基因發揮著重要的作用[12]。D27 是SL生物合成的關鍵酶，定位于植物葉綠體中，其同系物為MAX3 和MAX1/D10[43—45]。擬南芥和豌豆的D27突變體由于SL 生物合成缺陷而表現出高分枝表型，但通過外源施加SL 后，該高分枝表型得以抑制[46—47]，D27可通過MAX/RMS/D途徑調控水稻的分蘗，并促進分蘗中SL 的生物合成[48]。在本研究中，外源SL 可誘導煙草腋芽中SL 生物合成基因D27在處理4 d 時高表達，表明D27(Nitab4.5_0002828g0040)在SL 介導的抑制煙草腋芽伸長的過程中也發揮著正調控的作用[49]，但其對煙草腋芽的具體調控機制有待進一步研究。

D14 和DAD2 是F-box 蛋白(MAX2)家族的成員[50]，在SL 信號轉導途徑中發揮作用。D14突變體植株較野生植株的高度顯著增加，同時呈現出高分蘗的表型，其表型類似于D3、HTD1/D17和D10突變體[51]。DAD2 是D14 的同系物，最早在牽?；≒harbitisnil中鑒定出來，其突變體與D14突變體相似，具有高分枝表型，證實D14/DAD2在SL途徑中起作用[52]，并抑制腋芽的生長[53]。在本研究中，煙株打頂后，SL 分別在處理2～4 d 時顯著誘導了D14(Nitab4.5_0000279g0060)與DAD2(Nitab4.5_0000164g0080)在腋芽中的表達，說明在煙草腋芽的生長過程中，D14與DAD2可能在SL 抑制煙草腋芽生長過程中發揮正調控作用，但具體的分子作用機制尚不清楚。SMAX1及其同源基因SMAX1-LIKE4(SMAXL 蛋白)在SL 信號通路的下游發揮阻礙因子的作用。在SL 信號轉導途徑上游中，D14 與D3 形成SCF 復合物，該復合物靶向識別下游的SMAXLs蛋白導致其降解，從而啟動SL 信號轉導[54]。研究表明，SMAX1還參與植物側枝的調控[55]。擬南芥SMAX1通過改變TCP1和BRC1的表達來調控植物成熟期的葉片形態和枝條分枝[55]。在本研究中，SMAX1的表達受到GR24 抑制，而其同源基因SMAX1-LIKE4在腋芽不同生長發育時期出現不同程度的上調表達，說明SMAX1(Nitab4.5_0000244g 0070)和SMAX1-LIKE4(Nitab4.5_0000056g0010)雖然為同源基因，但對SL 的響應不同，可見，SMAX1(Nitab4.5_0000244g0070)可能在SL 抑制煙草腋芽生長過程中發揮著正調控的作用，其同源基因SMAX1-LIKE4(Nitab4.5_0000056g0010)可能負調控煙草腋芽的生長，但在煙草腋芽生長過程中該類基因具體的分子調控機制還有待進一步研究[56]。

綜上所述，煙草腋芽的生長除了受自身分生組織發育的影響，還受植物激素的調控，不同的植物生長調節劑對煙草腋芽生長的影響不同，BR 促進煙草腋芽的伸長，而SL 抑制煙草腋芽的伸長，且在其參與調控腋芽生長的過程中，SL 代謝途徑相關的基因(D27、D14、DAD2、SMAX1、SMAX1-LIKE4)發揮著重要的作用。