羅伊氏乳桿菌富集有機硒轉化條件的研究

陳永旭，孔慶輝，窮達卓瑪，田發益

（西藏農牧學院動物科學學院，林芝 860000）

硒元素在自然界中以有機態和無機態的形式存在，是機體所必需的微量元素［1］，硒能夠增強機體的免疫力，并具有抗癌、抗氧化作用［2］。其中無機硒有毒性作用且難以吸收，而有機硒或零價態的單質硒相對于無機硒來說有著較高的吸收利用率［3-5］。目前有兩種途徑合成有機硒，一種是人工合成，另一種是生物轉化。但由于人工合成的成本高、生產工藝復雜，且吸收利用率低，在實際生產中容易受到限制，而生物轉化法合成工藝簡單、成本低廉且轉化率相對較高。運用生物轉化法把無機硒轉化為有機硒后，可使其毒性降低并能顯著激發免疫反應，是一條安全有效的途徑［6］。因此，很多研究者選擇利用微生物的富集作用來合成有機硒。

動物機體攝入無機硒后，能被組織吸收利用轉化為多種不同功能形式的有機硒。王菲［7］的研究表明，吸收利用的硒主要以硒蛋白的形式存在于機體內，而多數硒蛋白是由硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸組成的。Verma 等［8］從動物的組織和器官中檢測出13 種含硒蛋白，其中硒蛋白M 可參與調節體重和能量代謝。硒蛋白P還原能力很強，能夠清除機體內的自由基，保護肝臟免受壞死和脂質過氧化［9］。在細菌培養物中也發現了多種含硒酶：硫解酶、甘氨酸還原酶和黃嘌呤脫氫酶等，其中谷胱甘肽過氧化物酶能降低細胞中的H2O2，減少血液及腸道中的過氧化物［10-13］。由此可見，硒蛋白對機體調節有一定的幫助。目前，在微生物富集轉化無機硒的研究中，酵母通常作為首選載體［14］。但研究表明，用酵母富集轉化硒時，主要產生硒代蛋氨酸（SeMet），其會非特異性地結合到蛋白質中。多種研究發現，乳酸桿菌能將硒轉化為硒代半胱氨酸，可作為一種有機硒源用于富有機硒動物飼料添加劑使用。

羅伊氏乳桿菌屬于厚壁菌門（Firmicutes），芽孢桿菌綱（Bacilli），乳桿菌目（Lactobacillales），乳桿菌科（Lactobacillaceae），乳桿菌屬（Lactobacillus），是革蘭陽性菌，是一種過氧化氫酶陰性、不運動、不產芽孢、專性異型發酵細菌［15］。研究表明，羅伊氏乳桿菌幾乎在任何脊椎動物和哺乳動物的腸道內都能被發現，其耐酸、耐膽鹽，可通過口服到達小腸內并黏附在小腸壁，是具有益生功效的腸道益生菌［16］。羅伊氏乳桿菌能夠轉化甘油并產生羅伊氏菌素（Reuterin），大多數乳酸菌分泌的細菌素或類細菌素，僅對種屬相近的部分細菌起抑制作用，而羅伊氏菌素是一種天然的廣譜抑菌物質，由環狀二聚物、3-羥基丙醛的單體和水合物混合組成，在水溶液中存在動態平衡［17］。羅伊氏菌素可以有效抑制革蘭陽性菌、陰性菌以及霉菌的生長［18］，能作為細菌抑制劑［19］。用羅伊氏乳桿菌轉化無機硒，可在一定程度上保障富集有機硒產品的安全性［20］。

羅伊氏乳桿菌能夠把無機硒轉化為有機硒，從而降低硒的毒性，提高硒的利用率；羅伊氏乳桿菌是益生菌，它產生的羅伊氏菌素是天然廣譜抑菌物質，能改善消化道的微環境。本研究以羅伊氏乳桿菌為介質，通過篩選其對硒的耐受性和最高轉化力，以期為富有機硒飼料添加劑產品的規?；_發提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

羅伊氏乳桿菌，由西藏農牧學院動物營養與飼料實驗室從藏豬消化道內分離并鑒定。

1.2 改良的MRS培養基

組成成分：大豆蛋白胨114.67 g、酵母浸粉38.22 g、麥芽糖5.06 g、磷酸氫二鉀2.0 g、葡萄糖10.13 g、紅糖20.25 g、乙酸鈉7.5 g、蜂蜜5 mL、七水硫酸鎂0.098 g、檸檬酸氫二銨2.0 g、硫酸錳0.03 g、吐溫-80 1 mL、瓊脂粉（用于固體培養）15.0 g、無菌蒸餾水1 000 mL。配置好后，121℃高壓滅菌30 min。

主要的優化改良措施：氮源改用大豆蛋白胨，并增加了用量，去除了牛肉粉；碳源增加了麥芽糖、紅糖及蜂蜜，減少了葡萄糖的用量。

1.3 儀器及試劑

UV-5200 型紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司；SF-CJ 垂直單向流雙人凈化工作臺，鄭州南北儀器設備有限公司；TOMY SX-500 自動滅菌鍋，日本Tomy Digital Biology 公司；Eppendorf 5810R高速冷凍離心機，艾本德（上海）國際貿易有限公司。

亞硒酸鈉，乙二胺四乙酸二鈉，3，3’-二氨基聯苯胺（3，3’-DAB），甲苯，甲酸，氫氧化鈉，以上試劑均為分析純。

1.4 試驗方法

1.4.1 羅伊氏乳桿菌富有機硒培養

參照張雪梅［21］、Krzywonos 等［22］及Elsayed 等［23］的方法，對培養基中葡萄糖、蛋白胨等主要成分進行優化，來提高菌體質量及有機硒轉化率。為提高菌種活力，將置于低溫冰柜的羅伊氏乳桿菌放到40～50℃水浴中解凍，并接種至改良的MRS 液體培養基中，置于37℃恒溫培養箱中培養24 h，連續活化3代，作為菌種。將亞硒酸鈉分別加入到滅菌過的MRS 培養液中，制成不同質量濃度（0、20、40、60、80、100、120 μg/mL）的含硒MRS 培養液。將對數期的羅伊氏乳桿菌按1%的接種量，接入各個不同質量濃度的亞硒酸鈉MRS 培養液中，設置搖床溫度為37℃，培養24 h。5 000 r/min 離心10 min，記錄菌落顏色，將不同濃度的亞硒酸鈉菌液，用漩渦振蕩器混勻后，進行MRS 瓊脂平板涂布，每組3個重復，最后計算菌落數。

1.4.2 標準溶液的配制

首先配制6 μg/mL的硒標準溶液，5 g/100 mL EDTA-2Na 溶液和0.5%3，3’-二氨基聯苯胺溶液。然后準確吸取0，1，2，3，4，5 mL分別加到50 mL的容量瓶中，加蒸餾水至10 mL，再加入1 mL 配制好的EDTA-2Na溶液，振蕩搖勻后，滴加鹽酸調節pH 值至2～3，再各加4 mL 0.5% DAB 溶液，振蕩搖勻，置于暗處反應30～50 min。反應時間結束后，用10%NaOH 調節pH值至6～7，再加入6 mL 甲苯充分振蕩，然后靜置，等明顯分層后，吸取甲苯層加到比色皿中，設置紫外分光光度計的波長為420 nm，測量吸光度，繪制標準曲線。

1.4.3 羅伊氏乳桿菌富有機硒轉化效率的測定

將培養24 h 后的不同質量濃度的亞硒酸鈉MRS培養基，5 000 r/min 離心15 min，收集菌體并用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌兩次。采用硝酸-高氯酸混合液濕法消化。在5 mL 的混合液中過夜，然后在80℃的溫度下加熱，直到液體澄清，使各形態的硒轉化為硒單質，即可進行硒含量測定。

采用3，3’-二氨基聯苯胺分光光度法檢測硒含量。首先，硒與3，3’-DAB 在酸性條件下會生成黃色苤硒腦絡合物；其次，在中性環境下形成的絡合物，加入甲苯可以很好地把硒元素萃取出來［24-25］，這時在420 nm 處能測量出較好的吸光度；最后，通過標準曲線即可算出硒濃度。

1.4.4 有機硒轉化率的計算

有機硒轉化率=菌體中有機硒的含量/加入的硒總量。

1.4.5 有機硒轉化量的計算

有機硒轉化量（μg/g）=菌體內有機硒的含量/細菌的干質量。

1.5 數據處理

采用SPSS 26.0 進行數據的差異顯著性分析，結果以平均數±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

利用UV-5200 型紫外分光光度計在420 nm 處測亞硒酸鈉標準溶液的吸光度。以亞硒酸鈉濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線。如圖1 所示，標準曲線的回歸方程為Y=0.053 5X-0.003 8，決定系數R2=0.998 1。

圖1 標準曲線繪制

2.2 不同硒濃度對羅伊氏乳桿菌的影響

由表1 可知，亞硒酸鈉的質量濃度小于60 μg/mL時，菌落數變化較小，菌體顏色為乳白色，此時無機硒未對羅伊氏乳桿菌產生毒性作用、菌體正常吸收轉化無機硒。當亞硒酸鈉的濃度大于80 μg/mL 時，菌落數明顯減少，菌落顏色開始變為紅色。無機硒對羅伊氏乳桿菌產生毒性作用，抑制了菌體的生長，羅伊氏乳桿菌通過自身的調節，把亞硒酸鈉轉化為紅色的單質硒析出菌體表面，降低毒性作用。當亞硒酸鈉的濃度為100 μg/mL 時，與其他各處理組均出現極顯著差異（P＜0.01），此時亞硒酸鈉的轉化量最高。

表1 不同硒濃度對羅伊氏乳桿菌的影響

當亞硒酸鈉濃度小于80 μg/mL 時，隨著亞硒酸鈉濃度的升高，每克菌體轉化硒的量也逐漸增加；當亞硒酸鈉濃度為100 μg/mL 時，硒轉化量達到最高，為4.40 mg；當亞硒酸鈉濃度在120 μg/mL 時，菌體自身對無機硒的調節能力達到上限，無機硒對菌體的毒性作用增強，羅伊氏乳桿菌增殖能力下降，轉化硒的能力減弱。

由圖2 可知，當亞硒酸鈉濃度小于80 μg/mL 時，每克菌體對亞硒酸鈉的轉化效率略有上升趨勢，但無顯著變化，說明羅伊氏菌在此亞硒酸鈉濃度范圍內合成的硒蛋白保持穩定狀態。當亞硒酸鈉濃度達100 μg/mL時，亞硒酸鈉的轉化效率最高，達13.3%，說明隨著菌體內硒蛋白合成量的增加，促進了羅伊氏乳桿菌的增殖。但在亞硒酸鈉濃度為120 μg/mL 時，亞硒酸鈉對羅伊氏乳桿菌的毒性效果增強，轉化效率反而低于濃度為100 μg/mL時。

圖2 不同亞硒酸鈉濃度對菌體轉化硒效率的影響

3 討論

本試驗富集有機硒所用的羅伊氏乳桿菌為益生菌，它普遍分布在動物的腸道內，并且對腸黏膜有著很強的黏附力，能夠改善腸道菌群分布，抑制有害菌定植，減少微生物從腸腔到腸外組織的轉移，加強腸道物理屏障，也可通過產生抗菌分子，抑制病原微生物的定植，還可通過重塑宿主腸道中的微生物群組成減少促炎因子的產生、促進調節性T 細胞的發育，進而保護宿主的腸道免疫系統［26］。Chen 等［27］認為，羅伊氏乳桿菌產生的主要抗菌因子是羅伊氏菌素（Reuterin），其主要是一個由3-羥基丙醛（3-hydroxypropionaldehyde，簡稱3-HPA）的單體、水合物和環化二聚體組成的混合物，是一種廣譜抗菌的非蛋白質類物質，能廣泛抑制革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌和病原蟲等的生長。羅伊氏乳桿菌是當前微生物中產羅伊氏菌素較強并且耐受力最高的菌種，作為益生菌，它產生的羅伊氏菌素也對機體腸道健康有很大益處。

為了提高羅伊氏乳桿菌的活菌數，本試驗借鑒了張雪梅等［21］對羅伊氏乳桿菌優化后的營養物質成分和培養條件，對MRS 培養基進行了改良，以提高菌體質量和單位體積內對有機硒的轉化量。由本試驗結果可知，當亞硒酸鈉的濃度高于80 μg/mL 時，菌體開始出現紅色，并且亞硒酸鈉的濃度越高，顏色越深。有研究指出，乳酸菌可通過自身調節化解硒的毒性，除了將富集的一部分硒轉化為各種形態的有機硒外，還會將另一部分還原成零價態的單質硒，即溶液中的紅色物質為單質硒［28］。孫會輕等［29］通過對古尼蟲草的富硒研究發現，培養過程中，硒濃度大于7 μg/mL時，古尼蟲草對硒的富集作用會轉為病理性，對生物量和富集硒的轉化效率都會極顯著下降。劉韞濤等［30］的試驗證明，真菌在硒濃度高于200 μg/mL 時，自身會產生毒性，影響生長。所以當菌體變紅時，說明有單質硒轉化出來，但同時也會伴隨著有機硒的轉化。因此，要在硒添加量和轉化量之間找到平衡。本試驗結果表明，菌株的最適亞硒酸鈉濃度為100 μg/mL，此時羅伊氏乳桿菌轉化的有機硒量最高，達4.40 mg/g。

動物體內的硒大部分以含硒酶和含硒蛋白兩種形式存在，硒的攝入能顯著上調細胞中基因SELO、SELP、SELES、SELT、SELW、Gpx2、TrxR1 和Sep15 等多種硒蛋白的表達，從而增強免疫細胞治療的抗腫瘤效果。硒酶中的磷脂氫過氧化物谷胱甘肽過氧化物酶（PHGPx），是機體內重要的過氧化物分解酶，屬于膜結合酶，發揮作用的方式是抑制膜磷脂的過氧化反應。另外，硒蛋白中的硒蛋白I 能夠參與磷脂生物合成，而硒蛋白O 含有基礎序列的線粒體蛋白，是氧化還原功能的基礎模板。目前研究發現的有機硒，它們均對機體有正向調節作用。通過羅伊氏乳桿菌對硒的富集作用，使得硒的攝入變得安全、有效。本試驗后續還對富集有機硒的羅伊氏乳桿菌進行了安全性驗證，每天給兔子飼喂其最大的硒耐受量，最終確定了此濃度下培養出的富有機硒羅伊氏乳桿菌，不會對兔子的健康產生不良影響。本研究組目前正對牦牛進行安全性試驗，從2023 年8 月至10 月期間，牦牛生長良好，沒有出現消化道疾病等，試驗還在持續進行中。

本試驗主要是對羅伊氏乳桿菌富集有機硒的能力進行了研究，對于羅伊氏乳桿菌所轉化硒蛋白的種類，還有待進一步研究。

4 結論

通過本次試驗發現，隨著亞硒酸鈉濃度的提高，羅伊氏乳桿菌的菌落逐漸減少，表明過高的亞硒酸鈉濃度會抑制該菌的生長；當亞硒酸鈉濃度大于80 μg/mL時，菌體顏色開始變紅，開始析出單質硒，表明羅伊氏乳桿菌的轉化能力達到峰值，且對硒有較高的耐受性，當亞硒酸鈉培養濃度為100 μg/mL 時，有機硒轉化量最大，達4.40 mg/g，轉化率最高，為13.3%。