不同管理模式下茶園土壤真菌群落特征及其功能預測

候 寧, 金 強, 劉旭陽, 李先德, 林少穎, 張永勛, 王維奇,①

(1. 福建師范大學 濕潤亞熱帶生態-地理過程教育部重點實驗室, 福建 福州 350117; 2. 中國農業科學院農業經濟與發展研究所, 北京 100081)

茶樹〔Camelliasinensis(Linn.)O. Ktze〕為熱帶及亞熱帶重要的葉用經濟作物[1],與其他經濟作物相比,其代謝旺盛,對土壤養分需求存在差異[2]。茶樹品種‘鐵觀音’(‘Tieguanyin’)主產于福建省,大多分布于閩南一帶,其中以福建安溪的‘鐵觀音’最負盛名[3]。2022年安溪鐵觀音茶文化系統被聯合國糧農組織(FAO)認定為全球重要農業文化遺產(GIAHS),因此,探究符合茶樹特別是‘鐵觀音’生長的養分資源利用的管理模式十分必要。

真菌群落作為指示土壤質量和健康狀況的重要指標,其組成及多樣性對環境變化高度敏感[4-7],不同的管理模式和輪作方式均可能對其產生影響[8-10],充分認識真菌群落特征并預測其功能對土壤的健康和穩定具有重要意義[11-12]。已有研究主要集中于農田管理模式(施肥方式、種植制度和耕作模式等)對經濟作物產量的影響,土壤生態方面的研究也有所涉及。劉蕾等[13]研究發現不同輪作模式下土壤叢枝菌根真菌群落組成主要受土壤pH值的驅動;Culumber等[8]研究發現秸稈覆蓋管理模式促進了有機果園土壤養分含量、微生物生物量和酶活性的提高。不同施肥模式對土壤真菌群落特征影響的相關研究亦有報道。例如:丁建莉等[14]研究發現長期配施有機肥和無機肥能夠有效改善真菌群落結構,降低真菌豐度并增加其多樣性。綜合已有研究發現,關于不同管理模式對土壤微生物群落影響的研究存在不同的結論,有學者認為保護性耕作措施對微生物活性及群落結構均有積極影響[15],也有學者認為常用農業生態系統管理方法會導致土壤養分迅速礦化和流失,并對土壤微生物生物量、酶活性和生物過程產生不利影響[16-17]。因此,管理模式優化的相關研究亟待展開,特別是在茶園這一獨特的生態系統下,研究不同管理模式下茶園土壤真菌群落特征將有助于維持其土壤質量和真菌群落功能多樣性。

本研究在福建安溪鐵觀音茶文化系統全球重要農業文化遺產地,通過安溪茶園田間試驗,借助新一代高通量測序技術對不同管理模式下茶園土壤真菌群落特征及其功能類群進行了研究,并對土壤理化指標與土壤真菌群落的關系進行了分析,以期為生態茶園管理模式的選擇提供科學依據,同時為其他經濟林木的種植管理提供一定參考。

1 研究區概況和研究方法

1.1 研究區概況

研究區位于福建省安溪縣城廂鎮古山村茶葉種植區(東經118°11′、北緯25°13′),該區域屬亞熱帶海洋性季風氣候,年均溫19 ℃～21 ℃,年降水量1 600～1 900 mm,無霜期260 d[18]。供試菜園中種植茶樹品種‘鐵觀音’。 采樣點海拔271 m,土壤類型為紅壤。研究區為有機肥茶樹種植示范點,施用的有機肥為南安市鴻盈天然有機肥公司生產的寶大牌水溶性有機肥〔m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=1.0∶0.3∶0.3〕,施肥量3.75 t·hm-2,在春茶期和夏茶期以溝施的方式進行施肥。

該區域茶園管理模式主要有常規管理(M1)、間作套種管理(M2)和配套現代技術管理(M3)3種。M1模式的茶樹栽種于2004年,行距1.5 m、株距0.5 m,采用人工開溝覆土施肥,自然降水和人工澆水相結合的灌溉模式,以及人工除草、修剪和土壤翻整等常規管理方式;M2模式茶園在M1模式茶園的基礎上于2012年套種龍眼(DimocarpuslonganLour.),龍眼行距5 m、株距3 m,每公頃套種約750株,施肥模式、灌溉模式等管理方式同M1模式;M3模式茶園在M1模式茶園的基礎上于2016年配套了現代滴灌、聲控驅蟲以及釋放捕食螨等技術,采用自然降水和滴灌相結合的灌溉模式。3種管理模式樣地中茶樹株齡均為17 a。

1.2 方法

1.2.1 土壤樣品采集和前處理 根據代表性、典型性和一致性原則,每個管理模式設置3個重復樣方(面積5 m×5 m),共計9個樣方。于2019年5月春茶采收期后進行土壤樣品采集,使用取土器采集茶樹樹冠邊緣垂直下方0～20 cm土層的茶樹根際土壤,采用四分法混合取樣,每個樣方的采樣量約1 kg。將雜質和植物殘體從土壤中剔除,取部分鮮土樣裝入無菌自封袋,置于便攜式保溫箱帶回實驗室,于-20 ℃冰箱保存,用于土壤真菌群落組成及相對豐度的測定;剩余鮮土樣帶回實驗室,自然風干后研磨,過孔徑2 mm篩,常溫保存,用于土壤理化指標測定。

1.2.2 土壤理化指標測定 將超純水和土樣以質量比2.5∶1.0混合,振蕩30 min后靜置,使用Starter 300 pH計(美國Ohaus公司)測定土壤pH值;使用2265FS電導計(美國Spectrum公司)測定土壤電導率;分別采用環刀法和烘干法測定土壤容重和含水量[19];采用Elementar Vario MAX土壤碳氮元素分析儀(德國Elementar公司)測定土壤全碳(TC)和全氮(TN)含量;采用HClO4-H2SO4法[20]消煮,并使用Skalar Analytical SAN++連續流動分析儀(荷蘭Skalar公司)測定土壤全磷(TP)含量。據此計算C/N比(即全碳和全氮含量的比值)、C/P比(即全碳和全磷含量的比值)和N/P比(即全氮和全磷含量的比值)。

1.2.3 DNA提取以及PCR擴增和測序 采用Illumina HiSeq高通量測序技術對土樣中真菌群落的α多樣性及結構進行測定分析[21]。

采用CTAB法[22]提取土樣的基因組DNA,使用質量體積分數2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品的純度和濃度,取適量DNA樣品于離心管中,使用無菌水稀釋至1 ng·μL-1。以稀釋后的基因組DNA為模板,根據選擇的測序區域,使用husion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer(美國New England Biolabs公司)和高效高保真酶(美國New England Biolabs公司)進行PCR,擴增引物為ITS5-1737F(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)以及ITS2-2043R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)。擴增體系總體積30 μL,包括2×Phusion Master Mix 15 μL,2 μmol·L-1Prime 3 μL,1 ng·μL-1gDNA 10 μL,超純水2 μL。擴增程序:98 ℃變性10 s、50 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s,30個循環;72 ℃延伸5 min。

根據PCR產物濃度進行等量混樣,充分混勻后使用質量體積分數2%瓊脂糖凝膠電泳純化PCR產物,切割目的條帶,使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒〔生工生物工程(上海)股份有限公司〕回收[23]。使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample paration Kit建庫試劑盒〔生工生物工程(上海)股份有限公司〕構建DNA文庫,進而通過Qubit和Q-PCR法[24]定量,檢測合格后使用Miseq PE300/NovaSeq PE250平臺(美國Illumina公司)測序。

1.3 數據處理和統計分析

使用Microsoft EXCEL 2010軟件計算原始數據的平均值及標準差。使用IBM SPSS Statistics 22軟件進行LSD多重比較和Pearson相關性分析,其中Pearson相關性分析選取真菌群落中相對豐度前30的屬[25]進行分析。使用Origin 2021軟件進行多尺度的相對豐度分析以及α多樣性(包括Richness指數、Shannon指數、Simpson指數、Chao1指數和ACE指數)分析,并使用軟件中的主成分分析(principal component analysis,PCA)插件進行β多樣性分析。使用Canoco 5.0軟件對真菌門和屬水平的相對豐度[25]與土壤理化指標進行典范對應分析(canonical correlation analysis, CCA)。使用FUNGuild微生態工具對土壤真菌的功能類群進行環境功能預測。

2 結果和分析

2.1 不同管理模式下茶園土壤理化指標的比較

結果(表1)顯示:常規管理(M1)、間作套種管理(M2)和配套現代技術管理(M3)模式下茶園多數土壤理化指標存在顯著(P<0.05)差異。M1模式下土壤pH值、容重、C/N比、C/P比和N/P比總體高于M2和M3模式,其中,土壤pH值與M2和M3模式差異顯著,且M2模式顯著高于M3模式,而C/P比和N/P比僅與M2模式差異顯著。M2模式下土壤電導率、含水量以及全碳、全氮和全磷含量高于M1和M3模式,其中,土壤電導率與M1模式差異顯著,含水量與M3模式差異顯著,全磷含量與M1和M3模式差異顯著。說明不同管理模式下茶園土壤理化指標有明顯差異。

表1 不同管理模式下茶園土壤理化特征

2.2 不同管理模式下茶園土壤真菌群落多樣性分析

2.2.1 土壤真菌群落α多樣性分析 結果(表2)顯示:常規管理(M1)、間作套種管理(M2)和配套現代技術管理(M3)模式下茶園土壤真菌群落的Richness指數、Shannon指數、Simpson指數、Chao1指數和ACE指數均無顯著差異。M1模式下的Richness指數、Chao1指數和ACE指數高于M2和M3模式;Shannon指數和Simpson指數與M3模式接近,但高于M2模式?？傮w上看,M1模式下茶園土壤真菌群落的多樣性較高。

表2 不同管理模式下茶園土壤真菌群落α多樣性分析1)

2.2.2 土壤真菌群落β多樣性分析 主成分分析結果(圖1)顯示:M1模式的重復樣本在圖中分布在不同象限,且距離較遠;M2和M3模式的重復樣本在圖中各自分布同一象限,且距離均較近。說明M1模式的重復樣本間土壤真菌群落組成相似性較低,而M2和M3模式的重復樣本間土壤真菌群落組成相似性較高。

: 常規管理Conventional management; : 間作套種管理Intercropping management; : 配套現代技術管理模式Modern technology supporting management. 圖中相同圖標代表同一模式的重復樣本,括號內百分數為該主成分的貢獻率 The same icons represent replicate samples of the same mode, and the percentages in brackets represent contribution rate of the principal component.

2.3 不同管理模式下茶園土壤真菌群落組成分析

2.3.1 門水平相對豐度及差異分析 結果(表3)顯示:常規管理(M1)、間作套種管理(M2)和配套現代技術管理(M3)模式下茶園土壤真菌門存在差異。M1和M3模式下子囊菌門(Ascomycota)的相對豐度均最高,分別為36.68%和61.49%;其次是擔子菌門(Basidiomycota),相對豐度分別為18.42%和16.46%。M2模式下被孢霉門(Mortierellomycota)的相對豐度最高(59.30%),其次是子囊菌門(11.28%)?？傮w上看,不同管理模式下子囊菌門、被孢霉門和擔子菌門較為豐富,且M3模式下子囊菌門的相對豐度明顯高于M1和M2模式。

表3 不同管理模式下茶園土壤真菌門的相對豐度

2.3.2 屬水平相對豐度及差異分析 結果(表4)顯示:M1、M2和M3模式下茶園土壤真菌屬存在差異。M1模式下被孢霉屬(MortierellaCoem.)的相對豐度最高(10.56%);其次是原隱球菌屬(SaitozymaX. Z. Liu, F. Y. Bai, M. Groenew. et Boekhout)和黃絲曲霉屬(TalaromycesC. R. Benj.),相對豐度分別為8.74%和8.28%。M2模式下被孢霉屬的相對豐度也最高(11.34%);其次是原隱球菌屬和鐮刀菌屬(FusariumLink ex Fr．),相對豐度分別為1.76%和1.06%。M3模式下毛殼菌屬(ChaetomiumKunze)的相對豐度最高(20.86%);其次是原隱球菌屬和青霉屬(PenicilliumLink),相對豐度分別為15.06%和10.59%?？傮w上看,M3模式下毛殼菌屬、原隱球菌屬和青霉屬的相對豐度明顯高于M1和M2模式。

表4 不同管理模式下茶園土壤真菌屬的相對豐度

2.4 茶園土壤真菌群落相對豐度與理化指標的關系

2.4.1 Pearson相關性分析 茶園土壤真菌主要屬的相對豐度與土壤理化指標的相關性分析見表5。結果顯示:土壤容重與蕉孢殼屬(DiatrypeFr.)和綠僵菌屬(MetarhiziumSorokīn)的相對豐度呈顯著(P<0.05)負相關;土壤全氮含量與木霉菌屬(TrichodermaPers.)的相對豐度呈顯著負相關,與腐質霉屬(HumicolaTraaen)的相對豐度呈顯著正相關。

表5 茶園土壤真菌主要屬的相對豐度與土壤理化指標的相關性分析

2.4.2 典范對應分析(CCA) 茶園土壤真菌群落門、屬的相對豐度與土壤理化指標的CCA排序圖見圖2。結果顯示:從門水平上看,土壤C/N比、全磷含量、含水量和容重是影響茶園土壤真菌群落的主要因子,其中,C/N比主要影響子囊菌門和擔子菌門的相對豐度,且均呈正相關;全磷含量主要影響子囊菌門和擔子菌門的相對豐度,且均呈負相關;含水量主要影響被孢霉門和羅茲菌門(Rozellomycota)以及子囊菌門和擔子菌門的相對豐度,且與前二者均呈正相關,與后二者均呈負相關;容重主要影響子囊菌門和擔子菌門的相對豐度,且均呈正相關。從屬水平上看,土壤C/P比、N/P比和pH值是影響茶園土壤真菌群落的主要因子,其中,C/P比和N/P比主要影響unidentified Glomeromycota和原隱球菌屬的相對豐度,且與前者均呈正相關,與后者均呈負相關;pH值主要影響木霉菌屬、原隱球菌屬和鐮刀菌屬的相對豐度,且與前二者均呈正相關,與后者呈負相關。

pH: pH值pH value; BD: 容重Bulk density; EC: 電導率Electric conductivity; WC: 含水量Water content; TC: 全碳含量Total carbon content; TN: 全氮含量Total nitrogen content; TP: 全磷含量Total phosphorus content; C/N: C/N比C/N ratio; C/P: C/P比C/P ratio; N/P: N/P比N/P ratio. Asc: 子囊菌門的相對豐度Relative abundance of Ascomycota. Mor: 被孢霉門的相對豐度Relative abundance of Mortierellomycota; Bas: 擔子菌門的相對豐度Relative abundance of Basidiomycota; Glo: 球囊菌門的相對豐度Relative abundance of Glomeromycota; Muc: 毛霉門的相對豐度Relative abundance of Mucoromycota; Chy: 壺菌門的相對豐度Relative abundance of Chytridiomycota; Ent: 蟲霉門的相對豐度Relative abundance of Entomophthoromycota; Roz: 羅茲菌門的相對豐度Relative abundance of Rozellomycota. Mort: 被孢霉屬的相對豐度Relative abundance of Mortierella Coem.; Cha: 毛殼菌屬的相對豐度Relative abundance of Chaetomium Kunze; Sai: 原隱球菌屬的相對豐度Relative abundance of Saitozyma X. Z. Liu, F. Y. Bai, M. Groenew. et Boekhout; Tal: 黃絲曲霉屬的相對豐度Relative abundance of Talaromyces C. R. Benj.; Pen: 青霉屬的相對豐度Relative abundance of Penicillium Link; Gem: 雙子擔子菌屬的相對豐度Relative abundance of Geminibasidium H. D. T. Nguyen, N. L. Nick. et Seifert; UGlo: Unidentified Glomeromycota的相對豐度Relative abundance of unidentified Glomeromycota; Tri: 木霉菌屬的相對豐度Relative abundance of Trichoderma Pers.; Fus: 鐮刀菌屬的相對豐度Relative abundance of Fusarium Link ex Fr．; UMuc: Unidentified Mucoromycota的相對豐度Relative abundance of unidentified Mucoromycota. Oth: 其他門(屬)的相對豐度Relative abundance of other phyla (genera).

2.5 不同管理模式下茶園土壤真菌群落FUNGuild功能預測

不同管理模式下茶園土壤真菌群落FUNGuild功能預測見表6。結果顯示:除未指定功能真菌外,常規管理(M1)模式下未定義腐生真菌較多,相對豐度為41.07%;其次是寄生真菌-未定義腐生真菌,相對豐度為8.75%;其余功能類群真菌均較少,相對豐度均低于1%。除未指定功能真菌外,間作套種管理(M2)模式下未定義腐生真菌較多,相對豐度為14.11%;其次是寄生真菌-未定義腐生真菌和植物病原-土壤腐生-木腐生真菌,相對豐度分別為1.77%和1.06%;其余功能類群真菌均較少,相對豐度均低于1%。配套現代技術管理(M3)模式下未定義腐生真菌最多,相對豐度為32.40%;其次是糞腐生-未定義腐生-木腐生、寄生真菌-未定義腐生、植物病原-土壤腐生-木腐生和植物病原真菌(未指定功能真菌除外),相對豐度分別為20.86%、15.08%、2.35%和1.18%;其余類群真菌均較少,相對豐度均低于1%?？傮w上看,未定義腐生真菌在3種模式下均較多;與M1和M2模式相比,M3模式下糞腐生-未定義腐生-木腐生和寄生真菌-未定義腐生真菌呈現明顯富集現象。

表6 不同管理模式下茶園土壤真菌群落FUNGuild功能預測

3 討 論

3.1 不同管理模式對茶園土壤真菌群落多樣性及組成的影響

本研究中,常規管理(M1)模式下茶園土壤真菌群落Richness指數、Shannon指數、Simpson指數、Chao1指數和ACE指數總體高于間作套種管理(M2)和配套現代技術管理(M3)模式,土壤真菌群落組成相似性低于M2和M3模式,但3種模式間的α多樣性指數均無顯著差異,多樣性較為相似,主要是由于3種模式所處自然環境和試驗期氣候條件較為相似。在門水平上,總體來看不同管理模式下茶園土壤中子囊菌門、被孢霉門及擔子菌門的相對豐度均較高,與喀斯特地貌[26]和云南普洱茶園[27]土壤真菌的研究結果相似,可能是因為以上菌門具有較強的環境適應性。從這3種主要菌門的相對豐度來看,3種茶園管理模式存在一定差異,子囊菌門這類腐殖真菌的相對豐度在M3(61.49%)模式下要明顯高于M1(36.68%)和M2(11.28%)模式,這可能是由于子囊菌門作為土壤有機質的主要分解者[28],對環境條件的變化具備較強的適應性和菌群競爭能力[29],同時M3模式下土壤中養分(碳、氮、磷)含量居中,也為子囊菌門提供了適宜的生長環境,從而增加了其相對豐度。擔子菌門在3種管理模式下均有分布,這與其能夠實現遠距離傳播并優化原有的土壤微生物生存環境有關[30]。此外,在屬水平上,M3模式下毛殼菌屬的相對豐度明顯高于M1和M2模式,且M3模式下動物病原真菌的相對豐度較低,這主要是因為毛殼菌屬作為土壤有益菌,能夠抵抗土壤及土壤動物中的病原體,并產生木聚糖酶和纖維素分解酶等多種生物活性物質[31]。

3.2 不同管理模式下土壤理化特征對土壤真菌群落的影響

不同真菌群落對土壤理化指標響應程度存在差異[32],且不同土壤理化指標對土壤真菌群落的影響不同,如pH值影響真菌群落的生物量、活性和組成[33];容重影響茶園土壤通氣性和孔隙度、根系穿透阻力以及根系的生長和發育狀況[32],并間接通過上述因子影響真菌活性。典范對應分析(CCA)結果顯示:從門水平上看,土壤C/N比、全磷含量、含水量和容重是影響茶園土壤真菌群落門水平的主要因子,其中,C/N比與子囊菌門和擔子菌門的相對豐度均呈正相關,說明這2種菌門更適應較高碳富集和較低氮養分供應的環境[34]。從屬水平上看,土壤C/P比、N/P比和pH值是影響茶園土壤真菌群落屬水平的主要因子,其中,pH值與木霉菌屬和原隱球菌屬的相對豐度均呈正相關,與鐮刀菌屬的相對豐度呈負相關,這可能與鐮刀菌屬真菌更適應茶園偏酸性的土壤環境有關[35]。本文中,間作套種管理(M2)模式下土壤全氮含量最高、配套現代技術管理(M3)模式下居中、常規管理(M1)模式下最低,而M2模式下木霉菌屬的相對豐度最低、M3模式下居中、M1模式下最高,這可能與土壤全氮含量與木霉菌屬的相對豐度呈顯著負相關有關,也可能是由于木霉菌屬與相對豐度較高的毛殼菌屬相互拮抗有關[36]。

3.3 不同茶園管理模式下土壤真菌功能比較

通常情況下,土壤真菌的豐度越高,其功能型物種越多,從而有利于維系生態系統結構和功能的穩定性[12]。本研究中,與常規管理(M1)和間作套種管理(M2)模式相比,配套現代技術管理(M3)模式下糞腐生-未定義腐生-木腐生和寄生真菌-未定義腐生真菌呈現明顯富集現象,這有利于茶園土壤中有機質分解[32]。Hannula等[37]認為,真菌在保持作物產量的同時能夠增加土壤固碳潛力,可通過提升真菌功能多樣性改善茶園土壤食物網結構及生態系統平衡。van der Heijden等[38]在對樹根外生菌根系統的研究中也印證了這一觀點。外生菌根真菌在好氧環境中相對豐度更高,外生菌根真菌的生長也會進一步提高茶樹固碳釋氧功能[39]。本文中,外生菌根真菌在3種不同模式下均有分布,但相對豐度較低,這可能是3種管理模式下土壤全碳含量低于南方地區土壤碳含量[40]的原因之一。此外,與M1和M2模式相比,M3模式下杜鵑花類菌根的相對豐度較高,該類真菌功能類群有助于茶樹抵御極端氣候[41]?；诖?相對于M1和M2模式,在現代滴灌、聲控驅蟲以及釋放捕食螨等系列技術協同下的M3模式能夠更好地協調保護茶園植被,維持茶園土壤微生物多樣性及有益真菌功能類群的平衡,保障茶園土壤健康和可持續生產。

4 結 論

不同管理模式對茶園土壤真菌群落多樣性及功能類群的影響存在差異,子囊菌門、被孢霉門和擔子菌門是不同管理模式茶園土壤真菌的優勢菌門。M3模式下,子囊菌門的相對豐度明顯高于M1和M2模式,毛殼菌屬、原隱球菌屬和青霉屬的相對豐度明顯高于M1和M2模式,糞腐生-未定義腐生-木腐生和寄生真菌-未定義腐生真菌呈現明顯富集現象。C/N比、全磷含量、含水量和容重是茶園土壤真菌群落門水平的主要影響因子,C/P比、N/P比和pH值是茶園土壤真菌群落屬水平的主要影響因子。綜合分析結果認為,現代滴灌、聲控驅蟲以及釋放捕食螨等系列技術協同下的M3模式有利于維持茶園土壤真菌多樣性及其功能的發揮。