砧木對中華獼猴桃“建香”果實品質的影響

張 鴻,李秀麗,李 毅,陳志偉,樂有章,翟敬華,趙志遠,戢小梅

(1 武漢市農業科學院林業果樹研究所,武漢,430075;2 武漢大學生命科學學院,武漢,430075)

嫁接是獼猴桃生產過程中最主要的擴繁方式,砧木與接穗之間的互作直接影響成活率、抗逆性、產量和果實品質等[1-2]。有研究發現,砧穗互作對礦質營養、內源激素、信號物質的運輸均會產生影響[3],種間嫁接還可能導致DNA甲基化并遺傳給下一代[4-5]。我國獼猴桃生產中普遍使用中華獼猴桃Actinidiachinensis和美味獼猴桃A.deliciosa的實生苗作為砧木,其肉質根存在不抗旱不耐澇的問題。近年國內越來越重視獼猴桃砧木篩選及砧穗互作等相關研究。當前我國很多獼猴桃產區開始使用對萼獼猴桃A.valvata作為砧木。劉楊等[6]發現,與美味獼猴桃實生砧處理相比,對萼獼猴桃實生砧“紅陽”獼猴桃的果實更大,可溶性固形物含量更高,固酸比更大,口感更好。對萼獼猴桃根系發達,抗旱、耐澇、抗病能力更強,然而,對萼獼猴桃作為砧木會存在嫁接親和性的問題。針對基砧和接穗親和性的問題,可通過采用中間砧的辦法進行解決[7]。有研究表明,采用適宜的中間砧,能提高甜桔柚的生長勢、單果質量及果實總糖含量[8],能提高葡萄(Vitisvinifera)花芽分化能力及提升果實品質[9]。

獼猴桃果實香氣物質中主要的醇類、醛類物質為(E)-2-己烯醛、(E)-2-己烯醇、己醇等[10]?！澳毤t”“金獼”“徐香”“海沃德”“陽光金果”獼猴桃果實香氣物質中醛類和酚類物質含量較高,酮類物質較少[11]。李盼盼等[12]發現,“布魯諾“(Bruno)獼猴桃果實香氣物質主要為酯類,并且隨著貯藏時間延長,物質種類和含量也會逐漸增加。不同獼猴桃品種之間以及同一品種果實不同發育時期香氣組分均不同[13-14]。Cozzolino等[15]對4種黃肉獼猴桃和兩種綠肉獼猴桃果實揮發性物質進行了檢測,發現2-戊基呋喃是區分黃肉和綠肉的關鍵物質。呂正鑫等[16]利用頂空固相微萃取與氣質聯用技術發現,“萇楚2號”“贛獼6號”“贛紅7號”“麻毛10號”“麻毛13號”獼猴桃果實香氣物質分別有19、30、18、21和26種。在“紅陽“獼猴桃果實發育階段和成熟階段,典型風味存在差異,揮發物成分由發育階段的醛類、醇類、酮類向成熟階段的酯類轉變[17]。另外,采收時期[18]、貯藏條件[19]均會影響果實代謝物數量以及種類?？梢?目前針對獼猴桃果實香氣的研究主要從外源物質、貯藏過程以及品種等方面展開,不同砧木嫁接條件下獼猴桃果實香氣物質變化的研究相對較少。在葡萄[20-21]、櫻桃(Prunuspseudocerasus)[22]、西瓜(Citrulluslanatus)[23]等作物上的研究表明,砧木能顯著影響果實香氣代謝物種類和含量。

湖北省獼猴桃生產中所用砧木多為美味獼猴桃實生苗,尚未實現優良砧穗組合的固定搭配。本研究比較了不同砧木“建香”中華獼猴桃A.chinensis‘Jianxiang’的產量、品質、香氣組分等,以期為篩選適宜“建香”的優良砧木提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

接穗品種為“建香”中華獼猴桃,采自湖北省恩施州建始縣金塘村。砧木類型有3種,均為兩年生苗木,分別為“金魁”美味獼猴桃實生苗(以下簡稱美味砧)、對萼獼猴桃實生苗(以下簡稱對萼砧)、對萼獼猴桃實生砧“米良1號”美味獼猴桃嫁接苗(以下簡稱中間砧)。2018年初進行嫁接。果實采樣時間為2020年8月。標準品為氯化鈉(分析純,購自國藥)和正己烷(色譜純,購自Merck)。

1.2 試驗方法

果樣采集及處理:各砧穗組合隨機選取3株,在達到果實采收標準(可溶性固形物>7.5%)后,每株樹摘取20個果實,每項檢測指標隨機選取2個果實,每個果實為1個重復,共計6個重復,室溫放置至軟熟。

果實品質檢測:果實軟熟后檢測單果質量、橫徑、縱徑、側徑、可溶性固形物、干物質、可滴定酸、可溶性總糖、維生素C含量?？扇苄怨绦挝锖坑檬殖质教嵌扔嫓y定。干物質量為果實烘至恒重后的質量,干物質量/鮮質量的比值為干物質含量?？傻味ㄋ釡y定采用滴定法,NaOH濃度為0.01 mol/L?？扇苄钥偺遣捎幂焱y定。維生素C含量測定參考Kampfenkel等[24]的方法。以上檢測均設定6個重復。

代謝組分析:果實成熟后去掉外果皮和種子,取外層果肉保存于超低溫冰箱中。樣品從-80 ℃冰箱取出用液氮研磨成粉末,取1 g樣品于含有飽和NaCl溶液和10 μL內標溶液(氚代對二甲苯)的20 mL頂空瓶中,用TFE硅膠隔墊密封后進行固相微萃取。在60 ℃溫水中預熱10 min,預熱完成后將一根65 μm的二乙烯基苯/碳纖維/聚二甲基硅氧烷纖維萃取頭在60 ℃的樣品上部空間暴露20 min。取樣后用氣相色譜儀(安捷倫7890B-7000D)對揮發性有機物進行定性和定量分析。有機物在進樣口處以不分流的模式在250 ℃條件下從纖維涂層中解吸5 min。GC-MS具體條件如下:色譜柱為DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm),載氣為氦氣,流速1.0 mL/min,進樣溫度250 ℃,檢測器溫度保持在280 ℃。程序升溫條件:初始溫度40 ℃保持5 min,以6 ℃/min的速度升到280 ℃,保持5 min。質譜在70 ev電子沖擊(EI)電離模式下記錄。傳輸線溫度280 ℃,離子源溫度230 ℃,四級桿溫度150 ℃。質譜掃描范圍為30～350 amu,掃描間隔1 s。用MassHunter軟件對GC-MS的原始數據進行峰提取,獲得特征峰的質荷比、保留時間、峰面積等信息,基于MWGC數據庫對樣本代謝物進行定性和定量分析。

1.3 數據分析

對代謝物數據進行歸一化處理后用MetaboAnalyst 4.0進行主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)和變量投影重要性(Variable Importance in Projection,VIP)分析。

2 結果與分析

2.1 砧木對果實理化指標的影響

在單果質量、橫徑、縱徑和側徑方面,對萼砧及中間砧顯著高于美味砧,其單果質量分別增加57.37%和39.37%,對萼砧及中間砧之間無顯著性差異(見圖1)?？梢?對萼砧或者中間砧能較大程度地提高“建香”果實大小。

圖1 砧木對“建香”中華獼猴桃的單果質量等理化指標的影響

對萼砧的果實干物質含量和可溶性固形物含量最高,分別為18.07%和20.2%。中間砧的果實可溶性總糖、維生素C含量最高,可滴定酸含量最低,對萼砧的果實次之(見圖1)?？梢?中間砧能在一定程度上提高“建香”果實品質。

2.2 砧木對果實揮發性代謝物的影響

3種砧木的“建香”果實共檢測到105種揮發性代謝物,包括萜類、醇類、芳烴類、酚類、醛類、酮類、烷烴類、烯烴類、酯類、雜環類化合物以及其他類型化合物(圖2)。對香氣貢獻較大的代謝物有4-蒈烯、1-乙烯基-3,5-二甲基-苯、苯甲酸甲酯、己醇、醋酸酐、丁酸乙酯、己酸乙酯、丁酸甲酯等,以酯類物質居多。

圖2 “建香”中華獼猴桃果實香氣物質種類構成

從化合物種類來看,“建香”嫁接在3種砧木上都能檢測出105種代謝物,無差異。不同砧木處理共計有43種代謝物的相對含量差異顯著,主要為萜類、酮類和醛類物質。中間砧能促進果實代謝物積累,尤其對于芳烴類及部分酮類、萜類的積累具有顯著促進作用;對萼砧的“建香”果實代謝物積累水平普遍低于另外兩種砧木;美味砧對“建香”果實代謝物積累的影響介于中間砧和對萼砧之間(見表1)。

表1 不同砧木“建香”中華獼桃果實部分揮發性代謝物相對含量 CPS(Count Per Second)

對檢測到香氣化合物歸一化處理后進行主成分分析(PCA)。不同砧穗組合PCA得分如圖3A所示,主成分1和主成分2共解釋了51.8%的變異率。在無監督的模式下,不能將美味砧、中間砧、對萼砧“建香”果實區分開。正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)結果顯示,在有監督模式下兩兩比較時,組間差異較明顯,均分別位于橫軸左右兩端(見圖3B、3C、3D),即砧木種類顯著性影響了“建香”果實揮發性代謝物的形成。為了驗證分組模式下數據模型是否有效,對上述OPLS-DA模型進行假設驗證,檢驗次數為100次。驗證結果顯示,p值均小于0.05,且Q2、R2的值也證明該模型有效。統計學分析表明,當VIP>1時,該因子可能是兩組之間的差異物質。結合相關性分析得到的p值分析,當VIP>1且p<0.05時,該代謝組分就是這個模型下兩組的差異代謝物。為進一步驗證不同處理之間具體存在哪些差異物質,對3組材料中各個代謝物的VIP值進行了預測,發現3組處理有43種差異代謝物(見圖4)。其中,中間砧組中有28種代謝物上調,主要是1-(3-甲基苯基)-乙酮、2-(3-甲基-2-丁烯基)環戊酮等酮類、2,4-庚二烯醛、2,4-辛二烯醛等醛類和(+)-香芹酮、對苯三酚等萜類物質,有9種代謝物含量下降;對萼砧處理共有30種代謝物含量下調,10種上調。說明,中間砧能促進“建香”果實揮發性代謝物積累,而對萼砧不利于“建香”果實揮發性代謝物積累。

注:(A)不同砧木嫁接的“建香”香氣PCA得分圖;(B)嫁接在美味和中間砧上的“建香”香氣OPLS-DA得分圖;(C)嫁接在美味和對萼上的“建香”香氣OPLS-DA得分圖;(D)嫁接在中間砧和對萼上的“建香”香氣OPLS-DA得分圖。MW:美味砧木樣本,ZJZ:中間砧樣本,DE:對萼樣本,圖4同。

圖4 不同砧木“建香”中華獼猴桃果實香氣組成成分的VIP值圖

3 討論

3.1 不同砧木影響獼猴桃果實大小與內在品質

本研究發現,中間砧和對萼砧在果實大小方面均顯著優于美味砧,且中間砧與對萼砧之間無顯著差異。這可能是不同砧木合成的內源激素含量不同,從而達到影響果實大小的效果[25]。劉楊等[6]研究發現,相比傳統的美味獼猴桃實生砧,對萼砧能促進“紅陽”獼猴桃主蔓和新梢增粗,提高單果質量,提升樹勢,實現豐產性。閆樹堂等[26]的研究結果表明,矮化中間砧對蘋果果實內源激素含量、果實大小有顯著性影響?？梢?砧木類型及砧穗組合會影響獼猴桃果實大小。

本研究發現,在內在品質,如可溶性總糖、可滴定酸和維生素C含量方面,中間砧“建香”的表現顯著優于另外兩組,美味砧和對萼砧之間的差異不顯著。有研究表明,砧木根系類型會影響接穗對水分和營養物質的吸收,不同砧木對離子、礦質營養的吸收及向上運輸的能力有差異,因此能改變接穗部無機營養含量,從而影響果實品質[25,27]。與中華獼猴桃和美味獼猴桃相比,對萼獼猴桃的根系更發達,對養分、水分吸收及運輸能力更強,因而以對萼獼猴桃為砧木能提高接穗養分含量及改善果實品質。Thorp等[28]將“Hort 16A”嫁接在8種砧木上并測定葉片、莖段和果實中的營養元素,發現砧木對葉片和果實中的營養元素累計影響顯著,且呈正相關關系。王海寧等[29]研究了不同砧木嫁接的富士蘋果對N素的吸收、分配及利用情況,發現不同砧穗組合中同一器官C、N素分配差異顯著。此外,砧木還能影響接穗光合作用能力,影響光合產物向果實中轉移,從而對果實品質產生影響。如:長果獼猴桃(A.longicarpa)做“紅陽”獼猴桃砧木能提高凈光合速率、水分利用效率、光能利用效率和羧化效率[30]。

3.2 不同砧木影響獼猴桃果實香氣品質

砧木會影響果實香氣物質。本研究發現,砧木在“建香”獼猴桃果實香氣物質代謝積累上起著重要作用,不同砧木的果實代謝物含量有顯著性差別。在3種砧木中,對萼砧最不利于代謝物的累積,中間砧處理的代謝物含量最高。牛自勉等[31]研究發現,矮化中間砧能顯著提高蘋果果實中酯類物質含量?！疤┥礁吕?M26/八棱海棠組合果實的醛類、酯類及香氣含量均顯著高于“泰山嘎拉”/八棱海棠組合果實[32]。整體來看,以中間砧為砧木能較大程度地提高果實中揮發性代謝物的含量。這可能是因為中間砧能提高基砧和接穗間物質交流能力,提高無機營養向上部運輸的效率,影響各種酶類的活性,如分別與酯類、醛類密切相關的脂氫過氧化物裂解酶和醇?；D移酶,影響獼猴桃果實成熟過程中由醛類物質轉化為酯類物質的過程,從而導致香氣物質含量差別較大。Zhang等[33]以“赤霞珠”葡萄為材料,發現砧木能影響果皮花色苷、黃酮醇、二苯乙烯類代謝物含量及其相關合成酶基因表達量,從而增加果皮抗氧化活性。

有研究發現,在總醇類、萜類、醛類、酮類和酯類中,成熟階段獼猴桃果實香氣物質以酯類化合物數量最多,且丁酸甲酯、苯甲酸甲酯、丁酸乙酯和苯甲酸乙酯是成熟果實中豐度最高的成分[34]。在本研究中,成熟“建香”獼猴桃果實香氣物質種類以烷烴類和酯類物質占比最高,分別為24%和22%;從含量上來看,酯類物質含量最高,對香氣的貢獻最大。

酯類是引起獼猴桃甜味和果味的主要化合物,丁酸乙酯被認為是果實成熟后果香的重要來源。獼猴桃果實代表香氣屬性包括果香、甜香、青草味、黃瓜味等,在獼猴桃成熟期間其味道從草青味逐漸變為青鮮味、果味,這是果實內醛類物質含量降低而酯類增加導致的[35]。獼猴桃果實香氣屬性與丁酸乙酯、己酸甲酯和苯甲酸己酯含量有關,己烯醛和己醇能賦予青草香,丁酸乙酯等酯類與甜味相關性較高,苯甲酸甲酯和苯甲酸乙酯具有花香氣息[36-37]。有研究表明獼猴桃香氣的關鍵組分包括丁酸乙酯、己酸乙酯、癸醛、己醇、1-辛烯-3-醇和1-戊烯-3-酮[37],也有研究認為一些含硫物質如三硫化物、二甲基硫醚為獼猴桃重要成分[38]。在本研究的所有105種代謝物中,酯類是對“建香”果實香氣貢獻最大的一類物質,其中,丁酸乙酯、丁酸丁酯、丁酸甲酯、苯甲酸甲酯和苯甲酸乙酯的貢獻度較高。因此,“建香”成熟果實的香氣總體表現為果香、甜香和花香氣息。獼猴桃發育階段和未成熟階段的代謝物主要為醇、醛以及酸類物質,成熟階段會轉變為酯類物質。在本研究中,未檢測到1-辛烯-3-醇、1-戊烯-3-酮以及含硫物質,另外,被認為是決定獼猴桃香味三種揮發性成分之一的2-己烯醛也未能檢測到,這可能是遺傳因素以及果實發育階段導致的差異。

4 結論

與美味獼猴桃(“金魁”)實生砧相比,中間砧(對萼獼猴桃+美味獼猴桃品種“米良1號”嫁接苗)及對萼獼猴桃實生砧能顯著提高“建香”獼猴桃果實單果質量,后兩者之間無顯著性差異。中間砧能顯著提高“建香”獼猴桃果實可溶性糖和維生素C含量,降低可滴定酸含量,同時,對果實香氣代謝物含量表現出顯著促進作用。綜合評價果實大小、內在品質以及香氣物質,以對萼獼猴桃+“米良1號”為“建香”的砧木能顯著提升果實品質。