蒲公英TmRAV1基因克隆及其響應脫落酸信號表達分析

吳志清, 亓希武, 房海靈, 于 盱, 李 莉, 柏 楊, 劉 群,①, 梁呈元,①

〔1. 南京中醫藥大學, 江蘇 南京 210023;2. 江蘇省中國科學院植物研究所(南京中山植物園) 江蘇省植物資源研究與利用重點實驗室, 江蘇 南京 210014〕

蒲公英(TaraxacummongolicumHand.-Mazz.)為一種藥食同源的多年生植物,全草入藥,具有清熱解毒、消腫散結等功效[1]。蒲公英主要有效成分為酚酸類、黃酮類和香豆素類等[2-3],具有抗菌、抗炎、抗氧化和抗腫瘤等藥理作用[4-5]。目前,已開發出多種蒲公英產品,包括蒲公英根茶、蒲公英花茶、蒲公英掛面和蒲公英酵素等,市場需求量大[6]。蒲公英種質資源良莠不齊,其產量和質量難以穩定控制,因此,如何獲得高品質的蒲公英新種質資源成為制約該產業發展的一個重要因子,利用生物技術改良蒲公英種質資源成為研究的熱點之一[7]。

AP2/ERF(apetala2/ethylene responsive factor)轉錄因子家族成員能夠響應多種生物和非生物脅迫,激活激素應答信號,從而參與調控植物的生長發育過程[8]。根據保守結構域的類型,AP2/ERF轉錄因子家族可分為4個亞家族:AP2(apetala2)、RAV(related to abscisic acid insensitive 3/viviparous 1)、ERF(ethylene responsive factor)和DREB(dehydration-responsive element binding protein)[9-11]。RAV轉錄因子含有N端的AP2結構域和C端的B3結構域[12],參與多種逆境脅迫。例如:在棉花(GossypiumhirsutumLinn.)中過表達擬南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕AtRAV1和AtRAV2能提高棉花的抗旱性,延遲開花時間并增加纖維長度[13];在擬南芥中過表達大豆〔Glycinemax(Linn.) Merr.〕GmRAV-03能夠提高擬南芥的抗旱和耐鹽能力,表現出對脫落酸(ABA)響應不敏感[14];在黃瓜(CucumissativusLinn.)中,CsRAV1響應脫落酸信號,從而提高黃瓜對鹽脅迫的耐受性[15]。進一步研究發現,RAV轉錄因子還能參與植物對病原體的響應。例如:番茄(SolanumlycopersicumLinn.)SlRAV2受外源基因AtCBF1的調控,進而調控致病相關基因的表達,從而增強番茄對青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)感染的耐受性[16];木薯(ManihotesculentaCrantz)MeRAV1和MeRAV2通過調控褪黑素合成基因MeTDC2、MeT5H和MeASMT1的表達來提高木薯對細菌性枯萎病的抵抗能力,且MeRAV1、MeRAV2、MeRAV3、MeRAV4、MeRAV5、MeRAV6和MeRAV7能共同調節活性氧含量和下游抗病基因MebZIP5、MeNR2、MeIAA5和MeIAA17的表達,進而提高木薯的抗病能力[17-18]。水稻RAV在受到條紋病毒和黑條矮縮病毒侵染時其表達量顯著變化[19]。

前期研究結果顯示:脫落酸可以顯著促進蒲公英次生代謝產物的積累,提高蒲公英的品質[20]。因此,本研究通過對脫落酸處理的蒲公英轉錄組數據進行分析,篩選出1個差異表達的RAV1基因,對該基因編碼蛋白進行了氨基酸序列比對、系統進化關系、二級結構、三級結構以及亞細胞定位等分析,并分析該基因在蒲公英中的表達模式,驗證其轉錄調控特性及蛋白互作的功能,以期為研究RAV轉錄因子參與蒲公英逆境脅迫的生物學功能提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

供試野生蒲公英植株和種子均采自南京中山植物園(東經118°49′48″、北緯32°03′00″,海拔106 m)。于3月至4月采集蒲公英全株,用蒸餾水清洗干凈后分別取根、葉和花,液氮速凍后于-80 ℃保存,用于后續RNA提取。

于3月至4月采集蒲公英種子,于同年4月種植于有機質土壤(南京壽德生物科技有限公司)與蛭石(體積比1∶3)的混合基質中,種植15 d后,將蒲公英幼苗移栽至塑料盆(長10 cm、寬10 cm、高10 cm)中,每盆1株,然后置于人工培養箱(溫度26 ℃、光照時間16 h·d-1)中培養60 d左右開始實驗。共設置100 μmol·L-1脫落酸(ABA)、100 μmol·L-1茉莉酸甲酯(MeJA)、100 μmol·L-1赤霉素(GA)、100 μmol·L-1水楊酸(SA)和250 mmol·L-1NaCl 5個處理。選擇長勢基本一致的幼苗,每個處理用200 mL處理液將幼苗噴灑至葉濕潤并灌根。分別于處理0、2、4、8和24 h采集葉,用液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱,用于后續RNA提取。每個處理各處理時間取3株,作為3個生物學重復。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取、cDNA合成及基因克隆 取蒲公英新鮮葉片用液氮研磨,根據RNA提取試劑盒Eastep?Super Total RNA Extraction Kit (LS1040)〔普洛麥格(北京)生物技術有限公司〕的使用說明書提取蒲公英葉片的RNA,使用UniClone One Step Seamless Cloning Kit (SC612)(北京金沙生物科技有限公司)試劑反轉錄獲得蒲公英cDNA。根據蒲公英RAV1的全長編碼序列(CDS)設計特異性引物TmRAV1-F和TmRAV1-R(表1),以cDNA為模板利用高保真DNA聚合酶Phanta?Max Super-Fidelity DNA Polymerase (P505)(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)進行擴增。擴增體系總體積25.0 μL,包括Phanta?Max Super-Fidelity DNA Polymerase 0.5 μL、2×Phanta Max Buffer 12.5 μL、dNTP Mix 1.0 μL、上游和下游引物各0.5 μL、cDNA 1.0 μL及ddH2O 9.0 μL。使用TC-E-48D基因擴增儀(杭州博日科技股份有限公司)進行PCR擴增。擴增程序:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s、54 ℃退火60 s、72 ℃延伸90 s,35個循環;72 ℃終延伸7 min。擴增產物使用質量體積分數1%瓊脂糖凝膠進行電泳,使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(B518131)〔生工生物工程(上海)股份有限公司〕獲得產物,將膠回收產物連接到TA克隆載體(C601-01)(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)上,轉化至大腸桿菌感受態DH5α(TSC-C01)(南京擎科生物科技有限公司),利用50 mg·mL-1卡那霉素進行篩選,獲得陽性克隆,送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

表1 用于蒲公英TmRAV1基因克隆和功能研究的引物相關信息

1.2.2 生物信息學分析 從NCBI網站(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得TmRAV1的同源序列,并進行保守結構域分析;在PlantTFDB網站(http:∥planttfdb.gao-lab.org/)下載擬南芥轉錄因子氨基酸序列;利用ProtParam在線工具(https:∥web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質理化特性;利用Plant-mPLoc軟件(http:∥www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)預測亞細胞定位;利用SignalP-6.0軟件(https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-6.0/)分析信號肽;利用TMHMM2.0在線軟件(https:∥services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析跨膜結構域;利用NetPhos-3.1網站(https:∥services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/)預測磷酸化位點;分別利用在線軟件SOPMA(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa%20_sopma.html)和SWISS-MODEL(https:∥swissmodel.expasy.org/)分析二級結構和三級結構;利用GeneDoc軟件進行同源序列比對分析;利用MEGA 7.0軟件,采用鄰接法繪制系統發育樹,自展支持率(bootstrap value)為1 000。

1.2.3 實時熒光定量PCR(qRT-PCR) 根據TmRAV1的CDS序列設計熒光定量PCR引物qRT-TmRAV1-F和qRT-TmRAV1-R(表1),分別提取蒲公英不同組織和不同處理葉的總RNA,反轉錄獲得cDNA。使用qRT-PCR酶GS AntiQ qPCR SYBR Green Master Mix(SQ412)(北京金沙生物科技有限公司)進行qRT-PCR分析。擴增體系總體積10.0 μL,包括SYBR 5.0 μL、cDNA 1.2 μL、上游和下游引物0.4 μL及RNAase-free ddH2O 3.0 μL。使用CFX-Opus 96熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司)進行擴增。擴增程序:95 ℃預變性30 s;95 ℃變性10 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸15 s,40個循環;在72 ℃采集信號。以β-Actin為內參基因,利用2-ΔΔCT計算相對表達量[21]。每個處理3個技術重復。

1.2.4 亞細胞定位分析 使用限制性內切酶XhoⅠ對pHellsgata8-GFP(35S:GFP)空質粒進行酶切,回收大片段。使用特異性引物pHellsgate-TmRAV1-F和pHellsgate-TmRAV1-R克隆獲得TmRAV1編碼序列,連接至pHellsgata8-GFP載體并轉化至大腸桿菌感受態DH5α,使用載體上游引物35S-F和目的基因下游引物pHellsgata8-TmRAV1-R進行PCR驗證,將驗證成功的單菌落送交生工生物工程(上海)股份有限公司測序,測序成功的重組質粒pHellsgata8-TmRAV1-GFP通過農桿菌轉化法轉至根癌農桿菌感受態GV3101,挑取直徑1～2 mm的農桿菌菌落進行PCR驗證(載體下游引物35S-R和目的基因上游引物pHellsgata8-TmRAV1-F),驗證成功的農桿菌在LB培養基中過夜培養至OD600值約0.8,于4 ℃、5 000 r·min-1離心3 min,去除上清液;使用重懸液〔含10 mmol·L-12-(N-嗎啉代)乙烷磺酸(MES)、10 mmol·L-1MgCl2和0.2 mmol·L-1乙酰丁香酮〕進行重懸,使菌液OD600值約1.0,注射到本氏煙草(NicotianabenthamianaDomin)葉片背面進行瞬時表達,暗培養2～3 d后,使用LSM900激光共聚焦顯微鏡(德國Zeiss公司)觀察結果。以注射含有pHellsgata8-GFP空質粒的農桿菌的葉片為對照,實驗重復3次。

1.2.5 雙熒光素酶(Dual-LUC)分析 根據蒲公英基因組(https:∥ngdc.cncb.ac.cn/search/)查找得到TmAREB1基因的啟動子片段,利用primer5.0設計引物pGreen0800-TmAREB1-F和pGreen0800-TmAREB1-R,并按照“1.2.4”中載體構建的方法將proAREB1構建到pGreen0800(BamH Ⅰ酶切位點)載體上,得到pGreen0800-proTmAREB1重組質粒(用于驅動螢火蟲熒光素酶報告基因),轉至根癌農桿菌感受態GV3101;然后與含有pHellsgata8-TmRAV1-GFP重組質粒(用于驅動海腎熒光素酶報告基因)的農桿菌按照體積比1∶1共同注射于本氏煙草葉片背面。實驗步驟參照“1.2.4”,暗培養2～3 d后,根據雙熒光素酶試劑盒TransDetect?Double-Luciferase Reporter Assay Kit(AT321)(北京全式金生物技術股份有限公司)說明書對葉片進行處理,使用Tanon 5200 Multi全自動化學發光/熒光圖像分析系統(上海天能生命科學有限公司)觀察。將含有pHellsgata8-GFP空質粒與pGreen0800-proTmAREB1重組質粒的農桿菌按照體積比1∶1共同注射于本氏煙草葉片背面作為對照[21]。

1.2.6 酵母雙雜交(Y2H)實驗 在蒲公英基因組中,通過同源比對篩選獲得脫落酸信號核心蛋白家族成員AtSnRK2.6的同源基因TmSnRK2.6。設計同源重組引物BD-TmSnRK2.6-F和BD-TmSnRK2.6-R將TmSnRK2.6連接到pGBKT7(EcoR Ⅰ酶切位點)載體上,同時設計引物AD-TmRAV1-F和AD-TmRAV1-R將TmRAV1構建到pGADT7(EcoR Ⅰ酶切位點)載體上,方法參照“1.2.4”。將構建好的pGADT7-TmRAV1和pGBKT7-TmSnRK2.6重組質粒共同轉化至酵母菌感受態Y2H中,在SD/-Trp/-Leu培養基上生長3～5 d后轉移至含X-α-gal的SD/-Ade/-His/-Trp/-Leu培養基上觀察是否變藍。pGADT7及pGBKT7空質粒共轉化Y2H作為陰性對照。

1.2.7 雙分子熒光互補(BiFC)分析 分別將TmRAV1和SnRK2.6構建到pXY104-cYFP(BamH Ⅰ酶切位點)和pXY106-nYFP(SalⅠ酶切位點)載體上,獲得pXY104-TmRAV1-cYFP和pXY106-SnRK2.6-nYFP重組質粒,按照“1.2.4”中的方法轉化至根癌農桿菌感受態GV3101,將含有pXY104-TmRAV1-cYFP和pXY106-SnRK2.6-nYFP重組質粒的農桿菌按照體積比1∶1混合后共同注射于本氏煙草葉片背面,暗培養2～3 d,使用LSM900激光共聚焦顯微鏡觀察。cYFP和nYFP空質粒共同轉化作為陰性對照。

2 結果和分析

2.1 TmRAV1基因克隆及蛋白質生物信息學分析

2.1.1 基因克隆及測序分析 以蒲公英葉片cDNA作為模板,使用特異性引物PCR擴增得到1條長度約1 000 bp的條帶(圖1),將膠回收片段連接轉化后進行測序,測序結果與預期結果一致,TmRAV1開放閱讀框(ORF)長度為1 026 bp,GC含量為47.95%,編碼342個氨基酸(圖2)。

M: DL2000 DNA marker; 1: TmRAV1.

圖2 蒲公英TmRAV1的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列

2.1.2 同源序列比對及系統發育樹構建 蒲公英TmRAV1與其他植物RAV的氨基酸序列比對結果(圖3)顯示:蒲公英TmRAV1與其他植物的RAV具有高度保守的AP2和B3結構域以及核定位信號,且與萵苣(LactucasativaLinn.)LsRAV1(NCBI登錄號XP_023746260.1)的同源性最高,一致性達85.88%。

Tm: 蒲公英Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.; Ls: 萵苣Lactuca sativa Linn. (XP_023746260.1); Cc: 朝鮮薊Cynara cardunculus var. scolymus (Linn.) Benth. (XP_024988000.1); Ha: 向日葵Helianthus annuus Linn. (XP_022020644.1); Tc: 除蟲菊Tanacetum cinerariifolium (Treviranus) Schultz Bipontinus (GEW18075.1); At: 擬南芥Arabidopsis thaliana (Linn.) Heynh. (AT1G13260). 括號中編號為NCBI登錄號Nos. in the brackets are accession numbers in NCBI. AP2,B3: DNA保守結構域 DNA conserved domain; NLS: 核定位信號Nuclear localization signal.

將TmRAV1與萵苣等4個物種的RAV以及擬南芥AP2、ERF和RAV亞家族進行系統發育樹的構建,結果(圖4)顯示:蒲公英TmRAV1與萵苣LsRAV1、朝鮮薊〔Cynaracardunculusvar.scolymus(Linn.) Benth.〕CcRAV1、向日葵(HelianthusannuusLinn.)HaRAV1和除蟲菊〔Tanacetumcinerariifolium(Treviranus) Schultz Bipontinus〕TcRAV1先聚在一起,再與擬南芥RAV亞家族聚為一支。

Tm: 蒲公英Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.; Ls: 萵苣Lactuca sativa Linn. (XP_023746260.1); Cc: 朝鮮薊Cynara cardunculus var. scolymus (Linn.) Benth. (XP_024988000.1); Ha: 向日葵Helianthus annuus Linn. (XP_022020644.1); Tc: 除蟲菊Tanacetum cinerariifolium (Treviranus) Schultz Bipontinus (GEW18075.1). 括號編號為NCBI登錄號Nos. in the brackets are accession numbers in NCBI. 以“AT”開頭的編號均為擬南芥中蛋白質的NCBI登錄號Nos. starting with “AT” are all NCBI accession numbers of proteins in Arabidopsis thaliana (Linn.) Heynh.

2.1.3 蛋白質理化性質及結構分析 蒲公英TmRAV1的分子式為C1678H2654N486O517S10,理論相對分子質量為38 229,理論等電點為pI 9.20。TmRAV1中帶正電荷和負電荷的氨基酸殘基分別為49和40個。TmRAV1的不穩定指數為46.45,為不穩定蛋白;脂肪指數為66.93;總平均親水指數(GRAVY)為-0.692,是親水性蛋白。Plant-mPLoc預測結果顯示TmRAV1是核定位轉錄因子。TmRAV1上沒有跨膜結構域,也沒有信號肽(圖5-A,B)。TmRAV1上有44個磷酸化位點,其中絲氨酸23個,蘇氨酸17個,絡氨酸4個(圖5-C)。二級結構預測結果顯示:TmRAV1中含有27.49%α螺旋、7.31%β折疊、18.71%β轉角和46.49%無規卷曲(圖5-D)。以氨基酸相似性為77.27%的擬南芥AtRAV1(1wid.1.A)為模板分子構建TmRAV1的三級結構,預測結果(圖5-E)顯示:TmRAV1的三級結構也由α螺旋、β折疊、β轉角和無規卷曲構成,與其二級結構預測結果一致。

A: 跨膜結構域預測Prediction of transmembrane domain; B: 信號肽預測Prediction of signal peptide; C: 磷酸化位點預測Prediction of phosphorylation site; D: 二級結構預測Prediction of secondary structure; E: 三級結構預測Prediction of tertiary structure.

2.2 TmRAV1表達分析

蒲公英TmRAV1在不同組織和不同處理葉中的表達模式見圖6。結果顯示:蒲公英不同組織中TmRAV1的相對表達量由高到低依次為葉、花、根,且不同組織間差異達到顯著(P<0.05)水平。在100 μmol·L-1脫落酸處理下,TmRAV1的相對表達量隨著處理時間的延長整體呈先升高后降低的變化趨勢,在處理2～8 h較高。在100 μmol·L-1茉莉酸甲酯處理下,TmRAV1的相對表達量隨著處理時間的延長呈“升高—降低—升高”的變化趨勢,在處理2 和8 h分別顯著高于和低于其他處理時間。在100 μmol·L-1赤霉素處理下,TmRAV1的相對表達量隨著處理時間的延長呈先升高后降低的變化趨勢,在處理4 h達到最高。在100 μmol·L-1水楊酸處理下,TmRAV1的相對表達量隨著處理時間的延長呈先升高后降低的變化趨勢,在處理2 h達到最高。在250 mmol·L-1NaCl處理下,TmRAV1的相對表達量在處理24 h內呈逐漸升高的趨勢。

ABA: 脫落酸Abscisic acid; MeJA: 茉莉酸甲酯Methyl jasmonate; GA: 赤霉素Gibberellin; SA: 水楊酸Salicylic acid. 同一圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Different lowercases in the same graph indicate the significant (P<0.05) differences.

2.3 TmRAV1亞細胞定位分析

蒲公英TmRAV1的亞細胞定位結果(圖7)顯示:對照組35S:GFP細胞膜和細胞核上有綠色熒光,而TmRAV1僅在細胞核中有熒光,說明TmRAV1定位于細胞核中。

B: 明場Bright; DAPI: 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚4′,6-diamidino-2-phenylindole; GFP: 綠色熒光蛋白Green fluorescent protein; M: 疊加視野Merged field.

2.4 TmAREB1啟動子分析及TmRAV1雙熒光素酶分析

蒲公英TmAREB1啟動子含有多個順式作用原件,其中包括2個TGTTG-motif、2個CAACA-motif、1個W-box、1個ABRE、1個G-box和1個TGACG-motif(圖8)。

圖8 蒲公英TmAREB1啟動子分析結果

雙熒光素酶分析結果(圖9)顯示:實驗組(含有35S:TmRAV1-GFP與pGreen0800-proTmAREB1的農桿菌共同注射本氏煙草)的熒光素酶活性是對照組(含有35S:GFP空質粒與pGreen0800-proTmAREB1的農桿菌共同注射本氏煙草)的4.82倍,二者間存在顯著(P<0.05)差異,說明TmRAV1能夠顯著上調TmAREB1的表達。

1: 對照組The control group; 2: 實驗組Experimental group. 圖B中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Different lowercases in the graph B indicate the significant (P<0.05) differences.

2.5 TmRAV1酵母雙雜交分析

將蒲公英的脫落酸信號核心蛋白家族成員TmSnRK2.6與TmRAV1進行酵母雙雜交分析,結果(圖10)顯示:TmRAV1與TmSnRK2.6能夠在酵母體內互作。

DDO: SD/-Trp/-Leu培養基SD/-Trp/-Leu medium; QDO: SD/-Ade/-His/-Trp/-Leu培養基(含X-α-gal)SD/-Ade/-His/-Trp/-Leu medium (containing X-α-gal).

2.6 TmRAV1雙分子熒光互補分析

雙分子熒光互補分析結果(圖11)顯示:將含有TmRAV1-cYFP和TmSnRK2.6-nYFP的農桿菌共同注射本氏煙草葉片時能夠看到黃色熒光蛋白(YFP)熒光信號,但是cYFP和nYFP共同轉化(陰性對照)中沒有熒光信號,說明TmRAV1能夠與TmSnRK2.6在本氏煙草體內形成異源二聚體。

B: 明場Bright; YFP: 黃色熒光蛋白Yellow fluorescent protein; M: 疊加視野Merged field.

3 討論和結論

AP2/ERF超家族成員RAV轉錄因子是植物中特有的一類轉錄因子,主要參與植物的生長發育及其非生物脅迫響應過程,已經在多種植物中有相關報道,如水稻(OryzasativaLinn.)、小黑楊(Populus×xiaoheiT. S. Hwang et Liang)、御谷〔Pennisetumglaucum(Linn.) R. Brown〕、枇杷〔Eriobotryajaponica(Thunb.) Lindl.〕、甘蔗(SaccharumofficinarumLinn.)等[11,22-25]。本研究從蒲公英中克隆得到1個RAV轉錄因子基因TmRAV1,TmRAV1與萵苣LsRAV1氨基酸序列的一致性達到85.88%,屬于RAV亞家族。TmRAV1有44個磷酸化位點,因此可能被SnRK2等蛋白激酶磷酸化[26]。亞細胞定位結果顯示TmRAV1定位于細胞核,這與轉錄因子在細胞核中發揮的作用一致,且與先前的預測結果相同。TmRAV1具有N端AP2結構域和C端B3結構域,與已有研究報道[27]一致,因此TmRAV1可能與AGCCGCC(GCC-box)、CAACA-motif和CACCTG序列結合[17,28]。

RAV參與調節激素、干旱和鹽脅迫反應[29-30]。qRT-PCR結果表明蒲公英葉中的TmRAV1受多種激素和NaCl脅迫誘導。TmRAV1受100 μmol·L-1脫落酸的顯著調控,其相對表達量在處理24 h內整體先升高后降低,在處理2～8 h較高,說明TmRAV1可能參與脫落酸信號通路。在250 mmol·L-1NaCl處理下,TmRAV1的相對表達量在處理24 h內持續升高,說明TmRAV1能夠持續響應NaCl脅迫,后續實驗需要降低NaCl溶液的濃度或者延長處理時間至3～5 d[15,31]。在100 μmol·L-1茉莉酸甲酯處理下,TmRAV1的相對表達量在處理0～8 h先升高后降低并在處理2 h達到峰值,而在處理24 h又再次升高,可能涉及茉莉酸信號負調控作用機制[32-33]。在100 μmol·L-1赤霉素處理下,TmRAV1的相對表達量在處理24 h內也先升高后降低,顯示TmRAV1可能參與赤霉素信號通路。在水稻中水楊酸處理上調了OsRAV1、OsRAV3、OsRAV4、OsRAV7、OsRAV8、OsRAV11、OsRAV12和OsRAV13的表達,下調了OsRAV9、OsRAV14和OsRAV15的表達[19]。本研究中TmRAV1在100 μmol·L-1水楊酸處理下表達模式與100 μmol·L-1赤霉素處理相似。根據上述研究結果,TmRAV1受脫落酸調控最為顯著,因而可能參與脫落酸信號轉導。脫落酸信號是植物抵御環境脅迫的重要組成部分[34],因此,后續研究應聚焦于脫落酸對TmRAV1的調控機制。

脫落酸應答元件結合蛋白(AREB)是脫落酸敏感型轉錄因子。在擬南芥中,AtAREB1能夠介導ABRE依賴性脫落酸信號轉導,從而增強擬南芥的抗旱性[35]。丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)中的SmAREB1能夠響應脫落酸信號,調控酚酸合成[36]。在番茄中過表達SlAREB1能夠提高植株在鹽堿脅迫下的抗氧化能力[37]。因此,AREB轉錄因子參與植物抵抗逆境脅迫,并調控植物次生代謝。在擬南芥中,AtRAV1抑制AtABI5的表達,進而促進種子萌發和幼苗發育[38]。在棉花中過表達AtRAV1/2和AtABI5能夠增強棉花的抗旱能力,并最終提高產量[39]。TmAREB1與已報道的萵苣LsABI5同源性較高,可能存在TmRAV1-TmAREB1調控模式[20]。本研究初步證明TmRAV1促進TmAREB1表達,且proTmAREB1啟動子上含有CAACA-motif(RAV1轉錄因子結合元件),后續將通過酵母單雜交和電泳遷移率實驗驗證TmRAV1是否直接靶向結合CAACA-motif。

SnRK2蛋白激酶是脫落酸信號通路中的關鍵蛋白質家族之一[40]。在擬南芥中,AtSnRK2能夠調控其種子的發育和休眠[41],其中,AtSnRK2.2、AtSnRK2.3和AtSnRK2.6還能夠通過響應脫落酸信號調控氣孔關閉,適應干旱環境[42]。蘋果(MaluspumilaMill.)中的MdSnRK2.4和MdSnRK2.9參與滲透脅迫響應,被激活并進而磷酸化MdHB1和MdACO1,促進乙烯合成,從而調控果實成熟[43]。擬南芥中的AtSnRK2能夠磷酸化AtABI5[41]、AtAREB3[44]和AtRAV1[29]等轉錄因子,參與脫落酸信號通路下游的信號轉導。本研究通過酵母雙雜交和雙分子熒光互補實驗初步驗證了TmRAV1與脫落酸信號途徑核心蛋白家族成員TmSnRK2.6互作,后續將通過Pull-down和CoIP實驗驗證TmRAV1和TmSnRK2.6是否直接互作。

基于上述研究,后期將通過獲得TmRAV1轉基因蒲公英進一步驗證TmRAV1在脫落酸信號途徑中的具體作用機制,為蒲公英優質資源創新提供基礎。