鈣鎂葉面肥混合噴施減輕“妃子笑”荔枝果實“退糖”現象原因分析

杜婧加,彭俊杰,陳甜甜,稅 賢,周開兵

(海南大學,?？?570100)

荔枝LitchichinensisSonn.屬無患子科、荔枝屬常綠喬木,分布于我國西南部、南部和東南部,其中廣東省、福建省、海南省栽培最盛?！板有Α崩笾κ俏覈笾χ髟云贩N,其果實風味好,但存在果皮“滯綠”現象和果肉“退糖”現象[1-3],即果肉含糖量最高時果皮未全紅,而果皮全紅時果肉含糖量下降,導致其內在和外觀品質不能同時最佳,影響經濟效益。因此,有必要開展“妃子笑”荔枝果實內在和外觀品質發育不同步問題的研究。在果實生長發育期,葉面噴鎂肥和果穗套袋可以克服“妃子笑”荔枝果皮“滯綠”現象。王惠聰等研究荔枝果皮花青苷合成與相關酶關系發現,只有類黃酮糖基轉移酶(UFGT)活性與荔枝果皮花青苷合成關系密切,隨著“妃子笑”果皮中UFGT活性增加,花青苷含量上升;套袋處理抑制UFGT活性同時也抑制花青苷合成,除袋后UFGT活性和花青苷含量都迅速增加;在“妃子笑”荔枝生理落果期結束后,葉面噴施0.3%氯化鎂水溶液同樣可以解決果皮“滯綠”問題,葉面噴施0.3%氯化鈣水溶液提高了果肉食用品質而緩解了果肉“退糖”現象,葉面噴施0.3%氯化鈣和0.3%氯化鎂混合水溶液克服了果肉“退糖”現象[4-7]。根據王展等[5]研究,鎂處理克服“滯綠”問題是通過提高果皮脫落酸(ABA)含量而提高UFGT活性,進而促進花色素苷積累,實現果皮提前轉紅和著色更紅。葉面噴施鈣、鎂混合液克服果肉“退糖”現象的生理生化機理尚不清楚。植物體內約有10%～20%的葡萄糖通過磷酸戊糖途徑(PPP)代謝,而PPP產生多種糖類物質中間產物,對果實生長發育有重要影響,推測“妃子笑”荔枝果肉“退糖”現象可能與果肉呼吸作用有關,PPP為呼吸作用的重要途徑之一。本文就此研究葉面噴施鈣、鎂肥對荔枝果肉PPP的影響,以期探討葉面Ca、Mg混合營養克服果肉“退糖”現象的呼吸作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗在海南省臨高縣金牌農場五隊荔枝園開展,屬于熱帶季風氣候區,年平均氣溫23～24 ℃,年平均日照時數2 175 h,年平均降雨量1 100～1 800 mm,且雨熱同季,土壤肥沃,磚紅壤;選擇生長勢一致,且無任何不良表現的16年生“妃子笑”荔枝20株,4月下旬開始葉面施肥處理。當地“妃子笑”荔枝主要物候期:花期2—3月,生理落果期4月初開始,4月下旬進入果實膨大期,5月中旬進入果實成熟期。

1.2 試驗設計

設置葉面噴施0.3%氯化鈣水溶液、0.3%氯化鎂水溶液、0.3%氯化鈣+0.3%氯化鎂混合水溶液,噴清水為對照等4個處理,分別記為0.3%CaCl2、0.3%MgCl2、0.3%CaCl2+0.3%MgCl2處理、對照(清水),單株小區,重復5次。

1.3 田間處理與采樣方法

生理落果期結束時,即假種皮包滿種子且果蒂出現紅色開始不同處理葉面噴施,具體處理時間為2021年4月18日(花后35 d)、4月25日(花后42 d)和5月2日(花后49 d)上午8:00—9:00。4月18日分別在每株樣樹的樹冠中部外圍4個方向隨機選取大小一致且生長中庸的果實5個作為取樣參照果,分別掛牌標記,此后取樣時根據參照果平均縱橫徑和著色狀態,在樹冠中部外圍4個方向選取相應大小和著色狀態的果實作為樣果。從穩果開始至果皮全紅時為止,即在花后35 d(4月18日)、42 d(4月25日)、49 d(5月2日)、56 d(5月9日)、63 d(5月16日)、70 d(5月23日)取果樣,每次取果實30個,放入液氮罐速凍并帶回實驗室,-80 ℃冰箱保存備用。

1.4 測定指標及方法

果肉可溶性糖含量測定參考Wang等[8]的方法及蒽酮比色法,稱取果肉0.5 g放進研缽,用微波爐殺青30 s,加入90%乙醇5 mL充分研磨,10 000×g離心15 min,吸取上清液再加入90%乙醇5 mL提取1次,合并兩次上清液放入90 ℃水浴鍋中蒸干后,去離子水定容至10 mL,用注射器吸取少量,經0.45 μm濾膜過濾后待測。使用Waters 2695高效液相色譜儀測定糖分含量,配有蒸發光散射檢測器,色譜柱為Boston Green Amino Column(4.6 mm×250 mm,5 μm,120A),流動相為乙腈∶水=8∶2,流速1 mL/min,柱溫35 ℃,進樣量10 μL;標準品用色譜級葡萄糖、果糖和蔗糖(北京壇墨質檢科技有限公司產),流動相用色譜級乙腈(國藥集團化學試劑有限公司產)。

果肉總呼吸速率、過磷酸戊糖(PPP)途徑呼吸速率使用便攜式O2/CO2頂空分析儀(Dansensor Check Point3)測定[9],單位為mL·kg-1·h-1CO2[10];使用10 mmol/L Na3PO4作為PPP途徑專一性抑制劑。先測定果肉樣品總呼吸速率后,加入抑制劑測定PPP途徑的剩余呼吸速率,總呼吸速率減去各途徑剩余呼吸速率得出單一途徑呼吸速率觀測值[11]。

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PDH)提取參考史青純[12]與何亞輝[13]的方法,略作修改,稱取果肉2 g,冰浴條件下加入0.05 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH值6.8)5 mL研磨,4 ℃,8 000 r/min離心20 min,取上清液待用;冷卻后用酶標儀在340 nm 波長下測定吸光度(OD值),通過標準曲線計算樣品酶活性。6-磷酸葡萄糖脫氫酶(6-PGDH)參考Zhang等[14]和宋叢叢[11]的方法制備酶液,用酶標儀在340 nm 波長下測定吸光度(OD值),通過標準曲線計算樣品酶活性。

果肉鈣、鎂含量測定,稱取果肉1 g左右,用去離子水研磨震蕩過夜后,利用NOVAA400P原子吸收分光光度計,采用火焰原子吸收法測定水溶性鈣和水溶性鎂含量[15]。

1.5 數據分析

采用SAS 9.1.3軟件統計分析數據,采用ANOVA作方差分析和DUNCAN法作多重比較分析。

2 結果與分析

2.1 果肉主要可溶性糖含量變化

從圖1可以看出,各處理的果肉果糖均呈現上升趨勢;花后56 d,對照(清水)趨于平緩;花后63～70 d,3個施肥處理均顯著高于對照(清水),其余測定時期,各處理果糖均無顯著性差異?；ê?9～56 d,0.3%MgCl2和0.3%CaCl2+0.3%MgCl2處理的葡萄糖含量顯著高于0.3%CaCl2處理和對照(清水);花后70 d,3個施肥處理達到最高且顯著高于對照(清水)。

圖1 葉面噴施鈣鎂肥后“妃子笑”荔枝果肉果糖和葡萄糖含量變化

從圖2可以看出,花后42 d,0.3%CaCl2+0.3%MgCl2處理的果肉蔗糖顯著高于其余處理;花后56 d,0.3%CaCl2處理顯著低于0.3%CaCl2+0.3%MgCl2處理;花后63 d,0.3%CaCl2、0.3%MgCl2處理顯著低于其余兩個處理?；ê?9 d前,所有處理的果肉可溶性糖均呈上升趨勢;花后56 d及之后,0.3%CaCl2+0.3%MgCl2處理趨于穩定,未出現“退糖”,其余處理呈現不同程度的“退糖”現象。

圖2 葉面噴施鈣鎂肥后“妃子笑”荔枝果肉蔗糖和可溶性糖含量變化

2.2 果肉呼吸速率變化

2.2.1 總呼吸速率

從圖3可以看出,各處理的總呼吸速率動態變化呈單峰曲線,不同處理高峰時間不同,0.3%CaCl2處理達到高峰時間最早?；ê?5 d,各處理間差異不顯著;花后42 d,0.3%MgCl2和0.3%CaCl2處理顯著高于對照(清水)和0.3%CaCl2+0.3%MgCl2處理,前二者間和后二者間分別無顯著性差異;花后49 d,0.3%MgCl2處理顯著高于其他3個處理,后3者無顯著性差異;花后56 d,0.3%CaCl2處理顯著高于0.3%MgCl2和0.3%CaCl2+0.3%MgCl2處理,對照(清水)與其他3個處理差異不顯著;花后63 d,總呼吸速率從高到低依次為0.3%MgCl2處理>對照(清水)>0.3%CaCl2處理>0.3%CaCl2+0.3%MgCl2處理,對照(清水)與0.3%MgCl2和0.3%CaCl2處理差異不顯著;花后70 d,0.3%MgCl2處理顯著高于對照(清水),0.3%CaCl2處理和對照(清水)差異不顯著,0.3%CaCl2+0.3%MgCl2處理顯著低于其他處理。說明0.3%MgCl2處理對總呼吸速率表現一定的促進作用,而0.3%CaCl2+0.3%MgCl2處理呈現一定的抑制作用。

圖3 葉面噴施鈣鎂肥后“妃子笑”荔枝果肉總呼吸速率和磷酸戊糖途徑呼吸速率變化

2.2.2 磷酸戊糖途徑(PPP)呼吸速率

從圖3可以看出,0.3%CaCl2、0.3%CaCl2+0.3%MgCl2處理和對照(清水)PPP呼吸速率均呈現升高后降低再升高的趨勢,0.3%CaCl2和0.3%CaCl2+0.3%MgCl2處理在花后56 d下降,對照(清水)則在花后49 d開始下降;0.3%MgCl2處理呈現上升至平緩的趨勢?；ê?9 d,0.3%CaCl2處理和對照(清水)顯著高于0.3%MgCl2處理和0.3%CaCl2+0.3%MgCl2處理,其兩兩間差異不顯著;花后63 d,0.3%CaCl2處理顯著高于其他處理,0.3%CaCl2+0.3%MgCl2處理顯著低于其他處理,對照(清水)和0.3%MgCl2處理間差異不顯著;花后70 d,0.3%CaCl2處理顯著高于其他處理,0.3%MgCl2和0.3%CaCl2+0.3%MgCl2處理顯著低于對照(清水),且前兩者差異不顯著。綜上所述,0.3%CaCl2處理前期抑制PPP而后期呈現促進作用,0.3%CaCl2+0.3%MgCl2處理和0.3%MgCl2處理則抑制PPP。

2.3 PPP關鍵酶活性變化

2.3.1 6-磷酸葡萄糖脫氫酶(6-PGDH)活性

從圖4可以看出,對照(清水)的6-PGDH活性呈現兩次下降—上升—下降的變化趨勢;0.3%CaCl2處理整體呈現下降—上升的趨勢;0.3%MgCl2處理在前期呈下降趨勢至花后42 d后上升,花后49 d又下降,至花后56 d有上升;0.3%CaCl2+0.3%MgCl2處理下降至花后49 d后趨于平緩,花后70 d略有回升?；ê?2 d,3個施肥處理的6-PGDH活性均顯著低于對照(清水);花后56 d,各處理6-PGDH活性從高到低依次為對照(清水)>0.3%CaCl2>0.3%CaCl2+0.3%MgCl2>0.3%MgCl2,且各處理間差異顯著;花后63 d和70 d,0.3%CaCl2和0.3%MgCl2處理顯著高于其余處理。說明0.3%CaCl2處理前期呈抑制 6-PGDH活性的趨勢,后期呈促進作用;0.3%MgCl2處理前期呈抑制 6-PGDH活性,末期呈促進作用。

圖4 葉面噴施鈣鎂肥后“妃子笑”荔枝果肉6-磷酸葡萄糖脫氫酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性變化

2.3.2 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PDH)活性

從圖4可以看出,對照(清水)和0.3%CaCl2處理的G-6-PDH活性呈現兩次下降—上升趨勢,前期下降至花后49 d后上升;0.3%MgCl2處理呈現下降—上升—下降的趨勢;0.3%CaCl2+0.3%MgCl2處理呈現下降—上升—平緩的趨勢,于花后70 d達到峰值;花后42 d,0.3%CaCl2+0.3%MgCl2處理顯著低于其他處理;花后49 d和56 d,對照(清水)與0.3%CaCl2處理間無顯著性差異,且均顯著高于其余兩個處理,其余兩個處理間均無顯著性差異;花后63 d,0.3%CaCl2處理與對照(清水)無顯著性差異,且顯著高于0.3%CaCl2+0.3%MgCl2處理;花后70 d,0.3%CaCl2處理顯著最高,而0.3%CaCl2+0.3%MgCl2和0.3%MgCl2處理之間無顯著性差異且顯著低于對照(清水)。說明0.3%MgCl2和0.3%CaCl2+0.3%MgCl2處理呈抑制G-6-PDH活性的趨勢;0.3%CaCl2處理在采收期對G-6-PDH活性具有一定的促進作用。

2.4 果肉鈣和鎂含量變化

2.4.1 果肉全鎂和水溶性鎂含量

從圖5可以看出,對照(清水)和0.3%CaCl2處理的果肉全鎂含量呈現兩次下降—上升趨勢,均于花后56 d達到峰值;0.3%MgCl2和0.3%CaCl2+0.3%MgCl2處理在前期下降,至末期上升?；ê?2 d,3個施肥處理的果肉全鎂含量均顯著低于對照(清水),0.3%CaCl2+0.3%MgCl2處理顯著最低,0.3%CaCl2和0.3%MgCl2處理之間無顯著性差異;花后56 d,對照(清水)顯著最高,而0.3%CaCl2+0.3%MgCl2處理顯著最低;花后70 d,0.3%MgCl2處理顯著最高,0.3%CaCl2+0.3%MgCl2處理次之,且顯著高于對照(清水)和0.3%CaCl2處理?？梢?3個施肥處理在前期降低了果肉全鎂含量,0.3%MgCl2和0.3%CaCl2+0.3%MgCl2處理在后期提高果肉全鎂含量。

圖6 葉面噴施鈣鎂肥后“妃子笑”荔枝果肉全鈣和水溶性鈣含量變化

從圖5可以看出,各處理的果肉水溶性鎂含量變化呈“L”形趨勢?；ê?9 d,0.3%CaCl2處理顯著高于其余處理,其余處理間無顯著性差異;花后63 d,除了0.3%MgCl2處理顯著高于對照(清水)外,其他處理與對照(清水)均無顯著性差異;花后70 d,3個施肥處理均顯著高于對照(清水)。說明不同施肥處理花后49 d后呈提高果肉水溶性鎂含量的趨勢。

2.4.2 果肉全鈣和水溶性鈣含量

從圖5可以看出,花后42 d后,所有處理果肉全鈣含量均呈現下降趨勢;花后42 d和49 d,0.3%CaCl2處理顯著最高;花后56 d,0.3%MgCl2處理顯著高于對照(清水),其余處理和對照(清水)之間差異不顯著。說明0.3%CaCl2處理具有提高果肉全鈣含量的趨勢。

所有處理果肉水溶性鈣含量均呈“L”形下降趨勢?；ê?2 d,0.3%CaCl2處理顯著低于其他處理,其他3個施肥處理和對照(清水)之間無顯著性差異;42d后,各處理間均無顯著性差異。說明不同施肥處理基本上對果肉水溶性鈣含量無明顯影響。

3 討論

3.1 對荔枝果肉呼吸途徑的影響及其生理生化機制

觀察荔枝果肉呼吸速率動態變化發現,采前果肉呼吸速率上升,采收期下降,這與“妃子笑”荔枝果肉采前“退糖”現象相符,說明因果肉呼吸速率升高而導致果肉糖分消耗增加,進而產生“退糖”現象?；ê?3 d后,0.3%CaCl2+0.3%MgCl2處理對呼吸速率具有顯著抑制作用,進而降低糖分損耗,從而在一定程度上延緩果肉“退糖”。PPP分為氧化反應過程和非氧化反應過程。PPP的氧化步驟是還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的主要來源,它參與抗氧化劑再生[16]。該途徑生成大量的NADPH+,作為供氫體參與多種代謝反應,是體內利用葡萄糖生成5-磷酸核糖的唯一途徑,而核糖-5-磷酸和NADPH是核酸和脂肪酸等生物分子合成的原材料[17],也是合成DNA、RNA 的前體物質,這些物質對植物細胞分裂生長必不可缺[18]。本試驗結果表明,0.3%CaCl2+0.3%MgCl2處理抑制了PPP呼吸速率,使核糖核酸合成速率降低,進而導致葡萄糖消耗減慢;由于葡萄糖和果糖在異構酶催化下可以相互轉化[19],也會導致果糖消耗減少,從而使“妃子笑”荔枝果肉在一定程度上克服“退糖”現象。

0.3%MgCl2處理在采收期不同程度抑制了PPP呼吸速率,在采收期0.3%MgCl2處理的果肉可溶性糖含量呈現下降趨勢,因此,0.3%MgCl2處理未能緩解“妃子笑”荔枝果肉“退糖”現象。在采收期,0.3%MgCl2處理也對PPP途徑呼吸速率表現為抑制作用,但并未表現出克服“退糖”現象。植物有多條呼吸代謝途徑,其中EMP-TCA循環完全有氧呼吸也是重要途徑。根據吉前華等[20]的研究,鎂能促進果肉EMP-TCA循環、脫羧化作用,有利于作物體內的糖類轉化和磷素的吸收轉化,從而0.3%MgCl2處理能促進EMP-TCA循環,導致果肉總呼吸速率未被抑制,這可能是0.3%MgCl2處理未能緩解“妃子笑”荔枝果肉“退糖”現象的重要原因。因此,只有0.3%CaCl2+0.3%MgCl2處理表現出克服“妃子笑”荔枝果肉“退糖”現象。

3.2 對果肉鈣、鎂含量的影響及其生理生化效應

試驗結果表明,3種施肥處理對果肉水溶性鈣含量影響不明顯,0.3%CaCl2和0.3%MgCl2處理提高了果肉全鈣含量;3種施肥處理均提高了果肉水溶性鎂含量,0.3%MgCl2處理提高全鎂含量。這與周媛[21]的研究報道相同,適量0.3%MgCl2處理不僅能夠促進果肉三羧酸循環中有機酸含量,促進氨基酸積累,提高呼吸速率,進而明顯促進果實成熟;還能夠明顯提高番茄根、葉片和果肉中0.3%MgCl2含量,及葉片中鉀鈣含量,并使果肉0.3%CaCl2含量減少。

鎂元素通過促進光合同化產物運輸和利用來促進果實可溶性糖積累。根據孫青慧[22]、林麗琳[23]的研究,葉片噴施0.3%MgCl2處理后,葉片內光合色素含量提高,光合作用增強,可促進糖類等碳水化合物的積累及運輸,增強碳代謝。碳代謝與光合作用密切相關,葉綠素是植物光合作用的主要參與者,鎂是葉綠素的主要組成成分。林麗琳[23]研究發現,鎂通過影響西瓜的光合系統來影響碳代謝過程,降低碳水化合物含量;而適當增加鎂素用量可提高葉片葉綠素含量,增強光合作用強度,進而促進碳水化合物和可溶性糖的積累。本研究結果表明,0.3%MgCl2和0.3%CaCl2+0.3%MgCl2處理對果肉葡萄糖、果糖含量均呈現促進作用,0.3%MgCl2處理對果肉蔗糖含量表現抑制作用。這與柑桔上的研究結果一致,即施鎂能夠誘導溫州蜜柑果肉蔗糖轉化酶活性增強,促進蔗糖轉化為果糖和葡萄糖,導致果肉蔗糖含量明顯降低[21]。而0.3%CaCl2處理對荔枝果肉果糖、蔗糖含量并未表現促進作用,故在采收期也出現“退糖”現象。這與甜瓜研究結果不一致,可能與果樹品種或噴肥方式不同有關[24]。

本文研究結果表明,0.3%CaCl2處理表現出促進PPP呼吸速率的作用。根據田秀英等的研究,鈣離子通過維持細胞膜結構的完整性,進而抑制果肉呼吸強度及呼吸進程[25],這點與本文研究結果不一致?？赡苡捎趯粑S變型果實,鈣與果實呼吸作用大多呈負相關,鈣處理能夠推遲果實呼吸高峰出現并降低呼吸峰值;而對非呼吸躍變型果實,鈣處理對果實呼吸的抑制作用主要體現在貯藏后期。

對于PPP途徑關鍵酶活性,0.3%CaCl2+0.3%MgCl2和0.3%MgCl2處理對果肉G-6-PDH活性均呈現抑制作用,而對6-PGDH活性并未呈現規律性影響;0.3%CaCl2處理對6-PGDH活性在末期有一定的促進作用,對G-6-PDH無顯著性影響。這與蘇宏[26]的研究結果一致,不同濃度和種類的鈣處理在常溫條件下均顯著提高了G-6-PDH活性,從而顯著提高了PPP呼吸速率。本文結果表明,3個施肥處理對PPP呼吸速率的影響與對G-6-PDH關鍵酶活性的影響趨勢基本一致。這說明呼吸速率主要受G-6-PDH調控,鈣鎂營養通過促進關鍵酶活性,進而影響該途徑呼吸速率。

4 結論

“妃子笑”荔枝葉面噴施0.3%CaCl2+0.3%MgCl2可以克服果肉“退糖”現象,可能由于該處理提高了果肉水溶性鎂含量,抑制了全鈣含量,且在果實采前通過抑制G-6-PDH活性而抑制果肉PPP呼吸速率,表現出PPP和總呼吸速率降低,致使果肉生物合成速率受到抑制,減少果肉糖分呼吸消耗,使果肉糖含量未發生顯著下降。0.3%CaCl2處理在果實采前促進了果肉全鈣含量,進而促進了G-6-PDH關鍵酶活性,促進了PPP呼吸速率,從而未能抑制退糖。0.3%MgCl2處理雖然提高了果肉全鎂含量,對G-6-PDH活性產生了抑制作用,但考慮鎂元素可能通過EMP-TCA循環途徑促進呼吸速率,從而對總呼吸速率無顯著性影響。因此,0.3%CaCl2處理和0.3%MgCl2處理不能減緩果肉“退糖”現象。本文研究結果可為荔枝果實生長發育期葉面噴肥技術改良提供參考,也為荔枝果肉糖代謝理論問題的深入研究奠定了基礎。