淡水魚中16種喹諾酮類抗生素UPLC-MS/MS檢測方法的建立及膳食風險評價

高云慨 陳春泉 陳小妹 周凌聿 鄧英林 尹青春

(海南省食品檢驗檢測中心國家市場監管重點實驗室〔熱帶果蔬質量與安全〕,海南 ?？?570100)

近年來中國水產品的消費量保持穩定增長,其中水產養殖是水產品供應的主要途徑[1]。隨著規?；图s化養殖方式快速發展,應激源和免疫力下降導致病害問題日趨嚴重[2]。

喹諾酮類抗生素(quinolones,QNs)作為一類新型合成抗菌藥,被廣泛應用于水產養殖業細菌性疾病的預防和治療[3-4]。不同于其他抗菌藥,QNs通過抑制DNA的復制來發揮抑菌作用,具有高效、廣譜等優點[5-6]。以往監測數據[7-9]表明,多個地區均有養殖過程中QNs濫用的情況。QNs的大劑量、長時間使用,不僅會導致食物鏈富集超標而損害人體中樞神經系統和肝腎器官[10-11],也會產生細菌耐藥性問題[12]。為保障消費者健康,中國政府、世界衛生組織、歐盟、美國、日本等均制定了相關的QNs殘留限量標準,其檢測項目也存在差異[13-15]。

目前用于QNs檢測的主要方法有高效液相色譜法[16]、熒光分析法[17]、液相色譜串聯質譜法[18-20]。高效液相色譜法特異性強、定量準確,但靈敏度低、檢出限難以滿足限量要求;熒光分析法靈敏度較高、操作簡單、響應時間短,但穩定性和抗干擾性較差,對復雜食品基質有局限性;液相色譜串聯質譜法具有靈敏度高、檢出限低、分析速度快,分離和鑒定同時進行等優點,被廣泛用于痕量分析,但基質效應會影響檢測結果的準確性。高溫烹飪是人們制作熟制品最主要的方式,相關研究主要集中在食品營養成分和風味物質含量變化上[21-22]。其中,涉及水產品中QNs殘留量變化方面的研究和報道較少。研究擬采用三重四極桿—質譜結合同位素內標法建立一種前處理簡便快速、分析時間短、靈敏度高,可同時測定淡水魚及制品基質中16種QNs的檢測方法。在此基礎上,進一步分析3種高溫烹飪方式對魚肉中QNs殘留量的影響,旨在為水產品及制品中喹諾酮類抗生素的監測和膳食風險評價提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

16種喹諾酮混標、恩諾沙星-D5內標:美國 A ChemTek 公司;

環丙沙星-D8內標:德國 Dr. Ehrenstorfer 公司;

諾氟沙星-D5內標:北京曼哈格生物科技有限公司;

甲酸、乙腈、甲醇、乙酸銨:色譜純,德國 Merck 公司;

淡水魚樣品:市售。

1.1.2 儀器與設備

質譜儀:AB 4500型,美國SCTEX公司;

超聲波清洗機:SK 7200型,上?？茖С晝x器有限公司;

氮吹儀:XcelVap-XCV 5400型,美國Horizon公司;

低溫冷凍離心機:5804R型,德國Eppendorf公司;

凈化柱:Bond Elut C18型,500 mg,633 mL,美國Agilent公司;

Waters Oasis?PRime HLB固相萃取柱:200 mg,6 mL,美國Waters公司;

AgelaTechnologies Cleanert?MAS-Q固相萃取柱:美國AgelaTechnologies公司;

色譜柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18,1.7 μm,2.1 mm×100 mm,美國Waters公司;

CORTECS T3:2.7 μm,2.1 mm×100 mm,美國Waters公司;

EclipsePlus RRHD C18:1.8 μm,2.1 mm×100 mm,美國Agilent公司;

Kinetex C8100A:1.7 μm,2.1 mm×100 mm,美國Phenomenex公司。

1.2 方法

1.2.1 儀器條件

(1) 質譜條件:離子源為ESI源,正離子模式;反應監測(MRM)模式;電噴霧電壓5 500 V;離子源溫度550 ℃;霧化氣0.34 MPa;加熱氣0.34 MPa;氣簾氣0.17 MPa;碰撞室入口電壓10 V。

(2) 色譜條件:ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(1.7 μm,2.1 mm×100 mm);柱溫35 ℃;進樣量5.0 μL;流速0.3 mL/min;流動相A為0.1%甲酸水溶液;流動相B為乙腈;梯度洗脫程序:0～2 min,5% B;2～3 min,5%～95% B;3～7 min,95% B;7～10 min,5% B。

1.2.2 樣品前處理 稱取5.0 g魚肉均質樣品至50 mL干凈離心管中,分別加入質量濃度為10.0 μg/mL含3種混合內標標準溶液40 μL及10 mL乙腈(含4%甲酸),充分渦旋后超聲10 min,10 000 r/min離心5 min;移取上清液5 mL至C18固相萃取柱進行凈化,收集濾液過0.22 μm有機膜,上質譜測定。

1.2.3 標準溶液的配制

(1) 16種混合標準使用溶液(1.0 μg/mL):準確吸取100 μg/mL 16種喹諾酮混標100 μL,用2%甲酸乙腈定容至10 mL,于-18 ℃貯藏備用。

(2) 3種混合內標標準使用溶液(10.0 μg/mL):分別吸取1.0 mL質量濃度為100 μg/mL恩諾沙星-D5、環丙沙星-D8、諾氟沙星-D5,用2%甲酸乙腈定容,于-18 ℃貯藏備用。

1.2.4 基質標準曲線配制 選取空白基質陰性樣品,按1.2.2的方法進行處理得到空白基質溶液,配制成質量濃度為2.0～50 ng/mL的基質標準工作曲線。

1.2.5 線性關系 采用建立的方法測定16種QNs空白基質標準工作溶液,以峰面積為縱坐標、濃度為橫坐標,進行線性回歸計算,分別得到線性方程及相關系數。

1.2.6 檢出限及定量限 通過測定16種QNs空白基質標準工作溶液,以3倍信噪比(S/N=3)時對應的目標物濃度計算得到方法檢出限,以10倍信噪比(S/N=3)計算得到方法定量限。

1.2.7 回收率和精密度測定 選取陰性魚肉樣品,分別添加2,5,10 μg/kg 3個水平的16種QNs混標溶液,按照建立的方法進行測定,每個水平6次重復,分別計算回收率和精密度。

1.2.8 不同烹飪方式魚肉中QNs殘留量的測定 選取同一類型淡水魚陰性樣品攪拌均勻,分成2等份,一份作為陰性對照,另一份按一定比例向其中人工添加一定濃度16種QNs混標溶液,并采用均質器充分均質混勻,得到含量為200 ng/g陽性樣品;陰性、陽性樣品置于4 ℃冰箱12 h;將陰性樣品和陽性樣品分別分成4等份,并進行處理(每一組均有等量陰性樣品作為空白對照):① 5.0 g魚肉陽性樣品無處理;② 5.0 g魚肉陽性樣品油炸3 min;③ 5.0 g魚肉陽性樣品水煮10 min;④ 5.0 g魚肉陽性樣品清蒸10 min。每組處理均按照建立的方法進行測定,每組4個平行樣,重復2次。

1.2.9 數據處理 采用SPSS 22.0軟件對數據進行處理,使用Origin 8.0軟件繪圖。

2 結果與討論

2.1 質譜條件優化

通過全掃描模式對16種QNs混合標準溶液及3種內標溶液進行正負離子掃描,得到一級全掃描圖譜,19種化合物均在正離子模式下響應值最好。在正離子模式下繼續進行二級質譜掃描,選定信噪比較高的特征離子分別作為定性和定量離子對,采用多反應監測模式優化電壓和碰撞能。優化后的16種QNs及3種內標質譜參數見表1。

表1 16種QNs的質譜參數

2.2 色譜條件優化

2.2.1 色譜柱的選擇 選擇Waters ACQUITY UPLC BEH C18、EclipsePlus RRHD C18、CORTECS T3、Kinetex C8100A 4種不同類型色譜柱進行分離效果評價。當使用Waters ACQUITY UPLC BEH C18、EclipsePlus RRHD C18時,19種化合物均能在5 min內實現分離,其中Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱峰型尖銳,響應值最好。黃季維等[22]采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱,能夠有效分離出禽畜肉中18種QNs,其峰型均較好。因此,最終選擇Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱作為分析色譜柱。

2.2.2 流動相的選擇 對比了0.2%甲酸水/甲醇、水/甲醇、水/乙腈、0.2%甲酸水/乙腈、5 mmol/L乙酸銨水溶液/乙腈、5 mmol/L乙酸銨水溶液/甲醇6種不同流動相對16種QNs和3種內標物的分離效果。結果發現,當流動相含有甲酸時,分離效果較好,且采用0.2%甲酸水/乙腈流動相能夠兼顧16種QNs及3種內標物,其色譜峰型對稱、信號響應高、穩定性好。黃燕紅等[23]發現采用UPLC-MS/MS法篩查豆芽中12種喹諾酮類藥物殘留時,選用0.1%甲酸水/乙腈作為流動相同樣具有較高靈敏度,說明甲酸水/乙腈體系流動相適用于喹諾酮類抗生素的檢測分離。因此,選用0.2%甲酸水/乙腈作為流動相。16種QNs化合物質譜總離子色譜圖如圖1所示。

圖1 16種喹諾酮MRM色譜圖

2.3 樣品前處理方法優化

2.3.1 提取 試驗采用乙腈作為提取溶劑,通過加標回收試驗的方式,考察6種不同濃度甲酸/乙腈提取液(0,0.5%,1.0%,2.0%,4.0%,5.0%)對16種QNs提取效果的影響。由圖2可知,純乙腈和0.5%、1.0%甲酸/乙腈提取萘啶酸、惡喹酸、氟甲喹、奧比沙星的回收率偏高,說明以上3個濃度提取溶劑對這4個化合物顯示基質增強效應;2%甲酸/乙腈提取時基質增強效應開始減弱;4%甲酸/乙腈作為提取溶液時整體回收率較好,回收率為88.0%～111.0%;當提取溶液中甲酸濃度達到5%時,部分化合物回收率偏高。因此,選擇最優的提取液為4%甲酸/乙腈。

圖2 樣品提取液對16種QNs回收率的影響

2.3.2 凈化 以回收率為指標,比對了C18、PRime HLB、MAS-Q 3種類型固相萃取柱的凈化效果,結果如圖3所示。Bond Elut C18、PRime HLB固相萃取柱對16種QNs均有回收,其中Bond Elut C18固相萃取柱的凈化效果最佳,整體回收率為99.7%～117.8%;PRime HLB固相萃取柱對萘啶酸、惡喹酸、奧比沙星的回收率偏高;MAS-Q固相萃取柱的凈化效果不理想,多數目標物無回收率,可能是柱填料對這些化合物具有吸附作用,未收集到目標物。因此,選擇最優的固相萃取柱為Bond Elut C18。

圖3 3種固相萃取柱對16種QNs回收率的影響

2.4 線性范圍、檢出限及定量限

采用優化好的方法對16種QNs空白基質標準工作溶液進行測定,其線性方程、檢出限及定量限結果見表2。由表2可知,在2.0～50 ng/mL濃度范圍內,16種QNs均呈良好線性關系,相關系數>0.998 49,檢出限和定量限分別為0.3～4.1,0.9～11.0 μg/kg,優于SN/T 1751.2—2007中規定10.0 μg/kg的檢出限值,說明試驗方法靈敏度較高。

表2 16種QNs的線性關系、檢出限、定量限

2.5 回收率與精密度

由表3可知,16種QNs的平均回收率為79.0%～104.7%,RSD為1.0%～8.1%,說明該方法的回收率及重復性較好,符合GB/T 27404—2008的要求。

表3 16種QNs的回收率和RSD

2.6 烹飪方式對魚肉中QNs殘留量的影響

為進一步分析高溫烹飪對魚肉QNs殘留量的影響,根據飲食習慣采用油炸、水煮、清蒸3種日常烹飪方式對樣品進行處理后測定QNs殘留量,結果見圖4。由圖4可知,陰性樣品均未檢出,不作統計;3種烹飪方式的魚肉陽性樣品測定值與對照相比均無顯著性差異,說明3種烹飪方式的魚肉中喹諾酮類抗生素未發生明顯降解,其熱穩定性較好,對人體的膳食暴露仍存在較大威脅,因此,需要持續加強淡水魚中喹諾酮類抗生素的監管及膳食暴露風險評估工作。薛哲等[24]研究表明,內酰胺類以及大環內酯類抗生素在高溫下容易開環,而氨基糖苷類等抗生素的熱穩定性較好,但有關喹諾酮類抗生素的降解尚未見報道。

圖4 烹飪方式對魚肉中QNs殘留量的影響

3 結論

采用內標法建立了淡水魚中16種喹諾酮類抗生素UPLC-MS/MS的檢測方法,該方法前處理簡單,具有良好靈敏度和重現性,適用于鮮活魚類及不同高溫烹飪處理后魚肉樣本的檢測,各化合物均在5 min內完成分析,可滿足淡水魚中喹諾酮類抗生素的高通量篩查及膳食風險評價。對水煮、清蒸及油炸3種烹飪方式的魚肉加標樣品進行檢測,發現3種烹飪方式測定值與對照相比,16種喹諾酮類抗生素殘留量均無顯著性差異,說明傳統烹飪方式對魚肉中喹諾酮類抗生素降解效果不明顯。后續需要持續加強淡水魚中喹諾酮類抗生素的監管及膳食暴露風險評估工作。