基于網絡藥理學和分子對接探究白芍-麥冬藥對治療干燥綜合征的作用機制

陳瑩瑩 萬磊 劉健 黃傳兵 李舒 李方澤 胡賽賽 程靜

摘要：目的 運用網絡藥理學和分子對接探究白芍-麥冬藥對治療干燥綜合征（sj?gren syndrome，SS）的作用機制。方法 通過BATMAN、Gene Cards、OMIM、Drug Bank、TTD、DISGENET數據庫和Cytoscape軟件發現并探究相關治療靶點作用關系。通過String數據庫構建蛋白質-蛋白質相互作用網絡圖。通過DAVID平臺進行GO與KEGG富集分析。使用AutoDock Tools1.5.7軟件進行分子對接。結果 白芍-麥冬有57個有效活性成分，362個作用靶點，SS有1219個疾病相關靶點。主要有效成分為豆甾醇、沒食子酸、β-谷甾醇，核心靶點AKT1、IL1B、CAT、IGF1。GO分析中，GO生物過程（biological process，BP）主要包括基因表達的負調控、脂多糖的反應、RNA聚合酶II啟動子轉錄的正向調節等；GO細胞組分（cellular components，CC）主要包括細胞表面、細胞外區域、細胞外體等；GO分子功能（molecular function，MF）主要包括血紅素結合、類固醇結合、RNA聚合酶II轉錄因子活性等。KEGG富集分析中主要包括MAPK信號通路、TNF信號通路、cAMP信號傳導途徑等；分子對接實驗表明其主要活性成分與核心靶點之間存在良好的結合活性。結論 白芍-麥冬藥對通過多靶點、多通路發揮治療SS的作用。

關鍵詞：網絡藥理學；分子對接；白芍-麥冬；干燥綜合征

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

文章編號：1007-2349（2024）01-0055-08

Study on the Action Mechanism of Paeoniae-Ophiopogon in the Treatment of Sicca

Syndrome Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

CHEN Ying-ying，WAN Lei，LIU Jian，HUANG Chuan-bing，LI Shu，LI Fang-ze，HU Sai-sai，CHENG Jing

（1.Anhui University of Traditional Chinese Medicine，Hefei 230038，China;

2. The First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine，Hefei 230032，China）

【Abstract】Objective： To study the action mechanism of paeoniae-ophiopogon in the treatment of sicca syndrome （SS） by network pharmacology and molecular docking. Methods： The relationship between relevant therapeutic targets was discovered and explored through BATMAN，Gene Cards，OMIM，Drug Bank，TTD，DISGENET database and Cytoscape software. The network diagram of protein-protein interaction was constructed by String database. GO and KEGG enrichment analysis was performed by using the DAVID platform. Molecular docking was performed by AutoDock Tools1.5.7 software. Results： There were 57 active ingredients and 362 active targets in Paeoniae-Ophiopogon，and 1219 disease-related targets in SS. The main active ingredients were stigmasterol，gallic acid，β-sitosterol，and the core targets were AKT1，IL1B，CAT，IGF1. In GO analysis，biological processes （BP） of GO mainly included negative regulation of gene expression，lipopolysaccharide reaction，and positive regulation of RNA polymerase II promoter transcription. GO cellular components （CC） mainly include cell surface，extracellular region，extracellular body，etc. The molecular function （MF） of GO mainly included heme binding，steroid binding and RNA polymerase II transcription factor activity. The KEGG enrichment analysis mainly included MAPK signaling pathway，TNF signaling pathway，cAMP signaling pathway，etc. The molecular docking experiments showed that there was good binding activity between the main active components and the core targets. Conclusion： Paeoniae-Ophiopogon can play a role in the treatment of SS through multi-target and multi-pathway.

【Key words】Network Pharmacology; Molecular Docking; Paeoniae-Ophiopogon; Sicca Syndrome

干燥綜合征（sj?gren syndrome，SS）是一種以唾液腺、淚腺等分泌腺受累為主要特征的自體免疫疾病，臨床上以眼干、口干等為主要特征。目前SS具體發病機制尚未十分明確，但有研究表明其病因與免疫、遺傳、環境、性激素水平、細胞免疫、體液免疫等多種因素的交互作用有關，過度的炎癥反應和免疫損傷是導致SS的重要原因。中國人群中SS的患病率為0.29%～0.77%，好發年齡為30～60歲，女性多見，男女比為1∶9～1∶10。目前西藥治療SS只能改善癥狀、延緩疾病的和發展，并不能根治。除此之外西藥在治療SS的過程中不良反應、副作用較多。劉健教授研究發現臨床上常用白芍、麥冬治療SS，且有良好的治療效果。本文利用網絡藥理學的方法，探討白芍-麥冬在SS的治療機理上的獨特優勢，并運用分子對接對其進行驗證，為白芍-麥冬藥物治療SS提供了新的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 白芍-麥冬藥對成分的獲取及相關靶點篩選 在BATMAN數據庫中分別輸入“baishao”、“maidong”，以參數分數大于20（Scorecutoff>20）且P值<0.05（AdjustedP-value<0.05）作為篩選指標，篩選出白芍、麥冬的有效成分和作用靶點。

1.2 SS相關靶點篩選及白芍-麥冬治療SS的潛在作用靶點的獲取 以“Sj?gren syndrome”為關鍵詞，分別在GeneCards（http：//www.genecards.org/）、TTD數據（http：//db.idrblab.net/ttd/）、OMIM數據庫（http：//www.omim.org/）、DISGENET數據庫（http：//www.disgenet.org/）、DrugBank數據（http：//www.drugbank.ca/）中檢索，獲得疾病相關靶點。運用venny 2.1.0在線繪制韋恩圖，得到白芍-麥冬治療SS的潛在作用靶點。

1.3 構建白芍-麥冬有效成分-作用靶點網絡圖 將1.1和1.2中所獲得數據導入Cytoscape3.9.1軟件中，構建白芍-麥冬有效成分-作用靶點的網絡圖。

1.4 PPI網絡構建白芍-麥冬藥對治療SS的核心靶點篩選 將藥物靶點與疾病靶點取交集，篩選出“白芍-麥冬”藥對治療SS的相關靶點，并在STRING數據庫（https：//string-db.org/）中構建蛋白——蛋白互作網絡，物種選擇“Homo sapiens”，等值置信度為0.4，其余參數設置為默認值，保存結果中的csv.文件。用Cytoscape3.9.1軟件構建可視化網絡，并通過軟件中的CytoNCA插件進行網絡拓撲分析，篩選出核心靶點。

1.5 GO和KEGG通路富集分析 在DAVID數據庫中，將物種設置為“Homo Sapiens”，對其共同靶點進行GO和KEGG富集分析。在GO富集分析中獲得生物過程（Biological Processes，BP），分子功能（Molecular Functions，MF），細胞成分（Cellular Components，CC）的分析結果，并篩選P值最小的前10個結果進行研究。在KEGG富集分析結果中篩選P值最小的前20個通路，通過微生信平臺（http：//www.bioinformatics.com.cn/）進行可視化處理。

1.6 分子對接驗證 篩選出來的疾病關鍵靶點和藥物主要活性成分分別作為受體蛋白和配體小分子。在PDB數據庫（http：//www1.rcsb.org/）中獲取受體蛋白的3D結構并下載其pdb格式文件，從UniProt（https：//www.uniprot.org/）數據庫下載配體小分子的sdf格式文件，并在Open Babel軟件中將小分子的sdf格式轉化成pdb格式作為分子對接的配體。使用AutoDock Tools 1.5.7對配體和受體進行分子對接，并使用Pymol將分子對接結果進行可視化處理。

2 結果

2.1 “白芍-麥冬”藥對有效成分及相關靶點的獲取 在BATMAN數據庫中篩選后得到白芍35個有效成分，300個作用靶點，刪除重復項后得到144個作用靶點；麥冬22個有效成分，305個作用靶點，刪除重復項得到243個作用靶點。兩種藥物共有387個作用靶點，刪除重復項后得到362個作用靶點。

2.2 SS相關靶點的篩選及白芍-麥冬治療SS的潛在作用靶點的獲取 在Gene Cards數據庫中檢索得到968個疾病靶點；在TTD數據庫中中檢索得到10個疾病靶點；在OMIM數據庫中檢索得到654個疾病靶點；在Drug Bank數據庫中檢索得到41個疾病靶點；在DISGENET數據庫中檢索得到482個疾病靶點，五個數據庫共獲得靶點1565個疾病靶點，篩除重復靶點后最終獲得1219個疾病靶點。運用venny 2.1.0在線繪制韋恩圖，得到白芍-麥冬治療SS的潛在作用靶點（見圖1）。

2.3 中藥有效成分-作用靶點互作網絡構建 通過Cytoscape3.9.1軟件構建“白芍-麥冬”藥對的“有效成分-作用靶點”網絡構建。然后使用工具Network Analyzer進行分析，根據等級值（Degree）設置節點大小和顏色深淺。該網絡中共有94個節點，149條邊（圖1），其中紅色表示白芍、麥冬兩味藥物、黃色表示麥冬的成分、綠色表示白芍的成分、藍色表示基因（見圖2）。等級排名前3的有效活性成分分別是：分別豆甾醇、沒食子酸、β-谷甾醇（見表1）。

2.4 PPI網絡的構建及核心靶點篩選 將“白芍-麥冬-SS”三者共同靶點基因導入STRING數據庫中進行分析處理，然后將從 STRING數據庫中獲取的 csv文件導入Cytoscape3.9.1中進行分析，最終得到一個有62個節點，251條邊的核心靶點圖。根據Degree值進行分層排列得到最終的4個核心靶點。分別是：AKT1、IL1B、CAT、IGF1。圖中靶點的Degree值越大，節點越大，顏色越深、各靶點間的連線越粗，越能表明這4個核心靶點可能成為治療SS的關鍵靶點，見圖3。

2.5 GO和KEGG通路富集分析 通過DAVID數據庫，計算富集得到富集分析結果。通過微生信平臺繪制GO和KEGG分析圖（見圖4、圖5）。從GO分析圖來看白芍-麥冬有效活性成分作用的靶點主要富集在分子功能（BP）的基因表達的負調控、RNA聚合酶II啟動子的轉錄的負向調節、RNA聚合酶II啟動子轉錄的正向調節、DNA誘導的轉錄等生物過程；在細胞組成（CC）方面，細胞外區域、細胞外秘體、細胞質、核質體占比較高；在分子功能（MF）方面，血紅素結合、酶結合、鐵離子結合、氧化還原酶的活性排在前列。從KEGG分析中圖可以看出，“白芍-麥冬”藥對治療SS主要參與的信號通路包括代謝途徑、神經活性配體-受體相互作用、MAPK信號通路、TNF信號通路、cAMP信號傳導途徑等。

2.6 分子對接驗證 將PPI網絡圖中篩選出來的核心靶點取前3位AKT1、IL1B、CAT做為受體分別于與“白芍-麥冬有效成分-疾病靶點”圖中Degree值排名前3的成分豆甾醇、沒食子酸、β-谷甾醇進行分子對接，計算出受體與配體之間的結合能，對接結果見表2。根據對接結果運用Rstudio軟件繪制熱能圖（見圖6）。通常認為結合能越低，受體和配體之間的結合力越強、穩定性越高。根據對接結果用PymoL軟件對其部分分子對接結果進行可視化處理（見圖7）。

3 討論

在中醫典籍中尚未找到與 SS 相對應的確切病名，由于其病因病機復雜，臨床表現多種多樣，因此歷代醫家將其歸入“燥證”、“虛勞”、“周痹”等范疇?！霸锉浴笔?0年代路志正教授提出的一種病癥，路老認為，其主要病機是陰血虧虛，津枯液干，故以益氣養陰、潤燥生津為主。劉健教授根據多年對SS患者臨床癥狀的觀察，認為該病以脾胃虧虛，氣陰兩虛為本，故治療上以益氣健脾，養陰生津為主。白芍味苦、酸，性微寒，歸肝、脾經，具有養血調經、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽等作用?，F代藥理研究顯示，白芍具有鎮痛、抗炎、免疫調節等作用。麥冬 味甘、微苦，性微寒，歸肺、胃、心經具有養陰潤肺、益胃生津、清心除煩之功效?，F代藥理學研究，發現其具有抗炎、抗氧化、保護心血管系統以及免疫調節等作用。本次研究從網絡藥理學的角度探究白芍-麥冬藥對治療SS的作用機制。

從PPI網絡圖分析可知，“白芍-麥冬”藥對的活性成分靶點與SS疾病靶點有67個共同靶位基因，主要包括AKT1、IL1B、CAT、IGF1、MPO、EDN1、NOS1等。

在Cytoscape數據庫中運用軟件中的CytoNCA插件篩選出4個關鍵基因，分別是AKT1、IL1B、CAT、IGF1，表示它們可能是“白芍-麥冬”藥對治療SS的關鍵靶點。AKT是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶一種，AKT1是其3個關系密切的家庭成員之一，主要參與調控細胞代謝、炎癥反應、血管生成等生物過程。CAT（過氧化氫酶）是一種以鐵卟啉為輔基的結合酶，具有抑制炎癥反應、激活免疫途徑、增強機體免疫力等生理功能。研究發現，CAT可以減弱NF-κB的活化程度，下調與免疫相關的細胞因子，進而減少炎性因子的表達，緩解炎性反應。IL-1β在SS患者中高表達，通過與膜受體結合后激活核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號通路，促進TNF-α、IL-1β以及IL-8等一系列促炎因子的表達，從而使炎性反應持續加重。IGF1是一種活性蛋白多肽物質，研究表明IGF1刺激促炎因子TNF-α、IL-6的產生，并通過MAPK信號通路增強人外周血單核細胞的促炎反應。從PPI網絡圖中可以看出這些靶點具有協同效應，并可通過抑制炎癥遞質水平、調節免疫等途徑實現對 SS的治療。

從KEGG通路富集分析圖可知，“白芍-麥冬”藥對可能通過MAPK信號通路、TNF信號通路、cAMP信號傳導途徑等參與RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄、炎癥反應、免疫調節等作用治療SS。MAPK信號通路通過調控TNF-α，IL-1β和IL-6等促炎因子的表達水平，從而調節抗感染機制的平衡，參與炎癥反應。研究表明MAPK信號通路不僅在炎癥反應中起作用，而且在 T細胞、B細胞、樹突狀細胞等免疫細胞中也起著調控作用。相關研究發現TNF-α在SS患者的血清及唇腺組織中表達顯著增加，表明TNF-α參與了SS疾病發展過程。從“有效成分-靶點”網絡圖分析可知，“白芍-麥冬”藥對中核心成分主要3種，分別豆甾醇、沒食子酸、β-谷甾。麥冬中的豆甾醇不僅能有效抑制炎癥因子IL-1β和TNF-α的水平，而且還能升高抗炎因子IL-10水平，發揮抗炎作用。沒食子酸是一種天然多酚類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒的作用。β-谷甾醇能抑制 LPS誘發的表皮細胞和巨噬細胞的炎癥小體NLRP3，從而抑制 MAPK信號途徑的激活，降低 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等炎癥因子的分泌，從而達到抗炎的效果。67個靶點基因可能通過與MAPK信號通路、TNF信號通路、cAMP信號傳導途徑等信號通路作用在其核心靶點發揮抑制炎癥反應、調節免疫等作用。

綜上所述，本文以網絡藥理學為基礎，探討了白芍-麥冬的有效成分、作用靶點、蛋白關系網絡、KEGG通路的富集分析。表明白芍-麥冬治療SS是多種成分通過多條通路作用于多個靶點的結果。分子對接的結果表明，核心成分與核心靶點結合良好。并由此推測“白芍-麥冬”藥對可能通過豆甾醇、沒食子酸、β-谷甾醇等有效活性成分調控AKT1、IL1B、CAT、IGF1、MPO、EDN1、NOS1等67個疾病靶點，影響炎癥應答、免疫調節的負調控等相關生物學過程及MAPK信號通路、TNF信號通路、cAMP信號傳導途徑等從而發揮治療SS的作用，為后續深入研究“白芍-麥冬”治療SS提供了理論依據，為“白芍-麥冬”藥物的研發提供新思路，但其結論有待于更有針對性的細胞實驗、動物試驗等方法來證實，以更好地闡明其臨床機理。

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（收稿日期：2023-01-04）