電化學生物傳感器及其在現代軍事醫學中的應用

金定都,方寒寒綜述,葉宗煌,高 濤審校

0 引 言

電化學生物傳感器使用固定化的生物體(細胞器、細胞、組織等)或者生物大分子物質(酶、抗原、抗體、DNA等)作為敏感元件,利用電化學原理檢測和分析所得信號[1]。電化學生物傳感器具有諸多優點,例如響應快、靈敏度高、專一性強、檢測范圍廣等,可檢測物質包括中間代謝產物(乳酸[2]、葡萄糖[3]、氨基酸[4]等)、異生物(農藥[5]、毒素[6]、化學戰劑、生物戰劑[7]等)、病原體(寄生蟲[8]、細菌[9]、病毒[10]等),在軍事醫學領域具有明顯的研究前景。

1 電化學生物傳感器檢測原理

電化學生物傳感器以電極作為固定載體和信號轉換器,將生物體或生物大分子等敏感元件固定在電極上。通過電化學分析方法[11],傳感器利用檢測底物與電極上生物敏感元件之間的特異性識別作用,將反應過程中物質之間相互作用產生的生物學信號通過電極轉化成可定量檢測的電信號,底物濃度與電信號的檢測值在一定范圍內成正相關關系,因此能夠實現對底物濃度的定性定量檢測。

在電化學傳感器中,所用的電極系統通常為兩電極或者三電極傳感平臺,具體由參比電極和工作電極構成。其中,參比電極用于提供穩定和可重復的電壓,通常放置在工作電極的相對固定位置。通過比較參比電極和工作電極的電壓,幫助測量物質濃度。工作電極通常為傳感器中的信號轉換器,有關反應的電子轉移常常會在其表面發生,可形成可靠的電流回路。

2 電化學生物傳感器的分類

電化學傳感器主要分為電位型傳感器和電流型傳感器[12],其主要區別在于工作方式的不同。電位型生物傳感器是指待測物質和生物敏感元件反應產生的生物信號經信號轉換器后能夠輸出為電壓信號的生物傳感器,而電流型生物傳感器則是待測物質和生物敏感元件反應產生的生物信號經信號轉換器后能夠輸出為電流信號[13]。

電化學生物傳感器可以根據其具體所采用的信號轉換器(電極、場效應晶體管、光纖及熒光劑、熱敏電阻等)、生物敏感元件(酶、微生物、抗原或抗體、脫氧核糖核酸、動植物組織、細胞器等)進行分類。本文將主要根據生物敏感元件的不同,具體介紹酶電極傳感器、微生物電極傳感器、電化學免疫傳感器、電化學DNA傳感器、組織電極傳感器、細胞器電極傳感器這6種電化學生物傳感器[14]。

2.1酶電極傳感器酶電極傳感器的敏感元件為生物酶[2],信號轉換元件為電極。其主要檢測原理是酶的催化作用將難以用于電化學檢測的底物催化反應為易于檢測的產物。鑒于酶的高度專一性和高效催化作用,被測底物的濃度能夠與反應產生的電信號在一定條件下呈現出線性關系,酶電極傳感器將酶作為敏感元件可以高效檢測物質濃度。此外,酶電極傳感器還可以檢測輔助因子、酶活性調節因子和抑制劑等小分子,其主要原理是基質存在時,這些小物質會影響傳感器的輸出信號。

2.2微生物電極傳感器微生物電極傳感器[15]的敏感材料為微生物(常為細菌和酵母菌),通過生物、化學或物理方式,直接把活的微生物作為分子識別元件固定在電極表面。其工作原理大致可分為以下3種類型:①利用微生物對有機物的同化作用,通過檢測其隨呼吸活性(耗氧量)的提高氧濃度的減少量間接測定有機物的濃度;②微生物在生存過程中反應產生的代謝產物也可作為檢測物質,通過測定對電極敏感的一些代謝產物可以間接測定部分能被厭氧微生物同化的有機物;③利用微生物體內含有的酶來識別分子,根據其酶促反應的快慢檢測底物濃度。

2.3電化學免疫傳感器電化學免疫傳感器是敏感元件為抗原或抗體等免疫物質的電化學生物傳感器[16]。它不僅采用了電化學傳感技術,還結合了免疫分析方法,將二者的優勢相結合,既保留了電化學分析方法的高靈敏度,又兼具免疫分析方法的高選擇性、專一性和可靠性?？贵w對底物的強特異性使免疫分析一般不需要處理樣品,同時可以還省略預分離的過程。電化學免疫傳感器在生化檢測領域是十分重要的發明之一。此外,電化學免疫傳感器還可以根據測定標記物的需求與否可分為直接電化學免疫傳感器與間接電化學免疫傳感器。

2.4電化學DNA傳感器電化學DNA傳感器將基因探針或單鏈DNA(single stranded DNA,ssDNA)作為敏感元件固定在電極表面[16],同時結合可以識別雜交分子的電活性指示劑(雜交指示劑),最終檢測特定基因。電化學DNA傳感器具有不同于其他電化學傳感器的工作模式,它首先利用特異識別作用(分子雜交),使固定在電極表面的某一特定序列的ssDNA與溶液中的互補序列相結合,產生雙鏈DNA(double stranded DNA,dsDNA),從而改變電極表面性質,再通過雜交指示劑特異性識別ssDNA和dsDNA產生有關電流信號的改變檢測基因。

2.5組織電極傳感器組織電極傳感器利用的敏感元件通常為動植物的組織薄片,利用動植物組織中的生物酶傳導電子信號,相較于酶電極傳感器中的離析酶而言,優點是傳感器元件制備簡單,材料容易獲取,組織中酶活性及其穩定性,傳感器使用壽命長等,但在反應的響應時間、選擇性、靈敏度等方面還有待改進[17]。

組織電極傳感器常用的植物組織有:根、莖、葉、花、果等,動物組織有:腎、腸、肝、胸腺、肌肉等組織。植物組織電極比動物組織成本更低、制備更為方便,并且易于保存。

2.6細胞器電極傳感器細胞器電極傳感器的敏感元件為生物體內各種細胞器,包括但不限于溶酶體、葉綠體、線粒體、微粒體、過氧化氫體、磁粒體、氫化酶顆粒等[18]。其主要工作原理是借助細胞器內的酶,通過酶促反應的快慢來間接檢測底物濃度的變化。

3 電化學生物傳感器在軍事醫學中的應用

在軍事醫學領域中,方便且高效的傳感器向來是研究熱點。與其他醫用傳感器相比,用于軍事醫學的傳感器使用場景特殊——環境復雜、條件惡劣、運動頻繁等,因此與臨床使用的傳感器相比,高可靠性、高抗干擾性、低使用條件性、非接觸性一直是軍事醫學傳感器研究者所追求的目標。而電化學生物傳感器以其專一性強、靈敏度高、響應快等優點在軍事醫學領域有著較為廣泛的應用前景。

在軍事醫學領域中,電化學生物傳感器主要用于檢測生物戰劑、化學戰劑和監測生理特征等野外作戰環境當中。相較于臨床使用的傳感器,其要求檢測更加迅速敏捷、特異性更強,同時針對惡劣復雜的作戰環境,要求傳感器體積小、易于攜帶。

3.1檢測生物戰劑微量的生物戰劑就能夠在很短時間內造成大量的人員傷亡。在生物戰劑中,使用最多的便是具有傳染性的病原體以及生物毒素。因此,在生物恐怖襲擊中早期準確識別生物戰劑并采取有效的防御治療策略十分必要。電化學生物傳感器具有靈活、簡單、便攜、快速、特異性強、敏感性高等優點,被廣泛用于檢測及實時診斷分析工具的研發,可以檢測多種病原體(金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、沙門菌、致病性氣單胞菌、糞腸球菌、布魯氏菌等[19]),將在生物戰劑檢測中發揮重要作用,是實現戰現場實時檢測和滿足軍隊應急需要的理想裝備[20]。

從最初的酶電極傳感器發展至今日的光尋址電位傳感器(light addressable potentiometric sensor, LAPS),電化學生物傳感器一直沿著輕量化、一體化、簡便化、快速化的道路發展。此外,對病毒、細菌這類病原體具有高度特異性和核酸探針功能的抗體光纖生物傳感器與核酸探針生物傳感器也備受關注。

目前,美國軍隊(簡稱“美軍”)已經研制出一款環境傳感器,其可佩戴在士兵作戰服上提醒士兵環境狀況,避免士兵遭受中暑、腸道傳染等疾病。此外,美軍所研發的創傷生命支持/運輸系統,同樣可以監測生物戰劑及環境狀況,并且能夠及時調節系統內部空氣,隔離外部環境,以保證傷員的生命安全。美軍研制的各類各范圍生物戰劑探測儀,大部分均采用多路生物傳感器,并配有化生戰劑圖示及輔助決策系統。據報道,美軍在2000年時已研制出可檢測葡萄球菌腸毒素B、蓖麻素、肉毒桿菌和土拉弗氏菌等4種生物戰劑的免疫傳感器,檢測時間為3～l0 min,靈敏度分別為10 mg/L、50 mg/L、5×104CFU/mL和5×105CFU/mL。Song等制成了用于霍亂病毒檢測的生物傳感器。其可在30 min內檢測出低于1×10-5mol/L的霍亂弧菌,并有較高的敏感性和較好的選擇性,操作簡便。此方法可應用于具有多個信號識別位點的蛋白質毒素和病原體的檢測。電化學DNA傳感器通過與靶DNA分子雜交而定量檢測靶DNA,具有相當高的選擇性和靈敏度。電化學DNA傳感器可以檢測多樣的微生物,包括分枝桿菌、梭狀芽孢桿菌、奈瑟菌等[21]。

綜上所述,電化學生物傳感器技術是目前最常用的快速鑒定和檢測生物戰劑的方法[22]。

3.2檢測化學戰劑目前,在檢測化學戰劑領域研究和應用最多的是基于乙酰膽堿酯酶的電極生物傳感器。20世紀50年代,就有酶檢測方法用于檢測沙林毒氣,可檢出0.1～0.5 ppm的沙林。目前,這一方法仍被廣泛使用中,在多個軍方設備例如報警器中都有其身影所在。美軍制作的基于酶電極的生物傳感器自偵報警器能夠對所有化學戰劑都能進行準確、快速檢測;荷蘭的警告報警系統、英國的那伊阿得報警探測器和我國的酶報警器的敏感元件都是神經性毒劑抑制膽堿酯酶[23]。Saito等[24]開發了自主空氣采樣和檢測系統,可用于評估可能對人有害的化學和生物戰劑。

目前,已有相關研究報道表明電化學生物傳感器可以用于檢測的化學戰劑如下:沙林毒氣、氯氣、氨氣、氫氟酸等。

3.3監測生理特征電化學生物傳感器在軍事醫學中也可以用于快速診斷與早期診斷。電化學生物傳感器可以被用來監測戰場傷員的生命體征,如血氧飽和度、血糖水平等。這些數據可以幫助醫務人員及時處理傷員的狀況。一些有重要臨床診斷意義的基質(如血糖﹑乳酸、谷氨酰胺等)都可用電化學生物傳感器來檢測。血藥濃度的檢測能指導臨床治療從經驗性轉向科學性。此項工作的開展可以減小藥物的毒副作用,防止毒效發生。

目前在血液檢測中廣泛應用的是葡萄糖酶傳感器。多個國家已經研發出了相關的葡萄糖酶傳感器用來臨床檢測生理指標,在幾分鐘內,通過極少量的血液,便能得到可靠的結果。

乳酸監測對于診斷和評估與乳酸酸中毒相關的健康問題以及在缺氧情況下的健康問題至關重要。因此,患者的血乳酸水平可作為疾病嚴重程度的警報信號,也可用于改善廣泛疾病的診斷和治療。酶電極生物傳感器常被應用于乳酸濃度在線檢測[25]。

士兵的身心健康與疲勞程度息息相關,若是過度疲勞,則會對軍事訓練造成劇烈影響。隨著軍事訓練的頻率不斷增加,及時、便攜和準確地診斷疲勞對于避免疲勞誘發的事故至關重要。然而,傳統的檢測方法需要復雜的樣本制備和血液采樣過程,無法滿足疲勞診斷的及時性和便攜性。隨著柔性材料和生物傳感技術的快速發展,目前可穿戴式生物傳感器越來越受到研究人員的重視?？纱┐魃飩鞲衅骺蓮姆乔秩胄陨镆后w(如汗液、唾液和淚液)中收集生物標志物,在生物傳感模塊的幫助下連續定量地進行生物傳感,然后可以通過無線通信模塊傳輸檢測信號,實時了解異常狀態?？纱┐魃飩鞲衅鞯淖钚掳l展目前集中在用于代謝物檢測的小型化可穿戴電化學和光學生物傳感器上[26]。

4 展 望

目前,電化學生物傳感器的電極尺寸已然進入納米水平,正逐步向微系統化與超微型化發展。此外,以LAPS為標志的多參數測量型電化學生物傳感器成為另一大發展趨勢。綜合來看,應用于軍事醫學領域的電化學生物傳感器主要朝著以下三個方面發展:①利用新型材料優化性能,提高戶外使用的特異性與靈敏度,能夠更加高速準確地檢測生化戰劑、病原體、生理標志物等;②通過局域網絡,將電化學生物傳感器與醫療監測系統相連接,實現遠程實時監測與數據傳輸,提高救助成功率;③通過智能化系統,自動采集與管理數據,并利用人工智能進行數據處理,提出實時個性化治療方案,根據戰場傷者的生化指標,精準調節藥物輸送量,提高治療效果。

電化學生物傳感器以其高敏感性和特異性、設備便攜易于小型化、操作簡單及實時檢測等優點,正成為軍事醫學傳感器研制開發領域的熱門研究對象。隨著人們逐步深入了解感染性病原體,及新型分析技術與材料技術等技術的發展,以電化學生物傳感為基本原理的生物化學戰劑檢測設備、人體生理指標檢測設備將使軍隊應急裝備更加豐富,滿足現代戰爭的需求。