黃百香果莖段組培快繁技術研究

劉潔云,張英俊,牟海飛,吳艷艷,黃偉華,田青蘭,韋毅剛,溫 放

(1 廣西壯族自治區農業科學院,南寧,530007;2 廣西壯族自治區/中國科學院廣西植物研究所,廣西桂林,541006)

百香果Passifloraedulis,又名雞蛋果,是西番蓮科西番蓮屬多年生常綠藤本植物,原產于美洲,現廣泛種植于熱帶亞熱帶地區,在我國廣西、廣東、云南、貴州、福建和臺灣等省(區)均有種植。百香果富含維生素及礦質元素,含有酚類、黃酮苷類、三萜類、生物堿等化學成分,具有神經保護作用、抗氧化、抗菌活性等功效[1-2]。百香果含有近百種香氣成分,有“香料水果”“果汁之王”的美譽,果實多用于果汁、果酒等飲品的加工[3-4]。近年來隨著我國消費者對百香果的認可,鮮食市場和加工市場對百香果的需求量持續攀升,推動百香果種植面積不斷擴大。

當前生產上栽培面積較大的百香果根據果皮顏色可分為紫果類和黃果類。黃果類百香果又名黃百香果、黃果西番蓮,根據果實大小可分為大果型和小果型。小果型黃百香果,俗稱小黃金,單果質量80～120 g,果皮金黃色,果肉可溶性糖含量較高,口感香甜,深受消費者喜愛,在各地的栽培面積逐年擴增,生產上種苗需求量大。黃百香果種苗繁殖方式主要有種子播種、藤蔓扦插、接穗嫁接3種,組培快繁技術尚未大面積應用于生產。組織培養法可對植株進行脫毒,克服無性繁殖率低、繁殖速度慢等缺點,而且組織培養在室內進行,不受季節和氣候等因素制約,具有便于集約化管理和工廠化生產的優點。近年來,已有學者對百香果組織培養進行研究,以黃百香果為研究材料的相對較少。Tran Hieu等[5]研究不同培養基對黃百香果莖段縱向薄細胞層不定芽誘導,以及瓶內嫁接苗繼代增殖、生根的影響;趙家桔等[6]以黃金百香果莖尖為試材,從外植體消毒、初代培養、繼代增殖、生根培養、煉苗移栽等5個方面研究適宜的組織培養方案;黃東梅等[7]以經水培扦插預處理的黃百香果幼嫩莖段作為外植體,篩選滅菌劑處理組合,以及芽誘導和生根培養基中的植物生長調節劑組合;董麗蘭等[8]以紫果西番蓮莖段、葉片、葉柄為外植體,進行愈傷組織誘導與分化,以及不定芽繼代增殖、生根等研究,發現不同百香果種類、培養部位的適宜培養基配方存在差異。本試驗以小果型黃百香果莖段為試材,篩選適宜的外植體消毒方案,以及初代培養、繼代增殖、生根誘導培養基配方,為百香果組培苗繁育提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

本團隊自主選育的小果型黃百香果品系MB供試,在廣西農業科學院生物技術研究所試驗大棚內,將其扦插苗種植于直徑20 cm、高17 cm的無紡布種植袋,用于外植體取材。

1.2 方法

1.2.1 莖段外植體消毒滅菌時間

取苗木莖尖至7～8節位的枝條,剪去葉片,在多菌靈500倍液中浸泡10 min,流水沖洗30 min;將枝條剪成長3～4 cm小段放置于廣口瓶中,在超凈工作臺上用0.1%HgCl2(加吐溫80 1～2滴)浸泡,浸泡時間分別設置2、4、6、8、10 min,處理后用無菌水沖洗4次;切除莖段兩端0.2～0.3 cm,接入MS培養基中,每瓶接種莖段1個,每個處理20瓶,重復3次,培養20 d后統計污染率、褐化死亡率和成活率。

1.2.2 初代芽誘導培養

以MS+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L為基本培養基,分別添加不同濃度的6-芐氨基嘌呤(6-BA)、吲哚丁酸(IBA)、抗壞血酸,采用L16(43)正交試驗設計(見表1)篩選適宜的初代培養基配方。選擇成活率最高的消毒滅菌方案對莖段處理后,將莖段接入芽誘導初代培養基中,每瓶接種莖段1個,每個處理30瓶,重復3次,培養30 d后統計芽誘導率。

表1 黃百香果莖段初代芽誘導培養基篩選L16(43)正交試驗設計

1.2.3 繼代增殖培養

以MS+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L為基本培養基,6-芐氨基嘌呤濃度設置為0.1、0.2、0.3 mg/L,吲哚丁酸濃度設置為0、0.01、0.03、0.05 mg/L,兩種植物生長調節劑組合處理,篩選出增殖倍數最高的培養基配方。在篩選配方中添加谷氨酸,濃度設置為0、10、20、30、40、50 mg/L。將初代培養誘導出的不定芽轉接至繼代增殖培養基中,每瓶接種芽6個,每個處理20瓶,重復3次,培養30 d后統計增殖倍數,觀察繼代苗生長情況。

1.2.4 生根培養及移栽

以1/2 MS+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L為基本培養基,采用吲哚-3-乙酸(IAA)、吲哚丁酸、萘乙酸(NAA)3種植物生長調節劑分別處理,濃度均設置為0、0.2、0.5 mg/L。將繼代苗轉接至生根培養基中,每瓶接種4株,每個處理20瓶,重復3次,培養40 d后觀察根生長情況,統計生根率。將3種植物生長調節劑誘導生根效果較好的生根苗煉苗后,分別移栽至泥炭土∶珍珠巖為4∶1的育苗基質中,每個處理移栽20株,重復3次,統計各生根培養基的生根苗移栽成活率。

1.2.5 培養條件

培養基pH值均為5.8,培養室溫度為(26±2) ℃,光照強度1 500～2 000 lx,光照時長12 h/d。

1.3 數據處理與分析

污染率(%)=污染莖段數/接種莖段數×100,褐化死亡率(%)=褐化死亡莖段數/接種莖段數×100,成活率(%)=100-污染率-褐化死亡率,芽誘導率(%)=出芽莖段數/成活莖段數×100,增殖倍數=新出莖段節數/接種莖段節數,生根率(%)=生根苗數/接種苗數×100,移栽成活率(%)=成活苗數/移栽苗數×100。采用Excel軟件處理數據,采用DPS軟件進行數據方差分析。

2 結果與分析

2.1 滅菌時間對莖段外植體的影響

由表2可知,隨著0.1%HgCl2處理時間延長,莖段外植體的污染率降低,褐化死亡率升高,成活率呈先升高后降低趨勢。HgCl2處理2 min的污染率最高,顯著高于其他處理;處理10 min的污染率最低,但與處理6、8 min差異不顯著。HgCl2處理2 min的褐化死亡率最低,與處理4、6 min差異不顯著;處理10 min的褐化死亡率最高,顯著高于其他處理。HgCl2處理2 min的莖段外植體成活率最低,顯著低于其他處理;處理6 min的成活率最高,為66.67%,顯著高于其他處理?？梢?0.1%HgCl2處理6 min對莖段外植體的滅菌效果最佳。

表2 滅菌時間對黃百香果莖段外植體的影響

2.2 不同培養基配方對莖段芽誘導的影響

由表3和圖1可知,不同培養基配方對黃百香果莖段芽誘導率存在較大影響。各因素的R值排序從高到低依次為A(60.33)>B(13.44)>C(11.10),說明6-芐氨基嘌呤濃度對莖段芽誘導率的影響最大,吲哚丁酸濃度次之,抗壞血酸濃度影響最小。根據不同因素的K值可知,最佳培養基配方為A2B3C3,但該培養基配方未出現在正交設計表中。表3中培養基配方A2B3C4的平均芽誘導率最高,為79.14%?？梢?MS+6-芐氨基嘌呤0.3 mg/L+吲哚丁酸0.1 mg/L+抗壞血酸300 mg/L為本試驗中黃百香果莖段芽誘導的最佳培養基配方。

圖1 黃百香果莖段芽誘導、繼代增殖最佳處理、組培生根苗移栽及不同植物生長調節劑處理生根情況

表3 不同培養基配方對黃百香果莖段芽誘導的影響

2.3 植物生長調節劑對組培苗繼代增殖的影響

由表4和圖1可知,6-芐氨基嘌呤和吲哚丁酸濃度均影響組培苗的繼代增殖倍數。吲哚丁酸相同濃度情況下,增殖倍數隨著6-芐氨基嘌呤濃度的升高呈先升高后降低的趨勢。6-芐氨基嘌呤濃度為0.2 mg/L時,除吲哚丁酸 0 mg/L,其他3個處理的增殖倍數均顯著高于6-芐氨基嘌呤0.1、0.3 mg/L的各處理。其中,6-芐氨基嘌呤0.2 mg/L+吲哚丁酸0.05 mg/L處理的增殖倍數最高,為2.82,顯著高于其他處理。

表4 兩種植物生長調節劑對黃百香果組培苗繼代增殖的影響

2.4 谷氨酸對組培苗繼代增殖的影響

由表5可知,隨著谷氨酸濃度升高,組培苗繼代增殖倍數先升高后降低,組培苗的莖稈變粗壯,葉色由中綠色變為深綠色。谷氨酸20 mg/L時增殖倍數最高,為3.21,顯著高于除谷氨酸30 mg/L的其他處理,組培苗莖稈粗壯,葉片深綠色。谷氨酸50 mg/L時增殖倍數最低,為2.68,部分葉片卷曲?？梢?MS+6-芐氨基嘌呤0.2 mg/L+吲哚丁酸0.05 mg/L+谷氨酸20 mg/L為黃百香果組培苗繼代增殖的最佳培養基。

表5 谷氨酸濃度對黃百香果組培苗繼代增殖的影響

2.5 植物生長調節劑對組培苗生根和移栽成活率的影響

由表6和圖1可知,添加3種植物生長調節劑的組培苗生根率、生根數均顯著高于對照,不同植物生長調節劑對組培苗生根影響不同。吲哚-3-乙酸濃度為0.5、1.0 mg/L時,生根率顯著高于0.2 mg/L處理,1.0 mg/L處理生根率達到100%;吲哚丁酸、萘乙酸濃度為0.5、1.0 mg/L時,生根率顯著高于0.2 mg/L處理,均達到100%。萘乙酸濃度為0.5 mg/L時生根數顯著高于其他處理,為6.29條;吲哚丁酸0.5、1.0 mg/L和萘乙酸1.0 mg/L的生根數差異不顯著,僅次于萘乙酸 0.5 mg/L處理?？梢?萘乙酸0.5 mg/L的生根率達100%,生根條數最多。

表6 不同植物生長調節劑對黃百香果組培苗生根和移栽成活率的影響

不同植物生長調節劑誘導的不定根形態差異較大。吲哚-3-乙酸0.2 mg/L處理的根細長,濃度提高到0.5、1.0 mg/L時根變粗,3個處理的不定根上的須根均較少;吲哚丁酸3個處理的不定根均表現為粗、長,其中0.5 mg/L處理的不定根上有大量須根;萘乙酸3個處理的不定根均表現為粗、短,且不定根上的須根較少。

生根培養基中不同植物生長調節劑影響組培生根苗的移栽成活率。吲哚-3-乙酸1.0 mg/L處理的組培生根苗移栽成活率顯著高于0.5 mg/L處理,為71.67%;吲哚丁酸0.5 mg/L處理的移栽成活率顯著高于其他處理,達到83.33%;萘乙酸兩個處理的移栽成活率差異不顯著?？梢?采用MS+吲哚丁酸 0.5 mg/L的生根培養基有利于黃百香果組培生根苗移栽成活。

3 結論與討論

污染和褐化是植物組織培養過程中的常見問題,特別在外植體消毒滅菌階段較易發生。本試驗中,0.1%HgCl2滅菌劑處理2、4 min時黃百香果莖段外植體的污染率較高,說明處理時間太短,滅菌不徹底。處理8、10 min時褐化死亡率較高,說明滅菌劑對外植體造成了一定傷害。6 min為本試驗的最佳滅菌時間,成活率為66.67%。孫琪等[9]對西番蓮莖段外植體消毒滅菌的處理方法為先70%酒精滅菌30 s,再0.1%HgCl2處理8 min。與本試驗存在差異,這可能與莖段的老嫩、外植體長短等有關。本試驗消毒滅菌處理步驟相對簡單,0.1%HgCl2處理時間較短,可降低HgCl2對莖段外植體的毒害,減少褐化死亡率。

細胞分裂素在植物組織培養中具有促進細胞分裂、分化,誘導形成不定芽的作用。生長素與細胞分裂素配合使用可促進不定芽的萌發和生長[10]?？箟难岵粌H對植物細胞生長與分裂、植物內源激素的生物合成等具有調節作用[11],還具有防止褐化的作用[12]。本試驗細胞分裂素6-芐氨基嘌呤濃度對黃百香果莖段芽誘導影響最大,其次為生長素吲哚丁酸,抗壞血酸濃度對莖段芽誘導存在一定影響。陳春等[13]研究表明,誘導培養基中添加抗壞血酸1.0 g/L能顯著抑制黃枝潤楠外植體的褐化,同時促進外植體萌芽。在黃百香果初代培養基中添加抗壞血酸0.3 g/L,可提高莖段外植體芽誘導率。谷氨酸是一種氮源物質,適宜濃度的谷氨酸不僅能促進植物生長,還能提高植物抗逆性[14]。易靄琴等[15]在鄧恩桉繼代增殖培養基中添加谷氨酸20 mg/L,有利于組培苗生長。本試驗中,黃百香果繼代增殖培養基中添加谷氨酸20 mg/L時增殖倍數最高,且組培苗莖稈粗壯,葉片深綠。谷氨酸50 mg/L處理的黃百香果組培苗部分葉片卷曲,可能由于谷氨酸濃度過高,影響組培苗對培養基中營養物質及水分的吸收。

黃百香果組培生根培養基中添加相同濃度吲哚-3-乙酸的生根率及生根數低于吲哚丁酸、萘乙酸,這可能是由于吲哚-3-乙酸的穩定性差,在培養基中極易被氧化分解,從而影響生根誘導效果。3種植物生長調節劑誘導出的不定根形態存在差異,吲哚-3-乙酸誘導的不定根較長,萘乙酸誘導的不定根粗短,兩種植物生長調節劑誘導的不定根上須根均少。吲哚丁酸0.5 mg/L誘導的不定根粗長,且有大量須根。萘乙酸0.5 mg/L處理的生根數顯著高于其他生根配方,但該配方的組培生根苗的移栽成活率顯著低于吲哚丁酸0.5 mg/L處理。這說明根形態影響黃百香果組培生根苗的移栽成活率,根粗、長且須根多有利于組培生根苗移栽成活。目前,不同生根培養基處理對百香果組培生根苗移栽成活率影響的研究較少。陳漢鑫等[16]研究認為,吲哚丁酸1 mg/L處理對百香果組培苗生根效果最佳,萘乙酸1.5 mg/L處理的組培生根苗移栽后容易爛根、死苗,結果與本試驗相似。?？返萚17]、朱雅靜等[18]均認為同時添加萘乙酸和吲哚丁酸兩種植物生長調節劑有利于紫百香果組培苗生根。本試驗中生根培養基僅添加1種植物生長調節劑,下一步可研究兩種植物生長調節劑聯合使用對黃百香果組培苗生根及移栽的影響。