通過改良RAPD技術獲得黑毛石斛、蜂腰石斛和石仙桃的3條SCAR新標記

梅志強，郭 侃，魏春莉，鄭美玲，傅俊江

西南醫科大學醫學基礎研究中心（瀘州 646000）

隨機擴增多態性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）是一種應用廣泛的技術，可以同時擴增大量位點，在30 年前被引入，后來發展為生物體的遺傳表征。利用RAPD技術進行分子標記簡單、快速、可靠，能有效檢測多態性以及評估基因型之間的遺傳多樣性[1]。目前RAPD 分子標記技術被廣泛地應用于動物[2]、植物[3-4]和微生物[5-8]物種鑒定、基因定位[9]研究領域。雖然RAPD 因其優點而廣受歡迎，但它也有一些不可忽視的缺點，包括產量低和重現性差。傅俊江等[10]早期發現改良的RAPD 技術可以克服以上缺點，提高重復性和增加特異條帶。該方法被廣泛應用于多種藥用植物的遺傳多態性研究中[11-13]。

序列特征擴增區域（sequence characterized amplified regions，SCAR）是由RAPD分子標記技術發展而來的，其原理是利用特異性位點的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）標記，是一種有價值的分子生物學方法。利用SCAR標記，將分子分析簡化為PCR分析，利用RAPD擴增的特定序列設計PCR引物，可對研究對象實現特異性PCR分子鑒定[14-18]。

石仙桃為蘭科石仙桃屬植物，是一種重要的中藥材[19]，主要分布于貴州、云南、福建、廣東、廣西等地，主要產于廣東、福建等地[20]。石仙桃味甘、微苦，性涼，歸肺、腎經，其藥用價值豐富，具有清肺、養陰、利濕、消瘀和清熱解毒等功效，臨床用于治療肺熱咳嗽、慢性胃炎、眩暈、頭痛等[21]。石斛是蘭科三大屬之一，蜂腰、黑毛均屬于石斛種屬，為傳統貴重的藥材[22]，具有益胃生津，滋陰清熱、抗癌防老等功效[23]。石仙桃和石斛形態相似，容易混淆，常通過形態觀察區別，但容易出錯，因此需要更加準確的分子鑒定方法。

市場上商品石斛種類繁多，與不少其他中藥形態也很相似。售賣的石斛多為曬干制備好的中藥飲片，僅通過形態觀察無法區分。因而為保證藥物質量，尋找一種能快速區分不同藥材的方法對石斛及與其外形相似品種做出準確的鑒定十分有必要。本研究通過對多種草本植物進行RAPD擴增，找到3種中藥藥材具有特異性擴增條帶后，通過切膠回收、克隆到T 載體中、PCR 擴增陽性克隆進行鑒定及測序后設計SCAR 標記引物，從而在分子水平上建立快速區分上述3 種中藥藥材的方法，分別用于鑒定蜂腰石斛、石仙桃、黑毛石斛，并保存在GenBank中。在GenBank數據庫中對這3個核苷酸序列利用生物大分子序列比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行搜索，結果顯示與其他物種的標記不一致，為今后該類重要藥材樣品的鑒定提供了依據，對石斛藥材的鑒定和臨床應用具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料來源 新鮮植株材料：蜂腰石斛、球花石斛、長蘇石斛、黑毛石斛、玫瑰石斛、石仙桃、銅皮石斛、翅梗石斛來源于廣西柳州，鐵皮石斛來自安徽，金釵石斛來自四川瀘州合江，植株由西南醫科大學藥學院中藥資源與鑒定教研室張春教授鑒定。

1.1.2 試劑與儀器 2×MIX、Marker 等購自TaKaRa 生物技術有限公司；RAPD隨機引物購自北京賽百盛基因技術有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、EcoR I限制性內切酶（Promega 公司）、質粒小提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；瓊脂糖、LB 培養基、AMP、X-gal、IPTG、10 mg/mL 溴化乙錠（EB）溶液、50 × TAE緩沖液均購于生工生物工程（上海）有限公司。試驗所用儀器主要有：PCR梯度分析儀Mastercycler（Eppendorf，德國）；凝膠成像儀（ChemiDocXRS Bio—Rad，美國）；紫外分光光度計（U-3010）；Thermo 高速離心機（Legend Micro21R）；穩壓穩流電泳儀（DYY-5，北京六一儀器廠）；超低溫冰箱（Thermo）等。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA提取 從中國不同地區共采集了10個樣品：蜂腰、球花、長蘇、黑毛、玫瑰、石仙桃、銅皮、翅梗、鐵皮、金釵石斛。使用十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）從新鮮葉片中提取基因組DNA。首先將植物材料固定在含有氯仿、PVP、2-羥基-1-乙硫醇（不含液氮）的固定溶液中，然后用二氧化硅（SiO2）研磨成小塊進行DNA提取。通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳和分光光度法檢查DNA質量。將所有DNA樣本的最終濃度調整為10 ng/μL，并在-20 ℃下保存至使用。

1.2.2 改進的RAPD 擴增 使用來自北京賽百勝基因技術有限公司的隨機RAPD引物A2（TGCCGAGCTG）、N2（ACCAGGGGCA）、A6（GGTCCCTGAC）擴增不同的DNA 樣本。10 μL 的PCR 反應體系由5 μL 2 × Taq PCR Master Mix、1 μL 2.5 μM 引物、1.5 μL 基因組DNA和2.5 μL ddH2O 組成。擴增反應在PCR 機器“Applied Biosystems Veriti?96 Well Thermal Cycler”（美 國Life Technology）中進行，95 °C 初始變性90 s，然后進行40次如下循環：94°C變性40 s、36°C退火60 s，從退火到延伸的漸變率調整為0.125°C/s（5%漸變率）、72°C 延伸90 s，最后72°C延伸5 min。PCR產物在1.8%瓊脂糖凝膠上進行電泳。

1.2.3 RAPD陽性DNA片段的分子克隆與鑒定 從瓊脂糖凝膠中分別切下各個樣本特異的條帶，使用瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒進行純化。純化的DNA 片段通過TA克隆連接到pGM-T載體（編號VT202）（天根試劑，北京，中國）中，然后轉化到DH5α大腸桿菌感受態細胞中。將重組克隆菌液均勻涂抹在含有氨芐西林（100 μg/μL）、X-gal（40 mg）和IPTG（160 μg）的LB瓊脂平板上，37 °C 培養箱中培養過夜。采用藍白斑篩選法，篩選出白色菌落。使用SP6/T7引物（SP6：5'-ATTA GTGACACTATAGA-3'；T7：5'-TAATACGACTCACTAT AGG-3'）進行PCR 擴增篩選。挑選白色菌落于20 μL水中，吹打混勻，然后吸取0.8 μL 菌液，加入以下反應體系：5 μL 2 × Taq PCR Master Mix、1 μL 2.5 μM 的SP6/T7 引物、3.2 μL ddH2O 組成。將白色菌落進行PCR 擴增，在95°C 下90 s，然后進行35 次循環：94°C變性40 s、58°C 退火30 s、72°C 延伸50 s，最后，72°C延伸5min。在1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳，初步選取能夠擴增出正確的插入片段的菌落。然后選出陽性菌落加入5 mL的含有氨芐青霉素（100 μg/μL）的LB液體培養基，37°C 搖床培養17 h，第二天提取質粒。提取的質粒加入EcoR I 限制性內切酶37°C 酶切3 h，然后電泳檢測陽性克隆。

1.2.4 DNA 測序與生物信息學 利用T 載體測序引物的SP6，采用Sanger法對陽性克隆進行測序。為了去除載體序列并驗證克隆的RAPD 片段序列是否新穎，使用在線程序BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）用于GenBank 數據庫中不同物種的測序DNA克隆的同源性搜索。

1.2.5 SCAR 引物設計 通過使用在線程序Primer3對每個克隆的RAPD 片段的核苷酸序列設計SCAR 引物對，檢測引物的質量。每個引物的序列、優化的PCR條件和擴增長度如表1所示。

表1 針對特異片段的引物序列Table 1 Primer sequences for specific fragments

1.2.6 SCAR 標記的開發和分析 為了獲得穩定的SCAR 標記，使用20 份DNA 樣本作為模板進行PCR 擴增。它們是前面所述的10種不同的道地藥材樣品，以及枸杞、荔枝、銀杏、青果、金銀花、薄荷、趕黃草、當歸、梔子花、赤芝各一個樣品。10 μL PCR 反應體系如下：5 μL 2×Taq PCR Master Mix，1 μL 2.5 mM SCAR引物，1.5 μL 基因組DNA（10 ng），剩余體積2.5 μL ddH2O 補充。PCR 擴增在上述“Applied Biosystems Veriti?96 孔熱循環器”中進行，初始預變性在95°C下進行90 s，然后在94°C變性40 s，在63°C下退火30 s，在72°C下延伸40 s，循環34 次，最后72 ℃延伸5 min。擴增的PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠上分離。然后通過0.5 μg/mL溴化乙錠染色觀察凝膠，最后使用ChemiDoc XRS（美國Bio-Rad）記錄圖像。

2 結果

2.1 RAPD擴增片段的克隆

選出3 條RAPD 引物（A2、A6、N2）對DNA 樣品進行改進的RAPD 擴增，結果如圖1 所示，其中黑色箭頭表示引物N2（圖1A）、A6（圖1B）、A2（圖1C）標記的條帶。箭頭所示的條帶從瓊脂糖凝膠上切下并進一步純化，通過TA 克隆連接到T 載體。采用LB 瓊脂平板藍/白篩選法篩選陽性克?。〝祿达@示）。然后使用實驗提到的SP6/T7 引物，通過聚合酶鏈反應（PCR）擴增鑒定白色克隆菌落。在圖2中，克隆A6-33在通道1中顯示為預期插入的DNA片段，大小約為600 bp，克隆N2-12 在通道2 中顯示為預期插入的DNA 片段，大小約為750 bp，克隆A2-17在通道3中顯示為預期插入的DNA片段，大小約為750 bp，大小分別正確。故最終選擇了A2-17、N2-12、A6-33。將所取特異性菌液置于37°C搖床過夜培養，第二天使用質粒小提試劑盒提取質粒DNA，分光光度法測取DNA 濃度和檢測DNA 質量，然后使用酶切質粒再次驗證，所獲得的片段為如前所述的預期大小，如圖3所示。

圖1 使用不同的RAPD引物對DNA樣本進行RAPD擴增Figure 1 RAPD amplification of DNA samples using different RAPD primers

圖2 菌落PCR結果Figure 2 Colony PCR results

圖3 DNA連接后陽性克隆的酶切鑒定Figure 3 Identification of positive clones after DNA ligation by enzymatic digestion from E.prostrate

2.2 特異性RAPD片段的測序和特性分析

2.2.1 克隆的RAPD 片段（A2-17、N2-12、A6-33）的測序 對上述3 個克隆的RAPD 片段（A2-17、N2-12、A6-33）測序（如圖4 所示），然后用GenBank 數據庫中的核苷酸序列進行BLAST 搜索，發現這3 個克隆與數據庫中其他物種的同源性不顯著。

圖4 通過sanger測序獲得克隆的核苷酸信息Figure 4 Sequencing result of the cloned nucleotides by Sanger sequencing

2.2.2 特異SCAR標記的鑒定 根據克隆序列，設計并合成了3對引物（見表1）。然后利用設計的SCAR引物對從收集的20 個不同物種或品種的樣本中基因組DNA進行擴增，以檢測擴增物種的特異性，即蜂腰石斛的特異標記A2-17、黑毛石斛的特異標記N2-12、石仙桃的特異標記A6-33。PCR擴增結果見圖5。SCAR標記A2-17、N2-12、A6-33 的PCR 結果表明，在樣品（通道1-20）中觀察到具有預期大小的擴增產物而其他物種沒有擴增。由此可確認特異性SCAR 標記已成功開發，并可在未來用于鑒定蜂腰石斛、黑毛石斛和石仙桃品種，以及區別以上品種和其它中藥品種。

圖5 A2-17、N2-12、A6-33的穩定RAPD-SCAR標記的開發Figure 5 Stable RAPD-SCAR marker development for A2-17，N2-12 and A6-33

3 討論

中藥道地藥材的鑒定常用方法有：基源鑒定（DNA指紋圖譜）、形狀鑒定、顯微鑒別和理化鑒定等方法。其他幾種方法有的需要經驗豐富的專家才能鑒定，有的實驗方法繁雜。而DNA 標記技術，是非常準確和簡易的方法。RAPD 是應用最早、最方便的一種DNA 標記技術[24]，DNA 標記技術的發展徹底改變了基因組序列未知的物種和傳統生物的遺傳特征鑒定方法，已經成為植物學、動物學，甚至藥物化學研究領域的寶貴工具。這種技術簡單、經濟且易于實施，并且不需要對目標物種進行完整的DNA 測序。該方法被廣泛應用于不同產地藥用植物的遺傳多樣性鑒定，如辣椒[1]、流蘇石斛[3]和當歸[4]等。但單獨應用該技術由于RAPD引物較短，因此重復性和特異性差。當RAPD與SCAR結合時，可以提高穩定性和特異性，使形態相似但基因不同的藥用植物的遺傳鑒定更加高效。比如，利用RAPD分子標記的SCAR能夠快速鑒定區分一些物種，如趕黃草[14]、梔子[15]、忍冬[25]、冬蟲夏草[26]等。RAPD 與SCAR結合方法對于藥用植物樣本DNA 序列未知的物種也能快速鑒定，并且由于該方法的引物長度比RAPD 引物長度長，因此特異性更高。

本研究利用從中國不同地理位置采集的20 種植物標本，從這些植物中提取DNA生成了RAPD片段，并在T 載體中克隆，共篩選出3 條可用于鑒別黑毛石斛、蜂腰石斛、石仙桃的RAPD 引物，分別為N2-12、A6-33、A2-17，其中引物N2-12 在黑毛石斛中擴增出約750 bp 的特異性條帶，A2-17 在蜂腰石斛中擴增出約750 bp的特異性條帶，A6-33在石仙桃種屬中擴增出約600 bp 的特異性條帶。這3 對特異性SCAR 標記能高效、快速、準確的區分出上述3 個物種。所設計的3 對SCAR引物在3種道地藥材中的擴增圖譜單一，實驗操作過程簡單，實驗成本較低，但鑒別高效、準確、快速。這些SCAR 標記的建立相較于傳統形態學方法提供了更可靠的鑒別方法，可用于這幾種道地藥材的區分鑒定。目前獲得了識別黑毛石斛、蜂腰石斛和石仙桃3種樣本的特異SCAR標記，鑒定鐵皮石斛和金釵石斛的SCAR 標記已經找到[27]。其他幾種藥用植物也可以用同樣的方法獲得相應特異引物。因此，本課題組會在后續的研究中繼續擴增獲得不同樣本的特異片段，并克隆測序獲得對應樣本的特異引物。

4 結論

本研究利用SCAR 標記技術共篩選出N2-12、A2-17 和A6-33 3 條可用于鑒別黑毛石斛、蜂腰石斛和石仙桃的RAPD 序列，這3 對特異性SCAR 標記能高效、快速、準確的區分出上述3個物種。這些SCAR標記的建立為今后進行該中藥道地藥材樣品的鑒定提供了實驗依據。