基于SSR標記的紫花風鈴木群體遺傳多樣性分析

黃稚清, 吳林源, 高筱鈺, 丁釋豐, 馮志堅*, 秦新生, 劉奕彤,肖觀康

基于SSR標記的紫花風鈴木群體遺傳多樣性分析

黃稚清1,2, 吳林源1,3, 高筱鈺1, 丁釋豐1, 馮志堅1*, 秦新生1, 劉奕彤2,肖觀康1

(1. 華南農業大學林學與風景園林學院，廣州 510642；2. 廣東生態工程職業學院生態工程學院，廣州 510520；3. 廣東職業技術學院輕工與材料學院，廣東 佛山 528041)

為揭示紫花風鈴木()的群體遺傳變異特征，對廣東省6市12個群體72份種質材料進行遺傳多樣性和群體遺傳結構分析。結果表明，9對引物共擴增出123個等位基因位點，引物的平均多態信息量為0.754，具有較高的多態性。12個群體均具有較高的遺傳多樣性，群體間平均有效等位基因數為3.272個，平均Shannon指數為1.159。AMOVA分析表明群體間遺傳分化程度相對較低，群體內遺傳分化程度較高。群體的總體遺傳分化系數為0.077，處于中等程度?；赟tructure分析、主坐標分析和NJ聚類分析均可將12個群體分為2大類群，分組結果具有一定相似性，表明供試紫花風鈴木群體遺傳結構較為簡單。這為紫花風鈴木優良種質資源的利用、遺傳變異和科學育種提供了理論參考。

紫花風鈴木；遺傳多樣性；SSR標記；遺傳結構

紫花風鈴木()是紫葳科(Bignoniaceae)風鈴木屬落葉喬木，原產于南美和中美地區，可作為用材樹種和觀賞樹種。盛花期時觀賞效果極佳，花量大，花色多樣[1–3]。自20世紀70年代引入我國，紫花風鈴木常被用作行道樹、庭院樹、園林觀花樹種且表現良好[4–5]。但目前, 我國紫花風鈴木園林應用具有如下問題：一是引種來源較為復雜，前人研究已發現我國園林栽培種中存在紫花風鈴木和紅花風鈴木的雜交種[6]以及種質資源和命名混亂的情況[7]。二是紫花風鈴木良種選育工作比較滯后，園林應用中可觀測到不同個體在觀賞效果上的差異，有的個體花量小、花色不顯著, 群植時花期不統一。因此亟待開展紫花風鈴木的遺傳多樣性研究，有助于推動繁育和保存紫花風鈴木優質種質資源工作的開展，同時為優質種質創新提供支撐，提升景觀觀賞效果。

目前關于紫花風鈴木的研究主要集中在栽種、觀賞性、抗逆性等研究[8–14]，關于分子水平遺傳多樣性在風鈴木類中開展較多，單以紫花風鈴木作為研究對象開展研究較少。對風鈴木類植物的DNA分子水平遺傳多樣性的探究，已采用多種分子標記技術對風鈴木類植物進行分類與鑒別[6–7]和遺傳多樣性差異分析，如單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)位點結合測序基因分型技術(genotyping-by-sequencing, GBS)、葉綠體L-F、C序列分子遺傳分析、簡單重復序列(simplesequence repeats, SSR)分子標記[15]和區間簡單重復序列(inter simple sequence repeats, ISSR)分子標記[16]等。

在分子標記技術中，SSR分子標記技術因具有高靈活性、成本低、易推廣、多態性豐富、重復性好的優勢而得到廣泛應用[18–19]。SSR又叫微衛星DNA，SSR的產生是在DNA復制或修復過程中DNA滑動和錯配或者有絲分裂、減數分裂姐妹染色單體不均等交換的結果，具有較高的物種特異性[20–21]。SSR分子標記技術目前已廣泛應用于植物的種群遺傳學、遺傳圖譜構建、指紋分析等研究領域[19–21]。當前國內還沒有針對紫花風鈴木進行基于SSR標記的群體遺傳多樣性研究, 因此本文利用SSR分子標記技術對廣東省內6市12個群體的紫花風鈴木進行遺傳多樣性分析研究, 探究其遺傳多樣性豐富度、遺傳結構以及類群的劃分，為紫花風鈴木優良種質資源的保存和優質繁育提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

紫花風鈴木()材料采自廣東省6市12個群體，共72份，來源于同一個采樣地的樣本為1個群體(表1)。于2020—2021年采集樣本，采集新鮮葉片后，放入-80 ℃冰箱保存。

1.2 DNA提取與引物擴增

風鈴木葉片中含有較多多糖和多酚物質[22]，為減少DNA提取時多糖和多酚的干擾，參考周仙莉等[23]的改良CTAB法提取DNA, 然后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳和核酸檢測儀檢測DNA質量和濃度, 后保存于4 ℃冰箱中待用。

選取同屬植物的30對引物(mTb002～ mTb052)[24]和紫葳科印葉藤屬植物的28對引物(Stiz2～Stiz45)[25]，共計58對引物進行聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)擴增。所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。隨機選取8個樣本進行引物的特異性和多態性篩選，最終篩選出9對雜帶較少、主帶清晰、多態性較好、條帶差異明顯的SSR引物進行后續實驗(表2)。

采用熒光標記法進行基因分型，在每對引物的5′端標記熒光染料。PCR反應體系為30L，包含2×SanTaq PCR Master Mix 15L，正、反向引物(10mol/L)各1L，模板DNA (50 ng/L) 1L, ddH2O 12L。PCR擴增程序為95 ℃預變性5 min，然后95 ℃變性30 s，57 ℃復性90 s，72 ℃延伸30 s, 共28個循環，最后72 ℃延伸30 min，擴增產物于4℃保存備用。

表1 紫花風鈴木群體信息

表2 紫花風鈴木的SSR引物

1.3 數據整理與分析

利用Genemaker v2.2.0軟件對基因分型結果進行判讀，按引物預期擴增長度范圍讀出符合條件的數值并進行整理。利用GenAlEx 6.5進行遺傳多樣性統計、分子變異方差檢驗分析(analysis of molecular variance, AMOVA)和主坐標分析(principal coordinates analysis, PCoA)。利用Structure 2.3.4軟件對群體進行遺傳結構分析，并用Structure Harvester計算△K和LnP(D)，從而計算出最佳群體數目(K值)。利用PowerMaker 3.25計算多態性信息量(polymorphism information content, PIC)和計算Nei’s遺傳距離和遺傳一致度，并使用MEGA X 10.1進行鄰接聚類分析(neighboring-joining clustering analysis, NJ聚類)。

2 結果和分析

2.1 群體遺傳多樣性分析

2.1.1 SSR位點多態性

從表3可見，9對引物在72份材料中檢測出123個等位基因，觀測等位基因數(N)和有效等位基因數(N)分別為6.000～22.000和2.317～12.314，均值分別為13.667和6.072。Shannon指數()為1.133～2.519，平均為1.964，遺傳多樣性較為豐富。平均觀測雜合度(H)和期望雜合度(H)分別為0.310和0.775?；蛄?N)為0.519～1.611，平均為0.941。

2.1.2 群體遺傳多樣性分析

從表4可見，群體間的平均N為3.272個,其中jm群體的最大，hd群體最??；為0.448～ 1.630，平均為1.159，最大、最小的群體分別為jm和hd，與N的一致；H為0.292～0.734，H為0.222～ 0.389。

表3 9對SSR引物的遺傳多樣性參數

表4 紫花風鈴木的群體遺傳多樣性

sf、fs、zc、ns、th、ld、hn、jl、xm、jm、hd、zs見表1;N、N、、H、H見表3; 下同

sf, fs, zc, ns, th, ld, hn, jl, xm, jm, hd, zs see Table 1. N,N,,H,Hsee Table 3. The same below

2.1.3 群體遺傳分化和AMOVA分析

AMOVA分析表明(表5)，紫花風鈴木群體間的遺傳變異僅占8%，而大部分遺傳變異發生在群體內(92%)，說明紫花風鈴木群體間結構弱，群體間遺傳分化程度相對較低，群體內遺傳分化程度相對較高。從表6可見，紫花風鈴木群體間的分化系數(st)為0.077，居于0.050～0.150，表明所有樣本的遺傳分化有7.7%來自群體間，有92.3%來自群體內部，其結果與反映的結果一致。來自群體內近交系數(is)是0.574，群體間近交系數(it)為0.607。

表5 紫花風鈴木群體的AMOVA分析

2.2 遺傳結構分析

2.2.1 群體結構分析

用Structure軟件中基于貝葉斯聚類方法對紫花風鈴木群體的遺傳結構進行初步分析(圖1)，當K=2時最佳。此時可將12個紫花風鈴木群體分為2個不同類群(圖2)。其中類群1包括sf、ld、zc、zs共4個群體，彼此之間遺傳背景較為相似，尤其是ld和zs結合前文簡要收集的形態學信息也觀察到這2個群體表型性狀較接近；類群2包括ns、th、hn、jl、xm、jm、hd和fs共8個群體。

2.2.2 群體主坐標分析(PCoA)

主坐標分析大致將紫花風鈴木群體分為2個類群，類群A有sf、ld、zs、zc群體，類群B有ns、th、hn、hd、fs群體，而jm、jl、xm群體的個體分散在A、B類群中，但大多數個體分布在類群B中(圖3)。主坐標分析中個體位置越近說明親緣關系較近，紫花風鈴木不同群體的個體間存在相互交叉, 說明來自不同群體的個體間可能存在較近的親緣關系。主坐標分析結果與Structure結構分析的結果基本一致，在Structure結構分析中jm、jl、xm則與ns、th、hn、hd、fs群體歸屬一類。但結合形態學特征來看，類群與形態特征之間并沒有明顯的關系，不同形態特征的群體被分為同一類。

圖1 基于△K=mean(|L*(K)|)/sd(L(K))準則選擇K值

圖2 紫花風鈴木群體的遺傳結構圖

2.2.3 群體聚類分析

應用NJ聚類法對12個紫花風鈴木群體基于Nei’s遺傳距離進行群體聚類分析，可劃分為2個類群(圖4)，第一類包括sf、ld、zs、zc、xm、jl、jm群體，來自佛山、廣州、中山、深圳和江門；第二類包括ns、th、hn、hd、fs，來自廣州、惠州和佛山。這與Structure結構分析和主坐標分析的結果相近,均可被分為2個群體。xm、jl、jm這3個群體在不同的分析方法中歸在不同的類群里，說明紫花風鈴木遺傳距離與地理距離之間可能無顯著相關性。

3 結論和討論

生物的遺傳多樣性是物種多樣性和生態系統多樣性的基礎，也是生物多樣性的基礎。一般情況下，狹義遺傳多樣性側重于描述物種之間的遺傳變異。豐富的遺傳多樣性是物種適應環境變化的物質基礎, 物種為了適應環境變化而進化, 遺傳變異與進化相伴相生。變異的豐富度越大意味著物種的遺傳多樣性越高, 表明物種適應能力越強。評價物種遺傳多樣性水平，可以從形態學或DNA分子等角度切入研究[26–27]，而隨著分子標記技術的發展, 其在物種鑒定、種群遺傳多樣性研究及物種起源等方面得到了廣泛的應用[28]。相比于使用形態學評價遺傳多樣性，DNA分子水平分析受環境影響較小，穩定性高，結果更為可靠[29]。而群體遺傳多樣性主要分析和把握群體內和群體間的遺傳多樣性分布情況，可以用來衡量種群的數量變化、遺傳變異、生態習性等情況[26–27,30–31]。

圖3 紫花風鈴木群體的主坐標分析。黃色和藍色圓圈分別為類群A和類群B。

圖4 基于Nei’s遺傳距離的紫花風鈴木群體的NJ聚類分析

對紫花風鈴木遺傳多樣性開展DNA分子水平研究，能為科學利用和培育優良紫花風鈴木品種提供更多的參考。目前已經有多種分子標記技術在風鈴木類植物中應用于遺傳多樣性研究，葉綠體L-F和C序列標記和SNP分子標記用于對風鈴木類樹種進行分子水平的鑒種和分類，糾正采集樣本中風鈴木類樹種同名異物或異物同名的問題，同時也表明紫花風鈴木遺傳多樣性較為豐富，種下變異較多[6–7]。Collevatti等[15]對分布在巴西Altamiro de Moura Pacheco生態公園的4種風鈴木植物進行SSR分子標記研究，采集了75個紫花風鈴木的樣本,平均H和H分別為0.857和0.703，結合種群結構分析表明紫花風鈴木具有較高的遺傳多樣性, 但多態性水平較低。Alves等[16]采用8對ISSR引物對巴西A?u國家森林公園內30個紫花風鈴木樣本進行研究，共檢測出62個等位基因位點，為0.34～ 0.49，平均為0.43，表明ISSR標記的多態性為中等，能有效反映紫花風鈴木的遺傳多樣性。同時，當Nei’s遺傳距離為0.70時可將30份樣本劃分成12個群體，但Shannon指數僅為0.52，說明多樣性指數較低。

一般認為>0.5時該標記是高度多態的；為0.25～0.5時具有中度多態；<0.25時為低多態性的[32]。本研究中9對引物的為0.529～0.913，說明具有高度多態性，比Collevatti等[15]基于SSR分子標記和Alves等[16]基于ISSR分子標記的紫花風鈴木樣本遺傳多樣性分析的多態性較高，說明篩選的9對引物可以用于對紫花風鈴木群體的遺傳多樣性研究。

本文采用9對SSR引物對來自12個群體的72份紫花風鈴木樣本進行遺傳多樣性分析，Shannon多樣性指數為1.964，H和H分別為0.775和0.310，表明紫花風鈴木具有豐富的遺傳多樣性，采集自深圳和江門的樣本群體遺傳多樣性相對較高，但均比Collevatti等[15]研究中的H和H偏小。H明顯大于H，說明供試紫花風鈴木樣本受到人為選擇或近交等因素的影響較大。李蓉蓉[6]的研究也表明，目前園林苗圃中存在紫花風鈴木和紅花風鈴木的雜交個體，這值得進一步去探究園林應用中的紫花風鈴木的雜交現象。

物種的群體遺傳結構受地理位置、生境環境等多種因素的影響。Ayala[33]對群體的遺傳分化程度進行了劃分，st為0～0.05時群體間遺傳分化很小, 可不考慮；st為0.05～0.15時群體間存在中等程度的遺傳分化；st為0.15～0.25時群體間遺傳分化較大；st大于0.25表明群體間有很大的遺傳分化。本研究中12個紫花風鈴木群體的st為0.077，表明群體的遺傳分化處于中等程度。AMOVA分析表明，紫花風鈴木遺傳變異僅有8%來自群體間，而大部分遺傳變異發生在群體內。而群體的基因流為0.941，小于1。本研究中的紫花風鈴木群體處于中等水平遺傳分化和低基因流，這主要與紫花風鈴木的引種與栽培繁殖方式有關。目前我國園林栽培應用的紫花風鈴木引種來源不一，情況較為復雜。本研究選取的紫花風鈴木樣本多栽種于道路或城市綠地中，每個群體的個體構成受到人為因素影響較大，并不是以自然更新為主形成的自然群體，群體遺傳分化規律性較弱。人們更側重選擇觀賞效果優良的個體栽種在一起，因此同一樣地采集的紫花風鈴木可能有多個引種來源。再加上園林應用中為了加快優良紫花風鈴木繁殖速度，常常采用嫁接、扦插等無性繁殖[10]手段，更延緩了紫花風鈴木遺傳分化速度。此外，由于本研究在收集樣本階段沒有記錄樣本對應植株是否為實生苗還是無性繁殖苗，因此若樣本中有來自實生苗個體組成的群體，其在苗圃繁育階段遺傳分化也可能受到紫花風鈴木傳粉方式的影響。紫花風鈴木授粉存在同株同花合子后自交不親和的現象，但可以進行同株異花傳粉自交[34]，紫花風鈴木簇生花相和花量大的特點也利于促進同株異花傳粉自交。其次，紫花風鈴木的花結構決定了其主要依靠具有長距離飛行能力且具有長喙的昆蟲進行傳粉[35]，因此對異株傳粉也有一定的限制。

依據Structure結構分析、主坐標分析以及聚類分析，均可將12個群體大致分為2大類群，相互補充，但與本研究中簡要提及的各群體形態學上的特征分類并沒有完全對應，因此日后對紫花風鈴木開展遺傳多樣性分析可以將分子研究結合更多細致的形態學指標如雌雄蕊的細部結構特征，進行更加全面的遺傳多樣性分析。這3種方法中，來自深圳的xm、jl以及江門的jm這3個群體在不同方法中被歸屬于不同的類群，在主坐標分析中還呈現散布的特征，總體而言分布規律并不顯著。推測這3個群體的個體存在種間雜交的可能，值得進一步探究。這也表明紫花風鈴木群體結構與地理分布并沒有完全統一，很可能還是因為不同地區的引種來源情況復雜的問題。本研究的不足之處在于選取的樣本數量相對較少，且集中在廣東。今后對紫花風鈴木開展遺傳多樣性研究和選育工作時，要進一步擴充取樣范圍和取樣數量，采集不同地區栽培種或有條件獲取原產地的樣本，為紫花風鈴木的優質種質資源收集、科學育種等提供更多有利的遺傳學數據。

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Genetic Diversity Analysis ofPopulations by SSR Markers

HUANG Zhiqing1,2, WU Linyuan1,3, GAO Xiaoyu1, DING Shifeng1, FENG Zhijian1*, QIN Xinsheng1, LIU Yitong2, XIAO Guankang1

(1. College of Forestery and Landscape Architecture, South China Agricultural University,Guangzhou 510642, China; 2. College of Ecological Engineering, Guangdong Eco-Engineering Polythenic, Guangzhou 510520, China; 3. School of Light Industry and Materials, Guangdong Vocational and Technical College, Foshan 528041, Guangdong, China)

,introduced from South America and Central America, had widely used as ornamental tree in southern China, which had rich germplasm resources. However, the resources of introduction is complex while the work of improved variety breeding is lagging. In order to reveal genetic variation ofpopulations, the genetic diversity and population genetic structure of 72 samples from 12 populations collected from 6 cities in Guangdong Province were analyzed. The results showed that a total of 123 alleles were amplified by 9 pairs of SSR primers with average PIC of 0.754, indicating that thegermplasm had high genetic diversity. All 12 populations ofalso had high genetic diversity, the average effective alleles between populations was 3.272, and the average Shannon information index was 1.159. AMOVA analysis showed that genetic differentiation among populations was relatively low, while that within populations was high. The overall genetic differentiation coefficient of populations was 0.077, which was in the medium degree. Based on the Structure analysis, PCoA analysis and NJ clustering analysis, 12 populations ofcould be divided into 2 groups, and the grouping results had certain similarity, indicating that the genetic structure of tested populations was not complex. These would provide a theoretical basis for the utilization of germplasm resources, genetic variation and scientific breeding for

; Genetic diversity; SSR marker; Genetic structure

10.11926/jtsb.4697

2022-07-07

2022-11-11

國家自然科學基金項目(31870699)；廣東省林業科技創新項目(2018KJCX030)資助

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31870699), and the Project for Forestry Science and Technology Innovation in Guangdong (Grant No. 2018KJCX030).

黃稚清(1995年生)，女，助理實驗員，從事野生植物資源利用與園林植物應用研究。E-mail: starlight0715@foxmail.com

* 通訊作者 Corresponding author. E-mail: fengzj@scau.edu.cn