盆栽藍莓根際接種內生真菌的效應

李 竹,嵇康軒,原寧欣,王 波

(蘇州大學金螳螂建筑學院,江蘇蘇州,215000)

藍莓為杜鵑花科越桔屬(Vaccinium)果實藍色的小漿果果樹,于20世紀80年代初引入我國進行栽培,目前已形成較大的產業規模[1-2]。藍莓沒有主根,根毛稀少,吸收土壤養分能力較弱。我國大部分栽培地區需要對土壤理化性質進行適當調節,才能滿足藍莓生長需要。如:通過施硫磺來調節土壤pH值,增施生物有機肥等方式[3-5]增強土壤供肥能力。近年來,利用微生物調節土壤環境,促進植物生長的研究越來越多[6-8]。有研究發現,在自然條件下,藍莓根系可以和內生菌結合,進而改善土壤理化性質,促進植株對營養元素的吸收利用[9-12]。若在土壤中人工添加(接種)內生菌也可以促進藍莓生長,則將對藍莓栽培產生深遠影響。由此,筆者從健康藍莓植株根部分離內生真菌,研究其人工添加于土壤對藍莓根系、光合特性和生物量的影響,以期為內生菌在藍莓生產中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試藍莓品種為“燦爛”,由蘇州御湖園農業科技有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株培養與分離 選取生長正常的藍莓根系,用75%乙醇及10%次氯酸鈉進行消毒,后將其剪成0.5 cm的根段,接至PDA培養基中,于27 ℃避光培養2周,待根端長出明顯菌絲后用接種針轉移至新的培養基,反復純化至單一菌落。

1.2.2 菌株分子生物學鑒定 采用CTBA法提取菌株DNA[11],擴增產物送至蘇州鴻迅生物科技有限公司進行測序,將測序結果在NCBI的GenBank數據庫中進行BLAST比對分析。

1.2.3 盆栽藍莓接菌 菌液制備:取新鮮菌塊接種于PD培養液中,培養15 d制備菌懸液。取1 mL稀釋后的菌懸液(孢子數為1×105個/mL),注入新培養液中,25 ℃、200 轉/min搖床培養15 d,待用(孢子數約為8×106個/mL)。

盆栽與接菌:栽培基質為草炭∶松鱗∶珍珠巖=5∶3∶2(體積比),在121 ℃下,經2 h滅菌,待用。試驗盆上口徑25 cm、底徑20 cm、高度17 cm,用75%酒精消毒后風干,每盆裝入滅菌基質0.006 m3(約0.5 kg)。取生長相近的兩年生藍莓苗移栽在盆中(2022年6月25日),一盆一株。將上述制備好的菌劑(菌懸液)均勻澆灌至根部(2022年7月1日),每盆20 mL,15 d后再澆一次(20 mL)。試驗設置不接菌為對照(CK)。單株小區,每處理40次重復。露天盆栽,盆隨機排列,每隔10 d隨機交換位置,并將盆旋轉180°。其他管理同常規[2]。

1.2.4 測定指標與方法 接菌0、15、30、45、60、75和90 d(7月1日起)時進行相關項目測定,每次每處理隨機選3盆(3次生物學重復)。

用便攜式葉綠素儀(SPAD-502,日本)測定SPAD值。每株選中部3～5片成熟葉進行測定,避開葉脈,每片葉在葉脈兩側對稱部位選擇測量6個點。

用便攜式光合作用儀(LI-cor 6400,美國)測定光合特性。在晴朗天氣上午9:00—11:00進行測定,環境的CO2濃度為420 μmol·mol-1,光照強度為1 200 μmol·m-2·s-1。每株選取自上而下第3-5片完全展開葉(3片葉)進行測定,每株測定3次。

用卷尺測量株高,用游標卡尺測量地徑;記錄葉片數和分枝數,每個處理重復3次。

用Epson Perfection V700根系掃描儀掃描測定根系構型。將選取的植株從盆中取出,剪取根部,去除附著在根系上的基質,浸泡在去離子水中,用去離子水輕柔清洗,然后將根系放入掃描儀根盤中,加入去離子水,待其完全舒展后,蓋上藍色背景板進行掃描。掃描圖片用Rhizo Vision Explorer進行分析處理。

用TCC氧化還原法[13]測定根系活力。

用電子天平(梅特勒-ME204,瑞士)稱量植株鮮質量與干質量。

1.2.5 數據分析 采用 SPSS 26.0進行統計分析,用平均值和標準誤表示測定結果,對各項結果進行單因素方差分析,采用鄧肯氏新復極差法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 分離所得內生菌株的鑒定

從藍莓根部分離出11株內生菌,根據預試驗及相關文獻選擇其中兩株進行后續試驗。兩株菌株分別編號為J1和J6。J1的菌落正面青色,背面青色,呈絮狀,輪狀生長,生長速度較快。J6的菌落較為蓬松,表面灰色,背面灰黃色,呈絲狀(見圖1)。

圖1 藍莓健康根部分離菌株J1和J6在PDA培養基上培養的菌落形態

分子生物學鑒定結果表明,J1與GenBank中的Trichodermaasperellum(MT150599.1)的序列覆蓋度達到99%,最大序列相似度達到100%,由此鑒定J1為棘孢木霉(T.asperellum)。J6與GenBank中的Mucorcircinelloides(MH855658.1)的序列覆蓋度達到100%,最大序列相似度達到99.49%,由此鑒定J6為卷枝毛霉(M.circinelloides)。

2.2 接種內生菌對藍莓生長發育的影響

2.2.1 葉片SPAD值 試驗結果看出,接種75 d內各處理的SPAD值均呈增長趨勢,此后基本無變化。接種15～90 d,兩個接種內生菌處理的SPAD值均顯著高于CK,但接種60 d后接種處理與未接種處理的差距逐漸減小(見表1)。這表明,接種內生菌對提升葉片SPAD值有促進作用,且在處理前期作用較明顯,隨著處理時間延長,與CK之間的差距逐漸變小。

表1 不同處理對盆栽“燦爛”藍莓葉片SPAD值的影響

2.2.2 葉片光合特性 接種后各處理同一光合指標隨時間的變化趨勢相似。接種15～90 d,J1和J6處理的凈光合速率均顯著高于CK;J1和J6處理的蒸騰速率大多(J1和J6接種30 d,J6接種90 d除外)顯著高于CK;J1和J6處理的氣孔導度大多(J1接種45 d,J6接種30 d、90 d除外)顯著高于CK;J1和J6處理的胞間二氧化碳濃度大多高于CK(J6接種90 d除外)(見圖2)。相關性分析結果表明,胞間二氧化碳濃度(Ci)分別與凈光合速率(Pn)和氣孔導度(Gs)極顯著相關(見表2)。

表2 盆栽“燦爛”藍莓葉片光合參數相關性

表3 不同處理對盆栽“燦爛”藍莓根系構型的影響

圖2 不同處理對盆栽“燦爛”藍莓葉片光合特性的影響

2.2.3 根系 試驗結果表明,接種0～30 d期間各處理根系構型各指標值均增加,J1處理的根面積、根體積和根尖數增幅最大;J6處理的根長和根直徑增幅最大。接種30～60 d期間,各處理根系構型各指標值均下降,根直徑下降幅度較小,其余4個指標下降幅度較大,且CK的各指標下降幅度均大于J1和J6處理。表明,此時期植物受高溫脅迫程度較高。植物根系活力在接種30～60 d期間也發生較大變化,先上升后下降,表明短期高溫對植物根活力有一定促進作用,而長期高溫脅迫抑制了根系活力。接種90 d時,J1的根面積、根體積以及J6的根體積則繼續下降;各處理的根長、根直徑和根尖數,CK的根面積和根體積,以及J6的根面積有顯著恢復,但部分指標尚未恢復至接種0 d時水平,尤其是CK的根尖數、根體積及根長仍顯著低于接種0 d。

接種后,各處理的根系活力變化趨勢相似;J1和J6處理的根系活力大多(J1接種45 d除外)高于CK,接種45～90 d根系活力呈現為J6>J1>CK;接種90 d時J6和J1處理的根系活力達到最大值,分別比CK高42.06%和19.03%(見圖3)。

圖3 不同處理對盆栽“燦爛”藍莓根系活力的影響

2.2.4 地上部形態指標 試驗結果表明,隨著接種時間的增加,各處理地上部生長指標均呈增加趨勢。接種15～90 d,不同處理的株高呈現為J1>J6>CK。各處理的分枝數主要集中在接種后0～15 d和60～90 d這兩個時期增加,與藍莓生長期吻合;接種15 d時的分枝數呈現為J1>J6>CK,接種30～90 d的分枝數呈現為J6>J1>CK。接種15～90 d,J6和J1的葉片數和地徑均顯著大于CK,且多數情況為J6>J1(僅接種30 d時葉片數為J1>J6)(見圖4)。

2.2.5 生物量 隨著接種時間的增加,各處理的全株干質量整體呈上升趨勢,接種內生菌促進了干物質的積累。接種15～90 d,J1和J6處理的葉片干質量顯著高于CK;J1和J6處理的莖干質量均顯著高于CK,且J1處理顯著高于J6處理;J1和J6處理的根干質量顯著高于CK(見表4)。

表4 不同處理對盆栽“燦爛”藍莓生物量(干質量)的影響 g

3 討論

3.1 接種內生菌對藍莓光合能力的影響

在一般情況下,利用葉片SPAD值能夠預測其葉綠素含量[14-15],而葉綠素含量是反映植物光合能力的一個重要指標,通常葉綠素含量越高,植物光合作用能力越強[16],因此,可以根據SPAD值判斷植物光合狀態和指導氮肥施用[17-19]。本試驗發現,接種2種內生菌后一段時期(45 d內)葉片SPAD值顯著增加,說明植物光合性能得到了增強[20],而在試驗后期各處理葉片趨于成熟,SPAD值差異不大。這與朱江華[21]、歐靜等[22]的研究結果類似。

本試驗中,接種30～45 d期間凈光合速率明顯下降。分析其原因,主要是此期蘇州地區持續高溫(最高氣溫達40 ℃)且光照較強,地表溫度超過40 ℃,對藍莓產生脅迫,部分新葉出現灼傷現象,導致葉片氣孔關閉,氣孔導度下降,限制了外界二氧化碳進入,胞間二氧化碳濃度大幅下降,進而導致藍莓凈光合速率顯著降低[23]。這與張瑞朋等[24]和吳思政等[25]的研究結果類似。本試驗結果表明,接種內生菌,增強了藍莓植物對強光和高溫的適應能力,提高了植物的凈光合速率。

3.2 接種內生菌對藍莓根系生長的影響

根尖是根系最活躍的部分,主要功能是吸收水分及無機鹽。根尖數越多,根系對水分及養分的吸收能力越強。同時,根尖數量的增加也為根系伸長提供可能,進而增加根系總體積與總面積。高溫脅迫會對藍莓生理過程產生影響,具體脅迫程度和藍莓品種、溫度有關[26]。在本試驗中,接種60 d時外界溫度高達40 ℃,已經接近藍莓半致死溫度,根系生長受到抑制,根尖受到高溫破壞,數量減少,生長點減少,根長縮短,根面積和體積減小;對比CK,接種內生菌后,根長、根面積、根體積和根尖數下降幅度較小。這說明接種內生菌在一定程度上提高了植物抗性,緩解了高溫對植物的損害[27]。有研究表明,植物根系直徑和根系活力之間可能存在負相關,即直徑越小,活性越大[28]。本試驗未發現類似現象,可能是高溫脅迫導致該現象不明顯。

3.3 接種內生菌對藍莓形態指標及生物量的影響

植物株高與植物生長量往往存在正相關關系,通過株高能較好地觀測植物早期生長狀態。趙磊等[29]將毛霉屬真菌接種至藍莓,發現其顯著提高了藍莓株高,本試驗接種J1和 J6得到了類似結果。地徑是描述植物生長狀態的重要指標。本試驗結果表明,接種J1和J6均能促進地徑增長,與黃秋良等[30]的研究結果類似。植物分枝數和葉片數是衡量生物量累積的重要指標,也是指示植物光合速率的重要依據。一般情況下,分枝數與植物冠幅有關,分枝數越多,越有利于葉片生長,越有利于植物對陽光的利用。本試驗結果表明,接種內生菌促進了藍莓植株分枝數和葉片數的增加。在劉江東[2]的研究中,不同菌株對不同品種藍莓的促進作用不同,同一菌株對株高、地徑等指標的作用效果也不同。本試驗中有類似情況:J1對株高促進作用較好,J6處理對地徑、分枝數和葉片數的促進作用更明顯。這可能是由菌種差異引起的。不同內生菌的功能、特性不同,對植物作用效果也不同,進而影響植物對資源分配的策略。株高能夠表征植物垂直方向上利用光照的能力,植物傾向于垂直生長以獲取更多的光照資源[31-33]。地徑與植物固定支撐、水分吸收有關[34]。J1處理對株高促進作用更好,意味著藍莓能夠獲取到更多光照資源,光合速率也更高。J6處理對地徑促進作用更明顯,對株高促進作用較弱,光合速率低于J1處理,植物需要更多的葉片吸收利用光照,因此,J6處理的植物分枝數和葉片數增量較大。接種兩種內生菌對植物鮮質量和干質量積累具有促進作用,這與胡琦鵬等[35-37]的研究結果一致。由于J1和J6處理的最終分枝數和地徑較為接近,同時葉片數占生物量比重較小,生物量大小更多取決于株高,因而J1處理在促進生物量積累方面表現更好。

4 結論

從健康藍莓植株根部分離出11株內生菌。有兩株通過形態學和分子生物學分析分別鑒定為棘孢木霉(Trichodermaasperellum)和卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)。將這兩株內生菌的菌懸液澆灌至盆栽藍莓根際事先滅菌的基質中,對植物形態指標、光合速率、根系生長、生物量均有促進作用。在實際栽培中,可以通過添加內生菌的方式培育更加優良的藍莓幼苗。