燈盞花素對心肌缺血再灌注損傷大鼠的心肌保護作用

孫玉艷,楊 然,高麗華

1.開灤總醫院心內科，唐山 063000；2.開灤總醫院藥劑科，唐山 063000；3.滄州市人民醫院心血管內科，滄州 061001

缺血性心臟病是心內科常見的心血管疾病，其引發的急性心肌梗死及心力衰竭是心臟類疾病患者的主要死亡原因［1］。燈盞花素是從傳統苗藥燈盞細辛中提取制成的制劑，可擴張腦血管、增加腦部血流量，臨床常用于治療腦供血不足、腦血管意外、腦血栓等癥［2-3］。有研究表明［4］，其可有效降低炎性因子的表達水平，抑制氧化應激及促凋亡蛋白表達，從而對大鼠腦缺血再灌注損傷產生治療作用。本研究通過建立心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemiareperfusion injury，MIRI）大鼠模型，觀察燈盞花素對其心肌的保護作用，并探討其可能的機制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

生物機能實驗儀（上海玉研科學儀器有限公司）；CX33 顯微鏡（日本Olympus 公司）。

1.2 試藥

燈盞花素（質量分數為99%，上海曙燦實業有限公司）；肌酸激酶同工酶（MB isoenzyme of creatine kinase，CK-MB）、心肌肌鈣蛋白T（cardiac troponin T，cTnT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）試劑盒均購自上海撫生實業有限公司；兔抗大鼠白細胞介素-23（interleukin 23，IL-23）、白細胞介素-17（interleukin 17，IL-17）一抗均購自艾比瑪特醫藥科技（上海）有限公司。

1.3 動物

SD 大鼠60 只，SPF 級，雄性，8 周齡，體質量為（270±20） g，購自上海吉輝實驗動物飼養有限公司，生產許可證號為SCXK（滬）2017-0012。

2 方法

2.1 分組與預干預

將大鼠適應性飼養1 周后隨機分為健康組、模型組、燈盞花素低劑量組、燈盞花素高劑量組，各15 只；參照文獻方法［5］，燈盞花素低劑量組、燈盞花素高劑量組大鼠腹腔注射燈盞花素生理鹽水溶液（50、100 mg·kg-1）；健康組、模型組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水。每日1 次，干預5 d［5］。

2.2 MIRI 模型的建立

大鼠末次干預結束禁食禁水12 h，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠，仰臥位固定于工作臺，頸部、胸腹部備皮消毒，生物機能實驗儀連接四肢記錄心電圖，切開頸部及氣管，氣管插管并連接小動物呼吸機機械通氣，開胸暴露心臟，撕開心包膜，將一直徑為2 mm 消毒軟管與冠狀動脈左前支一并結扎，30 min 后松開結扎線、取出軟管，再灌注2 h。以結扎后心電圖ST 段顯著升高、再灌注后ST 段自高點下降1/2 以上為建模成功［6］。模型組、燈盞花素低劑量組、燈盞花素高劑量組大鼠建立MIRI 模型，健康組僅插管開胸，不進行結扎操作，各組均納入10 只進行后續實驗。

2.3 心電圖指標的檢測

用生物機能實驗儀記錄并分析再灌注過程中大鼠室顫（ventricular fibrillation，VF）、室性心動過速（ventricular tachycardia，VT）的發生次數、持續時間。

2.4 組織取材

再灌注結束后，采集大鼠腹主動脈血，低溫離心機離心10 min （3 000 r·min-1，離心半徑為8 cm），置于4 ℃冰箱中冷藏保存；采血后脊椎脫臼處死大鼠，迅速摘取心臟，切取部分心肌組織分成2份，1 份置于多聚甲醛溶液（40 g·L-1）中保存24 h，常規脫水、透明、浸蠟、包埋，切成厚度為4 μm 的切片用于組織病理觀察；1 份置于-80 ℃冰箱中冷凍保存，用于蛋白檢測。剩余部分心臟置于-80 ℃冰箱中冷凍20 min 后，取出，用于2，3，5-氯化三苯基四氮（2，3，5-triphenyltetrazolium chlorid，TTC）染色實驗。

2.5 TTC 染色檢測心肌梗死面積

取冷凍20 min 的剩余心臟，自結扎以下均勻切為厚度為2 mm 的心肌切片4 片，浸入TTC 溶液室溫染色30 min，PBS 清洗，40 g·L-1多聚甲醛固定，采集照片后用Image 軟件分析紅、白二色區域的面積，計算心肌梗死面積。心肌梗死面積=（白色面積/紅色面積）×100%。

2.6 血清心肌損傷指標的檢測

取冷藏保存的部分血清，經酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清心肌損傷指標CK-MB、cTnT活性水平，根據試劑盒說明書操作，用酶標儀測定450 nm 處的吸光度（A）值，繪出曲線，計算CK-MB、cTnT 活性。

2.7 血清氧化應激指標的檢測

取冷藏保存的部分血清，用TBA 法、WST-8 法檢測血清氧化應激指標MDA 和SOD 水平，按照試劑盒說明書要求設計實驗步驟，計算血清MDA 質量濃度、SOD 活性。

2.8 血清炎性因子的檢測

取冷藏保存的部分血清，經ELISA 檢測血清炎性因子TNF-α、IL-1β水平，根據試劑盒說明書操作，用酶標儀測定570 nm 處的A值，繪出曲線，計算TNF-α、IL-1β的質量濃度。

2.9 HE 染色觀察心肌組織的病理學變化

取心肌組織切片，用二甲苯脫蠟，用梯度酒精水化，用自來水沖洗，經蘇木精液染色5 min，用自來水沖洗，用鹽酸酒精分化，用氫氧化鈉溶液漂洗，用伊紅液染色2 min，常規脫水、透明，用中性樹脂封片，于顯微鏡下觀察心肌組織的病理改變。

2.10 檢測心肌組織IL-23、IL-17 蛋白的表達水平

取冷凍保存的心肌組織，剪碎后用研磨機研磨、勻漿，加入預冷的RIPA 裂解細胞，用低溫離心機離心12 min（8 000 r·min-1，離心半徑為10 cm），取上清液，經BCA 試劑盒提取總蛋白并定量。取40 μg，以體積比1∶4 混合上樣緩沖液，金屬浴煮沸5 min，同上述離心方法離心，取上清液，恒壓下電泳分離，轉至PVDF 膜，用BSA 封閉液封閉2 h，加入兔抗大鼠IL-23、IL-17 一抗（1∶500），4 ℃冷藏過夜，用TBST 清洗，加入二抗（1∶2 000），常溫孵育2 h，用TBST 清洗，ECL 液發光，暗盒顯色，經凝膠分析儀掃描分析蛋白條帶灰度值，以IL-23、IL-17 蛋白灰度值與內參GAPDH 灰度值之比表示IL-23、IL-17蛋白的相對表達量。

2.11 統計學方法

用SPSS 21.0 統計學軟件分析數據，用（±s）表示計量資料，以多因素方差分析檢驗多樣本計量資料，以LSD-t檢驗分析兩兩樣本。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠心電圖指標的比較

與模型組比較，燈盞花素低劑量和燈盞花素高劑量組大鼠VF、VT 發生次數減少，VF、VT 持續時間縮短，燈盞花素高劑量組的變化更顯著（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠心電圖指標的比較 （n=10，±s）Tab.1 Comparison of electrocardiogram indexes of rats in each group (n=10,±s)

表1 各組大鼠心電圖指標的比較 （n=10，±s）Tab.1 Comparison of electrocardiogram indexes of rats in each group (n=10,±s)

注：與模型組比較，aP＜0.05；與燈盞花素低劑量組比較，bP＜0.05。

組別模型組燈盞花素低劑量組燈盞花素高劑量組VF 發生次數/次9.50±0.90 5.10±0.60a 2.70±0.30b VF 持續時間/min 23.43±2.52 17.44±2.15a 11.05±0.96b VT 發生次數/次9.40±0.9 5.80±0.60a 4.10±0.50b VT 持續時間/min 24.43±2.43 20.66±2.72a 14.81±1.85b

3.2 大鼠心肌梗死面積的比較

與模型組比較，燈盞花素低劑量組、燈盞花素高劑量組大鼠心肌梗死面積占比降低，燈盞花素高劑量組的變化更顯著（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠心肌梗死面積占比的比較 （n=10，±s）Tab.2 Comparison of the proportion of myocardial infarction area in each group of rats (n=10,±s)

表2 各組大鼠心肌梗死面積占比的比較 （n=10，±s）Tab.2 Comparison of the proportion of myocardial infarction area in each group of rats (n=10,±s)

注：與模型組比較，aP＜0.05；與燈盞花素低劑量組比較，bP＜0.05。

組別模型組燈盞花素低劑量組燈盞花素高劑量組心肌梗死面積占比50.32%±5.41%41.70%±4.44%a 25.42%±2.51%b

3.3 大鼠血清心肌損傷指標的比較

與健康組比較，模型組血清CK-MB、cTnT 活性升高（P＜0.05）；與模型組比較，燈盞花素低劑量組、燈盞花素高劑量組血清CK-MB、cTnT 活性降低，燈盞花素高劑量組的變化更顯著（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清心肌損傷指標CK-MB、cTnT 活性的比較 （n=10，±s）Tab.3 Comparison of serum myocardial injury indexes CKMB and cTnT activity levels in each group (n=10,±s)

表3 各組大鼠血清心肌損傷指標CK-MB、cTnT 活性的比較 （n=10，±s）Tab.3 Comparison of serum myocardial injury indexes CKMB and cTnT activity levels in each group (n=10,±s)

注：與健康組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與燈盞花素低劑量組比較，cP＜0.05。

組別健康組模型組燈盞花素低劑量組燈盞花素高劑量組CK-MB/（ng·mL-1）0.99±0.11 6.56±0.65a 4.46±0.64b 2.14±0.23c cTnT/（ng·L-1）44.83±4.07 149.91±17.84a 121.23±12.20b 85.34±10.13c

3.4 大鼠血清氧化應激指標水平的比較

與健康組比較，模型組血清MDA 水平升高、SOD 活性降低（P＜0.05）；與模型組比較，燈盞花素低劑量組、燈盞花素高劑量組血清MDA 水平降低，SOD 活性升高，燈盞花素高劑量組的變化更顯著（P＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠血清氧化應激指標MDA、SOD 活性的比較 （n=10，±s）Tab.4 Comparison of serum oxidative stress indexes MDA and SOD activity in each group (n=10,±s)

表4 各組大鼠血清氧化應激指標MDA、SOD 活性的比較 （n=10，±s）Tab.4 Comparison of serum oxidative stress indexes MDA and SOD activity in each group (n=10,±s)

注：與健康組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與燈盞花素低劑量組比較，cP＜0.05。

組別健康組模型組燈盞花素低劑量組燈盞花素高劑量組MDA/（nmol·mL-1）0.40±0.05 2.30±0.32a 1.43±0.13b 0.68±0.08c SOD/（U·mL-1）93.19±9.88 55.88±6.58a 58.48±8.18b 73.30±7.62c

3.5 大鼠血清炎性因子水平的比較

與健康組比較，模型組血清TNF-α、IL-1β水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，燈盞花素低劑量組、燈盞花素高劑量組血清TNF-α、IL-1β水平降低，燈盞花素高劑量組的變化更顯著（P＜0.05）。見表5。

表5 各組大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-1β 水平的比較 （n=10，±s）Tab.5 Comparison of the levels of serum inflammatory factors TNF-α and IL-1β in each group of rats (n=10,±s)

表5 各組大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-1β 水平的比較 （n=10，±s）Tab.5 Comparison of the levels of serum inflammatory factors TNF-α and IL-1β in each group of rats (n=10,±s)

注：與健康組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與燈盞花素低劑量組比較，cP＜0.05。

組別健康組模型組燈盞花素低劑量組燈盞花素高劑量組TNF-α/（ng·L-1）55.64±4.68 99.71±6.92a 84.54±9.90b 69.27±7.98c IL-1β/（ng·L-1）14.28±1.58 62.61±7.61a 41.81±4.98b 29.80±2.94c

3.6 大鼠心肌組織的病理變化

HE 染色結果顯示，健康組心肌細胞形態結構完整，邊界清晰可見；模型組心肌細胞腫脹變形，細胞核溶解深染，心肌結構斷裂，界限不清，可見大量炎性細胞浸潤；燈盞花素低劑量組、燈盞花素高劑量組心肌細胞水腫減輕，細胞核溶解減少，細胞排列較松散但邊界可見，燈盞花素高劑量組的變化更顯著。見圖1。

圖1 HE 染色觀察心肌組織病理變化（×400）Fig.1 The pathological changes of myocardial tissue observed by HE staining (×400)

3.7 大鼠心肌組織IL-23、IL-17 蛋白表達水平的比較

與健康組比較，模型組心肌組織IL-23、IL-17 蛋白的表達水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，燈盞花素低劑量組、燈盞花素高劑量組心肌組織IL-23、IL-17 蛋白的表達水平降低，燈盞花素高劑量組降低更顯著（P＜0.05）。見表6、圖2。

圖2 Western blotting 檢測心肌組織IL-23、IL-17 蛋白的表達水平Fig.2 Western blotting method to detect the protein expression of IL-23 and IL-17 in myocardial tissue

表6 各組大鼠心肌組織IL-23、IL-17 蛋白表達水平的比較（n=10，±s）Tab.6 Comparison of IL-23 and IL-17 protein expression in myocardial tissue of rats in each group (n=10,±s)

表6 各組大鼠心肌組織IL-23、IL-17 蛋白表達水平的比較（n=10，±s）Tab.6 Comparison of IL-23 and IL-17 protein expression in myocardial tissue of rats in each group (n=10,±s)

注：與健康組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與燈盞花素低劑量組比較，cP＜0.05。

組別健康組模型組燈盞花素低劑量組燈盞花素高劑量組IL-23 0.12±0.01 0.88±0.10a 0.41±0.05b 0.22±0.02c IL-17 0.14±0.01 0.72±0.10a 0.31±0.03b 0.24±0.03c

4 討論

MIRI 指心肌缺血一段時間后恢復血供，缺血心肌組織反而產生更嚴重損傷的病理過程，心肌超微結構在缺血期損傷后進一步變化，表現為心肌肌原纖維膜攣縮破裂，線粒體嵴斷裂、溶解［7］。再灌注治療后冠狀動脈疏通，梗死區血氧供給恢復，缺血期引發的損傷性變化更為突出，可造成肌張力及血壓驟降、電解質紊亂、電生理異常，導致心肌頓抑、心律失常［8-9］。

MIRI 發病機制復雜，多認為是氧化應激損傷、細胞內鈣離子超載、炎癥反應爆發及細胞凋亡、自噬等多種因素相互作用的結果，其中過度的炎癥反應被認為是其發病的重要機制之一［10］。MIRI 發生后大量中性粒細胞活化，產生呼吸爆發，過量氧自由基損傷血管內皮細胞，吸附免疫細胞并刺激其釋放炎性介質，促進中性粒細胞浸潤，進一步強化炎癥反應，加劇心肌組織損傷［11］。因此，尋找高效安全、抑制心肌組織免疫及炎癥反應的新治療藥物或方式對改善MIRI 患者的預后意義重大。

CK-MB 主要存在于心肌組織，當心肌缺血發生后，其血清含量顯著升高，其是機體重要的心肌損傷指標，cTnT 是心肌細胞內特異性蛋白，當心肌細胞損傷后，其可迅速進入血液循環，高特異性地反映心肌損傷程度［12-13］。燈盞花素是中藥燈盞細辛的主要活性物質，作為一種天然植物黃酮，可抑制血管內皮細胞過氧化損傷，減緩血小板凝聚，改善血液微循環［14］。有研究表明［15-16］，燈盞花素可抑制心肌細胞氧化應激反應及細胞凋亡，減輕LPS 誘導的心肌細胞損傷，表明其可作為心肌損傷潛在治療藥物。本研究結果顯示，與模型組比較，燈盞花素低劑量組、燈盞花素高劑量組大鼠VF、VT 發生次數減少，心肌梗死面積占比減少，血清CK-MB、cTnT 活性降低，MDA、TNF-α、IL-1β水平降低，VF、VT 持續時間縮短，血清SOD 活性升高，表明燈盞花素可緩解心律失常、減輕心肌損傷及氧化應激反應、炎癥反應。

IL-23/IL-17 軸是新發現的一條免疫炎癥軸，在多種炎性及自身免疫性疾病發生和發展過程中扮演重要角色，IL-23、IL-17 是該軸的重要調控因子［17-18］。其由IL-23 p19、IL-12 p50 2 個亞單位結合而成，以異二聚體形態發揮生物學作用，其與受體相互作用，激活下游JAK/STAT 通路，同時可誘導初始CD4+T細胞分化為Th17 細胞，IL-23 與STAT3 共同作用促使其分泌促炎因子IL-17，IL-17 又促進前炎癥因子TNF-α、IL-1β及多種趨化因子的分泌，進一步加重機體炎癥反應，損害心肌組織［19］。GEHA M 等［20］研究認為，抑制IL-23/IL-17 軸活性可減輕小鼠炎癥反應及中性粒細胞浸潤，治療夾閉腸系膜上動脈誘發的小腸缺血再灌注損傷，表明IL-23/IL-17 軸在缺血再灌注損傷中的重要作用。本研究結果顯示，與健康組比較，模型組心肌組織IL-23、IL-17 蛋白表達水平升高，經燈盞花素干預后兩者的水平均降低，且表現為劑量依賴，表明IL-23/IL-17 軸在MIRI中處于異常激活狀態，而燈盞花素可能通過抑制該軸活性保護MIRI 大鼠的心肌。

綜上所述，燈盞花素可緩解MIRI 大鼠心律失常、減輕心肌損傷及氧化應激反應、炎癥反應，推測其作用機制可能與抑制IL-23/IL-17 軸的活性有關。