軟棗獼猴桃“奇異莓6號”無芽莖段離體再生技術研究

郭慧慧,林叢發,蔣元斌,徐紹翔

(寧德市農業科學研究所,福建寧德,355017)

軟棗獼猴桃(Actinidiaarguta)為獼猴桃科獼猴桃屬大型落葉藤本植物[1-2],常用英文名稱包括Hardy kiwifruit、Grape kiwi及Baby kiwifruit等[3]。其始載于《開寶本草》,在《本草綱目》中有整株入藥的記載[4]。果皮光滑無毛且可食用、果肉細膩酸甜、營養成分豐富、富含維生素C且風味獨特[5]。成株具有極強的耐寒特性,我國以東北的軟棗獼猴桃資源最為豐富[6]。軟棗獼猴桃傳統育苗方式主要有播種、扦插和嫁接,但這些方式易受定植時間、氣溫、病害等外界因素干擾。離體快繁技術對軟棗獼猴桃規?；?、標準化生產具有重要意義。同時,離體快繁技術也是超低溫種質保存、遺傳轉化、體細胞雜交等的基礎。雖然關于軟棗獼猴桃離體快繁技術的研究已有較多報道,但都集中在基本培養基、植物生長調節劑及外植體類型等方面,關于光照強度、培養溫度、苗齡等培養條件對軟棗獼猴桃離體快繁技術的影響尚未見報道。同時,以無芽莖段作外植體時,叢生芽誘導存在分化率及增殖系數低等問題。在張遠記等[7]的研究中,無芽莖段外植體容易愈傷化,但其愈傷組織難以分化,分化率僅為27.5%,產生的芽少,生長慢。李昌禹等[8]研究發現,經2,4-D處理的無芽莖段形成愈傷組織后,轉至ZT(0.5～4 mg/L)培養基中均形成高矮不等的小植株,但并未給出具體數據。在樸一龍等[9]的研究中,野生軟棗獼猴桃無芽莖段的芽分化率為30%。在王廣富等[10]的研究中,軟棗獼猴桃“魁綠”無芽莖段愈傷組織誘導率為94.7%,不定芽分化率為41.3%。針對此,筆者以軟棗獼猴桃“奇異莓6號”無芽莖段為材料,研究了不同光照強度、培養溫度、苗齡及植物生長調節劑對其無芽莖段愈傷組織誘導及植株再生的影響,以期為軟棗獼猴桃組培苗工廠化生產提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于春季切取長約0.5 cm軟棗獼猴桃“奇異莓6號”幼嫩側芽回實驗室。在流水下沖洗30 min以上后,轉移至超級工作臺進行消毒:75%酒精消毒30 s→無菌水沖洗3次→0.1%升汞消毒10 min→無菌水沖洗5～6次。消毒后,在解剖鏡下,用注射器針尖將側芽外層葉片剝去,切取0.3～0.5 mm大小的莖尖接種在MS+ZT 0.5mg/L中培養。成苗后轉入MS+0.2 mg/L IBA中繼代培養。切取繼代培養無菌苗無芽莖段作外植體?；九囵B基為MS固體培養基(含蔗糖30 g/L,瓊脂5 g/L,pH值5.8),于121 ℃滅菌20 min。組培室光照為12 h/d。

1.2 叢生芽誘導

1.2.1 植物生長調節劑濃度與配比試驗 將培養30 d的無菌苗無芽莖段分別接種在含有不同濃度玉米素(簡稱ZT,0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3 mg/L)和萘乙酸(簡稱NAA,0.01、0.03 mg/L)的MS培養基中培養。培養室溫度為(20±2) ℃,光照強度50 lx。各處理每重復10個外植體,5次重復。55 d后統計愈傷組織誘導率、分化率和不定芽數。愈傷組織誘導率(%)=(產生愈傷組織的外植體數/接種外植體總數)×100%。分化率(%)=(分化的外植體數/產生愈傷組織的外植體數)×100%。不定芽數(個/塊)=不定芽總數/分化的外植體數。

1.2.2 光照條件試驗 將培養30 d的無菌苗無芽莖段接種在MS(添加2 mg/L ZT)培養基中,分別進行不同光照強度[1 500、50 和0(暗培養)lx]處理。各處理每重復10個外植體,5次重復。培養室溫度為(20±2) ℃。55 d后統計愈傷組織誘導率、分化率和不定芽數。計算方法同“1.2.1”。

1.2.3 培養溫度試驗 將培養30 d的無菌苗無芽莖段接種在MS(添加2 mg/L ZT)培養基中,培養室分別進行不同溫度(15、20、25、28 ℃)處理。各處理每重復10個外植體,5次重復。組培室光照強度50 lx。55 d后統計愈傷組織誘導率、分化率和不定芽數。計算方法同“1.2.1”。

1.2.4 苗齡試驗 將不同苗齡(培養30 d、60 d、90 d)的無芽莖段接種在MS(添加2 mg/L ZT)培養基中。各處理每重復10個外植體,5次重復。培養室溫度為(20±2) ℃,光照強度50 lx。55 d后統計愈傷組織誘導率、分化率和不定芽數。計算方法同“1.2.1”。

1.3 生根培養和移栽

將無芽莖段誘導的叢生芽幼苗轉入溫度為(25±2) ℃、光照強度為1 500 lx的組培室培養45 d后,切取幼苗分別接種在添加不同濃度IBA(0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L)的MS培養基中培養,培養室溫度仍為(25±2)℃,光照強度1 500 lx。各處理每重復8個外植體,5次重復。30 d后統計生根率,并用游標卡尺測量根數、根長和根粗。生根率(%)=(生根株數/培養株數)×100%。

由于離體快繁育成的苗木是在無菌、高濕、相對恒溫、弱光環境下生長的,在移栽時須煉苗,以提高幼苗的抗性及對外界的適應能力。這是保證移栽成活的第一步。先將生長健壯的組培苗(生根培養30天)移至自然散光下進行移栽前的煉苗,該階段至少14 d。煉苗期間不開瓶蓋。若開瓶蓋煉苗,則培養基表面容易長霉菌,根發黑發黃,影響苗質量。分別于1月、3月和6月進行了3次移栽,每次100株苗。1月(19日)移栽時,由于天氣較冷,對煉苗后組培苗進行了去葉處理,栽于園土中1個月后可長出新芽,此期間須防治地下害蟲。3月(25日前后)移栽時為多雨時期,空氣濕度大,氣溫適宜,組培苗移栽管理最為簡單,煉苗后直接移栽,但移栽地須選擇不積水地塊,否則容易爛苗。6月(10日前后)移栽時,氣溫相對較高,空氣較干,須選擇陰涼處移栽,或進行遮蔭處理,同時須勤澆水,保證濕度,移栽1個月后組培苗仍較弱,若氣溫達35 ℃以上,對管理要求較高。每次于移栽60 d后統計成活率。

1.4 數據分析

采用DPS 7.05軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同ZT和NAA濃度對無菌苗無芽莖段誘導叢生芽的影響

對無芽莖段使用不同濃度ZT和NAA進行不定芽誘導,培養40 d兩端開始形成淡綠色愈傷組織,培養45 d愈傷組織表面出現紅色小點,開始形成不定芽。培養55 d時的統計結果表明,植物生長調節劑種類及濃度對叢生芽誘導有顯著影響。隨著ZT濃度升高,愈傷組織誘導率、愈傷組織分化率及不定芽數均呈現先升高后降低的變化趨勢,當ZT濃度為2 mg/L時到最大值,分別為100%、100%及18.87個/塊,顯著高于其他處理。當ZT濃度為2 mg/L時,不添加NAA處理的不定芽數顯著高于添加NAA處理,說明加入NAA不能促進愈傷組織分化,反而抑制了不定芽形成(見圖1和表1)。

表1 ZT和NAA濃度對軟棗獼猴桃無菌苗無芽莖段叢生芽誘導的影響

圖1 不同培養基誘導軟棗獼猴桃無菌苗無芽莖段產生叢生芽的情況

2.2 光照條件對無菌苗無芽莖段誘導叢生芽的影響

試驗結果看出,在1 500 lx光培養(每天光照12 h)下,隨培養時間增加,無芽莖段由綠色轉為黑色,期間無愈傷組織產生。50 lx弱光培養(每天光照12 h)40 d,無芽莖段兩端開始形成淡綠色愈傷組織,愈傷組織誘導率100%;培養45 d,愈傷組織表面出現紅色小點,開始形成不定芽,分化率100%;培養55 d不定芽數為18.87個/塊。暗培養50 d,無芽莖段開始形成白色愈傷組織,分化率低,僅12.33%,產生不定芽少,為0.67個/塊。弱光培養下軟棗獼猴桃無芽莖段叢生芽誘導效果最好(見表2和圖2)。

表2 光照條件對軟棗獼猴桃無菌苗無芽莖段叢生芽誘導的影響

圖2 不同光照強度下軟棗獼猴桃無菌苗無芽莖段誘導叢生芽的情況

2.3 培養溫度對無菌苗無芽莖段誘導叢生芽的影響

觀察發現,在15 ℃條件下,無芽莖段一直保持綠色,有少量愈傷組織產生,無分化。在20 ℃條件下培養40 d無芽莖段兩端開始形成淡綠色愈傷組織,愈傷組織誘導率100%;培養45 d時,愈傷組織表面出現紅色小點,開始形成不定芽,分化率100%;培養55 d時,不定芽數為18.87個/塊。在25 ℃條件下培養27 d無芽莖段開始形成淡綠色愈傷組織,愈傷組織誘導率92.50%;培養55 d時,愈傷組織分化率為86.79%,不定芽數為11.63個/塊。在28 ℃條件下培養20 d無芽莖段開始形成淡綠色愈傷組織,愈傷組織誘導率82.50%;培養55 d時,愈傷組織分化率為60.56%,不定芽數為5.95個/塊。隨培養溫度升高,莖段出現愈傷時間越早;誘導率、分化率及不定芽數則以在20 ℃條件下時最高(見表3)。綜上所述,20 ℃是最佳培養溫度。

表3 培養溫度對軟棗獼猴桃無菌苗無芽莖段叢生芽誘導的影響

2.4 苗齡對無菌苗無芽莖段誘導叢生芽的影響

由表4可知,苗齡30 d與60 d的無芽莖段培養55 d后,兩者的愈傷組織誘導率、分化率及不定芽數均無顯著差異,但顯著高于苗齡90 d的無芽莖段?？梢?最佳苗齡為30～60 d。

表4 苗齡對軟棗獼猴桃無菌苗無芽莖段叢生芽誘導的影響

2.5 IBA濃度對生根的影響

由表5可知,添加IBA與否對生根率無顯著影響,對根數、根長和根粗均有顯著影響。綜合考慮根數、根長及根粗3個指標,IBA 0.4 mg/L處理為最佳濃度,在該濃度下培養30 d生根率可達100%,根數為8.53/株,根長1.68 cm,根粗0.14 cm(生根前苗長勢見圖3,生根后苗長勢見圖4)。此外,無芽莖段兩端愈傷組織產生的無菌苗均正常生根,未觀察到極性問題。

表5 IBA濃度對軟棗獼猴桃無菌苗生根的影響

2.6 移栽季節對成活率的影響

移栽60 d后調查結果表明,經過煉苗后,于1月、3月和6月移栽的成活率分別為90%、93%和80%?？梢?移栽時因氣候條件不同,不僅需要采用不同的管理方法,而且移栽成活率也受到一定程度的影響,以3月移栽最適宜。移栽60 d后苗長勢見圖5。

3 討論

在植物組織培養過程中,不同植物及其生長狀態所需培養條件有差異。光照強度、光照時數、培養基pH值、培養溫度、培養濕度、植物生長調節劑、材料年齡等均會在一定程度上影響愈傷組織的形成、繼代與再分化。植物生長調節劑對植物愈傷組織的誘導與分化具有重要作用。在軟棗獼猴桃愈傷組織誘導叢生芽的研究中,前人使用的植物生長調節劑通常為NAA、6-BA、ZT和IBA等[7-8,11-14]。前人研究表明,低濃度NAA對軟棗獼猴桃叢生芽的誘導有促進作用[11-13],但在本研究中NAA卻表現為抑制作用,這可能與本研究所用材料長期在MS+0.2 mg/L IBA培養基中繼代有關。樸一龍等[9]和鄭小華[14]的研究表明,6-BA對不定芽的誘導效果優于ZT,但在本研究前期預試驗中6-BA與NAA誘導莖段產生叢生芽的效果均不佳,這可能與所取的外植體生長狀態有關。張遠記等[7]和李昌禹[8]等的研究結果表明,ZT對軟棗獼猴桃愈傷分化有很好的誘導作用,在本研究中ZT亦表現出較好的誘導效果。

前人的研究表明,不同光照強度下愈傷組織的結構和生理狀態差異很大[15-18]。暗培養比光培養更有利于愈傷組織誘導和增殖,但長時間暗培養不利于芽生長[19-20]。低光強能使愈傷組織保持健康的生理狀態,而高光強對愈傷組織的生長有抑制作用,愈傷褐化嚴重[21]。本試驗獲得了相似的結果:暗培養的愈傷組織呈現白色,分化率低,芽點少;弱光培養的愈傷組織為嫩綠色,分化率高,芽點多;強光下,莖段變黑死亡,無愈傷產生。

除光照強度外,外植體的取材時間對組織培養也有影響。如:王春夏等[22]研究發現苗齡短的朱頂紅葉片基部容易誘導,朱雪妹等[23]發現番茄“851”苗齡短的外植體愈傷率和生芽率均最高,趙靜雅等[24]發現組培苗苗齡大則脫分化和再分化能力較弱。在本試驗中,同樣是苗齡短的無芽莖段容易誘導。

培養溫度可直接影響細胞的生長與分化,從而影響愈傷組織的生長及代謝[25]。李金鳳等[26]對高山紅景天的研究表明,在較低溫度下愈傷組織誘導效果較好,而較高溫度不利于愈傷組織誘導。陳發菊等[27]研究發現,低溫處理是水母雪蓮愈傷組織再分化的關鍵條件。在本試驗中,較低的培養溫度(20 ℃)有利于軟棗獼猴桃無芽莖段叢生芽的誘導。

在植物組織培養中,外植體的選擇相當重要。王梓涵等[28]的研究表明,軟棗獼猴桃無菌苗腋芽莖段最佳增殖培養基為MS+3%蔗糖+0.7%瓊脂+6-BA 0.5mg/L,增殖系數可達到9.3。然而,在本試驗中觀察到,當試驗材料為有芽莖段時,芽點生長早于愈傷組織生長,芽生長后會抑制愈傷組織的生長和分化,其增殖率低于無芽莖段。

在生產實踐中,本試驗建立的軟棗獼猴桃無芽莖段快繁技術體系與有芽莖段繁殖技術體系一起應用,可在短期內提供大量優質種苗。