透明質酸鈉的熱穩定性及降解動力學模型

袁西倫，王文斌，吳劍英

透明質酸鈉（sodium hyaluronate，SH）于1934 年被發現[1]，是由D-葡萄糖醛酸和N-乙?；咸前分g通過糖苷鍵相互交聯的多糖[2，3]。 其主要用在骨關節炎治療、眼科、外科手術防粘連、醫學美容、化妝品等領域[4～8]。

文獻研究報道，SH 的結構中存在大量羥基，在溶液中SH 能夠形成許多氫鍵[9～12]。 在氫鍵及范德華力的作用下，SH 分子形成了二級雙螺旋結構，提高了穩定性[10，12，13]。 二級結構通過生物化學作用在體內形成網狀三級結構[13～18]。

SH 的降解是從長鏈大分子裂解成小的鏈段反應，是聚合物的破壞反應，其降解主要表現在相對分子質量（relative molecular mass，Mr） 的變化，de Melo BAG 等[9]進行了在高溫（60 ℃）及高pH（pH 12）條件下SH 的降解動力學研究。 Mondek J 等[19]研究了在37 ℃及120 ℃條件下對SH 粉末及溶液的穩定性的影響。 筆者通過分子排阻色譜法實驗檢測SH 的Mr，考察不同溫度下的熱穩定性， 并建立降解動力學模型。 另外，筆者還進行了SH 經高溫作用后的穩定性研究， 結合文獻分析其熱穩定性變化的可能內在原因，為SH 的生產、研究提供理論指導意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗樣品

SH（上海利康瑞生物工程有限公司，中國）。

1.1.2 主要試劑與儀器

磷酸氫二鈉及磷酸二氫鈉（湖南九典宏陽制藥有限公司，中國）；氯化鈉（江蘇勤奮藥業有限公司，中國）；聚苯乙烯磺酸鈉對照品（北京潤匯源公司，中國）。

Agilent 1100 型液相色譜系統、G1362A 示差折光檢測器（安捷倫科技公司，美國）；Shodex SB-806HQ（300 mm × 8.0 mm）凝膠柱（Agilent Technologies，美國）；DHG-9245A 電熱恒溫干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司，中國）；Memmert hpp750 恒溫恒濕箱（美墨爾特公司，德國）；RFM-1.2 通風式干燥滅菌器（山東新華醫療器械股份有限公司，中國）；XPR105DR 天平（梅特勒-托利多公司，瑞士）；RCT 5 D S025 磁力攪拌臺（艾卡公司，德國）。

1.2 方法

1.2.1 透明質酸鈉在不同溫度下的穩定性考察

稱取適量的SH 原料（1%）、磷酸氫二鈉（0.054%）、磷酸二氫鈉（0.00017%）、氯化鈉（0.85%）和適量注射用水，配成含1%SH 溶液，用西林瓶分裝；分別在60 ℃、80 ℃、100 ℃、115 ℃和121 ℃下進行穩定性考察，不同時間點取樣，檢測SH 的Mr。

1.2.2 121 ℃高溫滅菌后透明質酸鈉穩定性考察

按照1.2.1 節配制方法配制SH 溶液， 用西林瓶分裝； 在121 ℃下，F0= 8 進行高溫滅菌， 然后在25 ℃、40 ℃、50 ℃和60 ℃進行穩定性考察，以及未滅菌的樣品在25 ℃下進行穩定性考察， 不同時間點取樣，檢測SH 的Mr。

1.2.3 透明質酸鈉相對分子質量檢測方法

采用分子排阻色譜法 （《中國藥典》2015 年版四部通則0514）檢測SH 的Mr。

色譜條件：Shodex SB-806HQ（300 mm×8.0 mm）凝膠柱，0.2 mol/L 氯化鈉溶液（含0.01%NaN3）溶液為流動相，柱溫40 ℃，流速為0.5 mL/min，示差折光檢測器。

操作步驟：取樣品適量，加流動相配制成質量濃度0.5 mg/mL SH 溶液作為供試品溶液，取聚苯乙烯磺酸鈉對照品適量，加流動相配制成質量濃度0.5 mg/mL聚苯乙烯磺酸鈉溶液為對照品溶液； 取供試品溶液、對照品溶液各100 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，采用凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）專用軟件處理數據，計算SH 的Mr。

1.2.4 透明質酸鈉降解動力學模型構建

采用阿倫尼烏斯（Arrhenius）[20～22]動力學方程建立SH 降解動力學模型。

一級反應動力學方程式（1），轉換成對數形式方程式（2），對SH 的Mr 與時間（t）的關系按照一級反應方程式（2）進行擬合。

式中：Mr 為任意時間SH 的相對分子質量；Mr0為Mr的起始值；k 為相應條件下反應降解速率常數；t 為穩定性考察時間。

阿倫尼烏斯（Arrhenius） 動力學方程式（3），其對數形式為方程式（4），利用不同溫度下SH 的降解常數與相應的絕對溫度按方程式（4）進行擬合，計算得活化能Ea（kJ/mol），建立SH 的降解動力學方程。

式中：k 為反應降解速率常數；A 為前因子；Ea 為活化能（kJ/mol）；R 為氣體常數，8.314 J/（mol·K）；T 為絕對溫度（K）。

1.2.5 數據處理

所有實驗數據采用Origin2021 軟件進行繪圖、相關動力學分析與回歸分析。

2 結果

2.1 透明質酸鈉在不同溫度下相對分子質量變化

2.1.1 透明質酸鈉的相對分子質量與溫度和時間的關系

SH 在100 ℃、115 ℃、121 ℃條件下， 其Mr 隨時間的變化趨勢逐漸下降 （圖1）； 在60 ℃、80 ℃條件下，其Mr 隨時間的變化趨勢逐漸下降（圖2）。

圖1 SH 在100 ℃、115 ℃、121 ℃下Mr 隨時間變化趨勢圖Fig.1 Trend graph of Mr of SH changed with time at 100 ℃,115 ℃and 121 ℃

圖2 SH 在60 ℃、80 ℃下Mr 隨時間變化趨勢圖Fig. 2 Trend graph of Mr of SH changed with time at 60 ℃and 80 ℃

2.1.2 透明質酸鈉的對數相對分子質量與時間和溫度關系

將SH 的lnMr 與時間（t）做線性擬合，其具有較高的相關性，說明SH 的熱降解屬于一級動力學；圖3是SH 在60 ℃、80 ℃下lnMr-t 的線性擬合圖， 圖4是SH 在100 ℃、115 ℃、121 ℃下lnMr-t 的線性擬合圖。

圖3 SH 在60 ℃、80 ℃下lnMr-t 的線性擬合圖Fig.3 Linear fitting plot of lnMr-t of SH at 60 ℃and 80 ℃

圖4 SH 在100 ℃、115 ℃、121 ℃下lnMr-t 的線性擬合圖Fig.4 Linear fitting plot of lnMr-t at 100 ℃,115 ℃and 121 ℃

2.1.3 透明質酸鈉在不同溫度的降解常數與溫度關系

SH 在60 ℃、80 ℃、100 ℃、115 ℃和121 ℃的降解常數與溫度關系見表1， 根據阿倫尼烏斯（Arrhenius）動力學方程式（4）做lnk-1/T×1000 的線性擬合（圖5）。根據線性擬合得到的斜率計算，得到SH 的熱降解活化能Ea=120.012 kJ/mol，SH 熱降解動力學方程式為lnk=lnA-120.012/RT。 筆者實驗的SH 熱降解活化能與文獻報道基本一致，董科云等[23]研究的SH 熱穩定性降解活化能為116 ～118 kJ/mol，T?mmeraas K 等[22]研究的在濃度0.1 mol/L HCl 中SH 降解活化能為137 kJ/mol，Caspersen MB 等[24]在pH值中性條件下SH 降解活化能為127 kJ/mol。

圖5 SH 的lnk-1/T×1000 線性擬合圖Fig.5 Linear fitting plot of lnk-1/T×1000 of SH

2.2 121 ℃滅菌后透明質酸鈉的穩定性

根據阿倫尼烏斯（Arrhenius）理論計算得到了SH熱降解動力學方程式，這樣就可以推算出SH 在不同溫度下的穩定性，但根據中國藥品監督管理局法規要求，用于注射用的藥品、醫療器械盡可能地進行終端滅菌。 經過121 ℃高溫滅菌后SH 穩定性如何，是否與該熱降解動力學模型一致。 為此，進行了121 ℃高溫作用后SH 的穩定性研究。

SH 注射液經121 ℃、F0=8 min 滅菌后，在25 ℃、40 ℃、50 ℃和60 ℃進行穩定性考察， 考察SH Mr 的變化。 50 ℃和60 ℃，進行lnMr-t 的線性擬合（圖6），其相關系數（R2）分別是0.80870、0.99016，60 ℃具有較好的相關性，屬于一級反應動力學，而50 ℃條件下其線性相關性較差。 表明高溫作用后的SH 在50 ℃條件下的穩定性，其熱降解不屬于一級動力學。 40 ℃穩定性考察的lnMr-t 的線性擬合（圖7），其R2是0.84761，相關性較差；將Mr 與t 關系按照ExpDec1模型進行非線性擬合（圖8），R2=0.98016，具有較好的相關性， 說明高溫作用后SH 在40 ℃條件下降解也不屬于一級動力學。 經高溫滅菌和未滅菌的SH 在25 ℃穩定性考察，進行lnMr-t 線性擬合（圖9），其R2分別是0.32102 和0.98985。 結果表明，未經高溫作用的SH 在25 ℃條件下的lnMr-t 線性良好（R2=0.98985），其熱降解屬于一級動力學。 而高溫作用后SH 在25 ℃條件下的lnMr-t 相關性較差（R2=0.32102）， 將其Mr 與t 按照ExpDec2 模型進行非線性擬合（圖10）， 擬合結果為R2=0.99331，具有很好的相關性， 說明經高溫作用后SH 在25 ℃條件下的降解也不屬于一級動力學。

圖6 滅菌后SH 在50 ℃、60 ℃條件下lnMr-t 的線性擬合圖Fig.6 Linear fitting plot of lnMr-t of SH at 50 ℃and 60 ℃after sterilization

圖7 滅菌后SH 在40 ℃條件下lnMr-t 的線性擬合圖Fig. 7 Linear fitting plot of lnMr-t of SH at 40 ℃after sterilization

圖8 高溫滅菌后SH 在40 ℃條件下Mr-t 的曲線擬合圖Fig. 8 Curve fitting plot of Mr-t of SH at 40 ℃after high-temperature sterilization

圖9 高溫滅菌后和未滅菌的SH 在25 ℃條件下lnMr-t 的線性擬合圖Fig. 9 Linear fitting plot of lnMr-t at 25 ℃for SH after hightemperature sterilization and non-sterilization

圖10 高溫滅菌后SH 在25 ℃條件下Mr-t 的曲線擬合圖Fig.10 Curve fitting plot of Mr-t of SH at 25 ℃after high-temperature sterilization

3 討論

已有多篇文獻報道了SH 的熱穩定性研究，但至今未檢索到SH 經過高溫滅菌（121 ℃）后其穩定性變化的研究。 筆者通過SH 高溫滅菌后不同溫度條件下穩定性的研究，結合文獻分析其熱穩定性變化的可能內在原因，為SH 的生產、研究提供理論指導。

在60 ℃、80 ℃、100 ℃、115 ℃和121 ℃下SH Mr的lnMr 與t 的線性擬合R2分別是0.98877、0.99976、0.97869、0.98149 和0.98926，均具有較好的相關性，屬于一級降解動力學，其熱降解活化能Ea =120.012 kJ/mol，與文獻報道基本一致。

經高溫滅菌后（121 ℃），SH 在25 ℃、40 ℃、50 ℃和60 ℃下Mr 的lnMr 與t 的線性擬合相關系數（R2）分別是0.32102、0.84761、0.8087 和0.99016，除60 ℃具有較好的線性相關性，屬于一級降解動力學，其他25 ℃、40 ℃、50 ℃下其線性相關性都較差，不符合一級動力學， 而未經過高溫作用的SH 在25 ℃穩定性的線性R2是0.98985，具有較好的相關性，其降解屬于一級動力學。 從上可以看出， 經高溫作用后，SH 的熱穩定性動力學發生了變化。

已有大量文獻報道，SH 結構中存在大量羥基，SH 中可以形成許多氫鍵， 氫鍵對SH 的穩定性起到關鍵作用。Scott JE、Tigwell MJ[10]研究表明，在室溫下，SH 很穩定，即使使用高碘酸氧化，其降解也很慢；在37 ℃時，SH 的構象發生改變， 其氫鍵處于可能過渡態狀態，可能空間位阻效應和過渡態能量都對抗性糖胺聚糖的氧化起作用，SH 中的氫鍵活化能大約為8.4 ～12.6 kJ/mol，SH 的氧化之前需要先破壞聚合物乙二醇基中羥基的氫鍵, 多篇文獻表明[12，25，26]，SH 在溶液中發生可逆構象轉變。筆者實驗及多篇文獻[22，23，27]都表明，50 ℃時Mr 下降不明顯；＞60 ℃時，SH 的分解速率隨溫度呈指數增長。 這可能是SH 的氫鍵作用，在＞60 ℃時，其氫鍵被打開，SH 的穩定性很差；在＜60 ℃、＞37 ℃時，SH 的構象發生改變，其氫鍵處于可能過渡態狀態；＜37 ℃時， 由于氫鍵作用，SH 很穩定；SH 在溶液中，隨著溫度的變化，其氫鍵（斷開-耦合）、構象，會發生可逆轉變。

經過高溫滅菌后的SH 在60 ℃以上的條件下，其打開的氫鍵可能很難再恢復，其穩定性主要受到了60 ℃的環境因素影響，降解很快，其穩定性的lnMr-t線性擬合的R2達到0.99016，具有很好的相關性，降解仍然屬于一級動力學。 而當低于60 ℃后，SH 的氫鍵、構象具有可逆轉變的特點，其氫鍵可能會逐步恢復，氫鍵處于過渡狀態，加上穩定性的環境溫度等多重因素影響， 在早期其降解速度也較快，4 ～6 個月后，被打開的氫鍵逐步恢復，其相對分子質量下降也逐步變慢；因為這些多重因素的影響，其降解不符合一級動力學。 另外，未經過高溫作用的SH 在25 ℃穩定性考察中，由于其氫鍵未經高溫斷開，其穩定性的lnMr-t 線性擬合的R2是0.98985， 具有較好的相關性，其降解很慢，也屬于一級動力學；從另外一個維度可能也說明，由于高溫對其氫鍵的作用，經高溫作用后的SH 穩定性與未經過高溫作用的SH 不一樣。 因此，高溫作用后的SH 穩定性，在＞60 ℃仍符合一級降解動力學機制；＜60 ℃的穩定性， 可能由于氫鍵處于過渡態， 其早期降解速度也較快，4 ～6 個月后，被打開的氫鍵可能逐步恢復， 其Mr 下降也逐步變慢，因為多重因素的影響，其降解不屬于一級動力學。 至于經高溫作用后SH 熱穩定性動力學變化的真正內在原因還需要進一步研究證實。

經高溫作用后SH 熱穩定性動力學發生變化的發現，這對SH 制備、研究有一定的指導意義。 在進行SH 的生產時，為了減少SH 的降解，盡量在＜60 ℃的條件下進行，最好在＜37 ℃下制備；進行SH 注射液仿制藥研究時（法規要求高溫濕熱滅菌），由于從市場上購買的參比制劑（高溫濕熱滅菌）一般都是在生產日期后6 個月以上的，其Mr 已經快速下降，因此購買的參比制劑不能從0 d 開始進行穩定性考察，也無法做到從生產日期開始就進行對比研究，因此只能從參比制劑生產日期開始后相對應的月份進行穩定性對比研究。

4 結論

SH 的熱降解屬于一級動力學機制， 不同溫度的降解常數也符合阿倫尼烏斯（Arrhenius）反應動力學定律，SH 的熱降解活化能Ea=120.012 kJ/mol， 與文獻報道基本一致。

高溫作用后的SH 穩定性，在＞60 ℃屬于一級降解動力學；但＜60 ℃時，SH 的初始降解速度也較快，4 ～6 個月后，其Mr 下降逐步變慢，其降解不屬于一級動力學。

高溫作用后的SH 熱穩定性動力學變化， 對其SH 制備、研究具有一定指導意義。 在進行SH 的生產時，盡量在＜60 ℃條件下進行，最好在＜37 ℃下制備。進行SH 注射液等仿制藥研究時，只能從參比制劑生產日期開始后相對應的月份進行穩定性對比研究。