氣相色譜法測定吡唑硼酸頻哪酯及方法學驗證

王武寶，高思國，劉水蓮，范榮榮，任耀輝，馬 雪，張 雨

(濟南尚博醫藥股份有限公司，山東 濟南 250204)

有機硼化合物的Suzuki反應在有機合成和組合化學等領域應用十分廣泛，這是因為其獨特的結構特征和良好的生物活性和藥理作用[1-3]。吡唑基團存在于大量的天然和合成的小分子配體中，可與多種具有藥理重要性的酶和受體相互作用，被廣泛應用于合成潛在的酶抑制劑、癌癥的硼中子俘獲治療法等，在抗腫瘤藥物開發方面有著重要意義[4-5]。烷基吡唑硼酸是合成很多具有生物活性化合物的重要中間體。作為反應原料與頻哪醇縮合成酯后，其穩定性提高，可長期儲存，更便于用作有機合成的重要試劑和進一步的藥物相關活性的研究。吡唑硼酸頻那醇作為吡唑硼酸頻那醇酯類的重要中間體之一，具有非?？捎^的發展前景，更能廣泛地應用于生物醫藥行業。但是，目前未有相關文獻報道檢測吡唑硼酸頻哪酯的方法。本文建立一種氣相色譜法，操作簡單，經驗證，該方法結果準確，可用于檢測吡唑硼酸頻哪酯。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 7890B氣相色譜儀(安捷倫公司)；Agilent 7890B氣相色譜儀(安捷倫公司)；XS105型電子分析天平(梅特勒-托利多國際有限公司)；5%苯基-甲基聚硅氧烷(30 m×φ0.25 mm，0.25 μm)色譜柱(安捷倫公司)。

吡唑硼酸頻哪醇酯，濟南尚博醫藥股份有限公司，批號2105；二氯甲烷，山東金嶺化工股份有限公司，批號21024；四氫呋喃，濰坊振興日升化工有限公司，批號2010；吡唑，濟南安科諾新材料有限公司，批號3003；色譜純乙腈(TEDIA)。

1.2 檢測方法

色譜柱：5%苯基-甲基聚硅氧烷(30 m×φ0.25 mm，0.25 μm)；檢測器：氫離子火焰檢測器；載氣：氮氣；流速：1.0 mL/min；進樣器溫度：215 ℃；檢測器溫度：295 ℃；分流比：3∶1；進樣量：0.1 μL；柱箱溫度：初始 50 ℃，維持 2 min，按 10 ℃/min 升溫至 150 ℃，維持 0 min，按 30 ℃/min 升溫至 260 ℃，維持 5 min；氫氣流速：30 mL/min；空氣流速：300 mL/min；氮氣流速：25 mL/min。

對照品溶液制備：精密稱定 1.0 g 吡唑硼酸頻哪醇酯樣品置于 10 mL 容量瓶中，加乙腈溶解后定容至刻度線，搖勻，作為對照品溶液。

1.3 方法學驗證

1.3.1 專屬性

二氯甲烷溶液制備：移取約 10 mL 稀釋劑，置于 25 mL 容量瓶中，再精密稱定 2.5 g 二氯甲烷，置于容量瓶中，溶解后定容至刻度線，搖勻。

四氫呋喃溶液制備：移取約 10 mL 稀釋劑，置于 25 mL 容量瓶中，再精密稱定 2.5 g 四氫呋喃，置于容量瓶中，溶解后定容至刻度線，搖勻。

吡唑溶液制備：移取約 10 mL 稀釋劑，置于 25 mL 容量瓶中，再精密稱定 2.5 g 吡唑，置于容量瓶中，溶解后定容至刻度線，搖勻。

對照品溶液制備：精密稱定 2.5 g 吡唑硼酸頻哪醇酯樣品，置于 25 mL 容量瓶中，用稀釋劑溶解后定容至刻度線，搖勻。

混合溶液制備：分別精密移取 1 mL 二氯甲烷溶液、四氫呋喃溶液和吡唑溶液，置于 10 mL 容量瓶中，加對照品溶液稀釋定容至刻度線，搖勻。

分別取空白溶液(乙腈溶液)、二氯甲烷溶液、四氫呋喃溶液、吡唑溶液、對照品溶液及混合溶液，各進1針，記錄氣相色譜圖，獲得各成分主峰的保留時間。

1.3.2 重復性

重復性試驗中供試品溶液制備：精密稱定6份吡唑硼酸頻哪醇酯，分別置于 10 mL 容量瓶中，每份 1.0 g。加稀釋劑溶解后，定容至刻度線，搖勻。依次進樣分析，記錄氣相色譜圖，獲得各份吡唑硼酸頻哪醇酯的峰面積，計算吡唑硼酸頻哪醇酯的質量分數。

1.3.3 線性

線性試驗中供試品溶液制備：精密稱定 10.0 g 吡唑硼酸頻哪醇酯，置于 50 mL 容量瓶中，加稀釋劑溶解后定容至刻度線，搖勻，配制成質量濃度為 200 mg/mL 的溶液。分別移取4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 mL 的溶液至 10 mL 容量瓶中，用稀釋劑再次稀釋定容至刻度線，搖勻，作為線性系列試驗溶液，標記為A(80%)、B(90%)、C(100%)、D(110%)、E(120%)。各進1針，記錄氣相色譜圖，獲得不同質量濃度吡唑硼酸頻哪醇酯的峰面積。以峰面積與相應質量濃度比值進行線性回歸，得到回歸方程。

1.3.4 中間精密度

中間精密度試驗中供試品溶液制備：分析員A和B于第一天分別精密稱定3份吡唑硼酸頻哪醇酯，置于 10 mL 容量瓶中，每份1.0 g，加稀釋劑溶解后定容至刻度線，搖勻，依次進樣分析；第二天分析員A按相同方法再配制3份供試品溶液，分別用兩臺儀器檢測，依次進樣分析；記錄氣相色譜圖，獲得不同人員、不同時間、不同儀器下吡唑硼酸頻哪醇酯的峰面積，計算各條件下吡唑硼酸頻哪醇酯的純度及RSD值。

1.3.5 溶液穩定性

溶液穩定性試驗中供試品溶液制備：精密稱定 1.0 g 吡唑硼酸頻哪醇酯，置于 10 mL 容量瓶中，加稀釋劑溶解后定容至刻度線，搖勻，于配制后0、1、2、3、6、12 h 依次進樣分析，記錄氣相色譜圖，獲得不同進樣時間下吡唑硼酸頻哪醇酯的峰面積，計算純度結果相對于 0 h 的變化。

2 結果與分析

2.1 專屬性結果

空白溶液中的峰對樣品檢測無明顯干擾，混合溶液中吡唑硼酸頻哪醇酯和其他雜質都能被有效分離，產物峰前后分離度大于1.5(如表1所示)，專屬性試驗通過。

表1 專屬性試驗結果

2.2 重復性結果

通過計算供試品的純度，6針RSD值為0.002%(如表2所示)，小于2%，重復性試驗通過。

表2 重復性試驗結果

2.3 線性結果

線性回歸方程為Y=285X-1923.4，相關系數為0.9985，大于0.95(如表3所示)，線性試驗通過。

表3 線性試驗結果

2.4 中間精密度結果

通過計算供試品的純度，不同分析員同一天測定結果RSD值為0.010%，同一分析員不同天測定結果RSD值為0.007%，同一分析員不同儀器測定結果RSD值為0.027%(如表4、表5、表6所示)，均小于2%，中間精密度試驗通過。

表4 中間精密度試驗結果1

表5 中間精密度試驗結果2

表6 中間精密度試驗結果3

2.5 溶液穩定性結果

供試品溶液 0、1、2、3、6、12 h 純度結果相對于 0 h 的變化，均在0.5%以內，12 h 內溶液穩定(如表7所示)，穩定性試驗通過。

表7 溶液穩定性試驗結果

3 結論

采用氣相色譜法測定吡唑硼酸頻哪酯，并進行了方法學驗證，包括專屬性、重復性、線性、中間精密度和溶液穩定性，結果表明，該方法能夠準確測定吡唑硼酸頻哪酯的有關物質，且方法操作簡單、準確。