豆科綠肥作物害蟲苜蓿葉象甲的鑒定與預警

孫佳琦 張蕾 侯陽陽 謝殿杰 劉悅秋 江幸福

摘要

苜蓿葉象甲Hypera?postica是我國苜蓿Medicago?sativa上的重要害蟲，主要分布在新疆、甘肅、內蒙古等畜牧業主產區。作者2023年4月在安徽省蕪湖市南陵縣調查紫云英Astragalus?sinicus蟲害時，在當地紫云英留種田中發現疑似苜蓿葉象甲嚴重為害紫云英莖葉，對紫云英生長和產量產生嚴重影響。為明確該種害蟲的分類地位，在田間收集了幼蟲并帶回室內飼養，在對幼蟲和成蟲形態學初步鑒定的基礎上，采用DNA條形碼進行了分子鑒定，最終確定為苜蓿葉象甲，且發現該地區苜蓿葉象甲種群存在明顯的種內分化。結合苜蓿葉象甲的生物學與生態學特性，對其在我國的傳播及其對綠肥作物的危害做出了預警，并提出了防治建議。

關鍵詞

苜蓿葉象甲;?豆科綠肥;?形態學鑒定;?分子鑒定;?預警與防治

中圖分類號：?S?433.5

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2023527

Identification?and?early?warning?of?Hypera?postica?（Coleoptera：?Curculionidae），?a?severe?pest?of?legume?cover?crops

SUN?Jiaqi1#，?ZHANG?Lei1#，?HOU?Yangyang1，?XIE?Dianjie1，?LIU?Yueqiu2，?JIANG?Xingfu1*

（1.?State?Key?Laboratory?for?Biology?of?Plant?Diseases?and?Insect?Pests，?Institute?of?Plant?Protection，?

Chinese?Academy?of?Agricultural?Sciences，?Beijing?100193，?China;?2.?College?of?Landscape?Architecture，?

Beijing?University?of?Agriculture，?Beijing?102206，?China）

Abstract

The?alfalfa?leaf?weevil，?Hypera?postica，?is?an?important?pest?of?alfalfa?crops?in?China，?particularly?in?major?livestock?production?regions?such?as?Xinjiang，?Gansu，?and?Inner?Mongolia.?During?an?investigation?of?pest?causing?damage?to?Astragalus?sinicus?in?Nanling?county，?Wuhu?city，?Anhui?province，?suspected?traces?of?;H.postica?were?discovered?in?local?seed?fields，?where?the?stems?and?leaves?of?A.sinicus?were?severely?damaged?by?the?insect.?To?clarify?the?classification?status?of?this?pest，?the?larvae?were?collected?and?brought?back?to?the?laboratory?for?rearing.?Preliminary?identification?of?both?larvae?and?adults?was?conducted?based?on?morphological?characters，?and?then?molecular?identification?was?performed?using?DNA?barcodes，?confirming?the?insect?as?the?alfalfa?leaf?weevil，?H.postica.?Furthermore，?it?was?found?that?there?were?significant?intraspecies?variations?within?the?local?population.?According?to?the?biological?and?ecological?characteristics?of?H.postica，?a?warning?has?been?issued?regarding?the?potential?spread?of?this?pest?in?China?and?its?detrimental?impact?on?cover?crops，?and?insect?pest?control?suggestions?were?also?proposed.

Key?words

Hypera?postica;?legume?cover?crops;?morphological?identification;?molecular?identification;?early?warning?and?control

苜蓿葉象甲Hypera?postica是全球苜蓿Medicago?sativa上重要害蟲之一，主要分布在歐洲各國、美國、加拿大、墨西哥和日本等地［12］。1904年美國首次發現該蟲傳入為害［3］，20世紀60年代苜蓿葉象甲在美國苜蓿上成災，造成苜蓿種植面積大幅縮小，僅弗吉尼亞州苜蓿種植面積由1961年的4.25萬?hm2縮減至1967年的1.34萬?hm2?［4］。大發生年份造成經濟損失達25億美元［56］。我國苜蓿葉象甲主要分布在新疆、甘肅和內蒙古等地，曾對我國苜蓿生產和畜牧業造成毀滅性危害［78］。苜蓿葉象甲不僅為害苜蓿，還可取食豆科、十字花科、禾本科、菊科、薔薇科等植物［9］。全球氣候變化與作物種植結構調整是昆蟲種群分布發生變化的關鍵因素［10］。依據氣候數據對我國苜蓿葉象甲的適生區進行分析發現，從2010年至2020年苜蓿葉象甲在我國的適生區出現西擴南移的擴散態勢［9］。當前，隨著國家土地質量提升行動的開展和可持續農業發展需求，我國綠肥作物特別是豆科綠肥的種植面積不斷擴大，給苜蓿葉象甲提供了潛在的寄主植物資源［1112］，這也預示著多食性害蟲對綠肥作物存在潛在危害的風險。

紫云英Astragalus?sinicus是我國重要的豆科綠肥作物，近年來在我國江淮流域和沿江江南等地大力推廣種植，目前在安徽、江蘇、山東等地種植面積超67萬?hm2。長年連續種植造成病蟲害發生加劇，特別是在紫云英種子生產田，蟲害是造成其種子減產的重要原因［12］。在國家綠肥產業技術體系支持下，2023年3月作者在安徽省蕪湖市南陵縣弋江鎮調查紫云英蟲害時，在紫云英留種田中發現疑似苜蓿葉象甲，且嚴重為害紫云英莖葉，估算為害面積約為66.67?hm2（圖1）。為明確紫云英這一重發害蟲的分類地位，作者在田間收集了幼蟲并帶回室內飼養，通過形態學和分子生物學（DNA條形碼）對其進行物種鑒定，現將結果報道如下。

1?材料與方法

1.1?供試蟲源

2023年3月25日在安徽省蕪湖市南陵縣弋江鎮（30°51′?N，?118°27′?E）紫云英田采集象甲幼蟲，并將幼蟲帶回實驗室置于（22±1）℃，?相對濕度55%～70%的養蟲室內使用紫云英苗飼養。

1.2?形態鑒定

使用體視顯微鏡（SZX7，?OLYMPUS）對象甲幼蟲和成蟲進行圖像采集，參考《苜蓿病蟲害識別與防治》［13］以及有關苜蓿葉象甲形態特征報道的文獻等資料，對幼蟲和成蟲的形態進行比對鑒定，以初步確定物種名稱。

1.3?DNA條形碼鑒定

使用EasyPureGenomic?DNA?Kit（EE10112，?北京全式金生物技術股份有限公司），按照說明書單頭提取象甲幼蟲的基因組DNA，共提取3頭。提取后使用NanoDrop?One/OneC?（Thermo）超微量紫外分光光度計檢測DNA的濃度和純度，以保證提取的DNA質量完好，DNA樣品-20℃保存用于后續PCR擴增。采用COⅠ基因通用引物LCO1490（5′

GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG3′）和

HCO2198

（5′TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA3′）擴增長度為658?bp的COⅠ基因部分片段［14］。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

PCR反應體系為：2?×?EasyTaq?PCR?SuperMix?12.5?μL，20?μmol/L上下游引物各0.5?μL，DNA模板1?μL，超純水10.5?μL。擴增條件為：95℃?5?min;94℃?40?s，50℃?45?s，72℃?1?min，共35個循環;72℃?10?min。PCR產物使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，挑選具有單一條帶的PCR產物使用上下游引物進行雙向測序，測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。測序結果由SeqMan軟件進行拼接并手工校正后在NCBI數據庫中BLAST以確定序列為目的基因序列并完成物種鑒定。

1.4?系統進化分析

從NCBI數據庫中搜集前人提交的苜蓿葉象甲COⅠ基因序列（KY796624、MK891455、OL664242、KY796640）和其5個近緣種H.conmaculata?（KC783982）、H.striata?（KM441151）、H.viciae?（KU912420）、H.venusta?（KU912617）、Brachypera?dauci?（KJ964617）的COⅠ基因序列。使用DNAMAN軟件將本研究的苜蓿葉象甲COⅠ基因序列與搜集到的象甲COⅠ基因序列進行比對，獲得各物種間的相似性。使用MEGA?11軟件對所有序列進行比對分析，去除冗余序列后計算遺傳距離，再利用近鄰相接法（neighborjoining，?NJ）構建系統發育樹，并設置bootstrap抽樣1?000次進行檢驗，其余參數設為默認值。使用MEGA?11軟件分析本研究苜蓿葉象甲COⅠ基因的核苷酸及其編碼的氨基酸組成。

2?結果與分析

2.1?形態學特征分析與鑒定

本研究的幼蟲和成蟲與《苜蓿病蟲害識別與防治》［13］、Pellissier等［15］和Germann［16］報道的苜蓿葉象甲形態基本一致（圖2）。成蟲：黃褐色，體長4.4～6.6?mm，寬2.0～2.6?mm，頭部黑褐色，喙細長呈管狀，觸角11節，膝狀，端部膨大。前胸背板有2條

較寬的褐色縱條紋，中間夾有1條細的灰線。鞘翅上有3段深褐色縱條紋，中間的1段縱條紋最長。足細長，腿節稍粗，上有小齒（圖2a）。老熟幼蟲：體長8～10?mm，深綠色，頭黑色，背部中央具有1條從頭部延伸至尾部的深白色背線，兩側各有1條淺白色縱線。幼蟲無足，行動是靠腹面剛毛的瘤狀突迅速爬行，幼蟲具假死習性，受驚后蜷縮成“C”形（圖2d）。幼蟲易與三葉草葉象甲H.punctata幼蟲混淆，但三葉草葉象甲幼蟲頭為棕褐色且背部中央白線邊緣有粉紅斑點（圖2g）。

成蟲和幼蟲均可取食為害紫云英。成蟲取食紫云英葉片或莖稈并產卵于莖稈內。初孵幼蟲在莖稈中蛀食為害，形成黑色蟲道;2齡時鉆出莖稈取食葉芽和花芽，3齡和4齡為害最為嚴重，大量取食枝葉，僅殘留葉脈，影響紫云英光合作用、干物質積累及其固氮效果，使紫云英產量及其生態效應大幅降低（圖1a）。

2.2?DNA條形碼鑒定與分析

對測序的3條序列進行校正，得到長度均為658?bp的序列，在NCBI數據庫中進行BLAST發現，象甲NL1、NL3與數據庫中苜蓿葉象甲的COⅠ基因序列（登錄號：KY796624）相似性為100%;而象甲NL2與數據庫中另一個苜蓿葉象甲的序列（登錄號：KY796640）相似性為100%;BLAST結果進一步證實了本研究中的象甲為苜蓿葉象甲（圖3）。

2.3?分子系統進化分析

苜蓿葉象甲NL1和NL3與Hypera?conmaculata、H.striata、H.viciae、H.venusta、Brachypera?dauci的COⅠ基因核苷酸序列的相似性依次均為90.43%、87.39%、89.67%、87.69%、85.71%，遺傳距離分別均為0.104、0.144、0.112、0.137、0.161;而NL2與這5種近緣種的COⅠ基因核苷酸序列的相似性依次為91.19%、88.45%、90.12%、89.51%和86.47%，遺傳距離分別為0.095、0.129、0.107、0.116、0.152（表1）。而NL1和NL3間的遺傳距離和相似性分別為0和100%，且兩者與NL2的遺傳距離和相似性分別均為0.061和94.22%，NL1、NL2和NL3的兩兩間遺傳距離均遠小于其與5種近緣種的，而相似性均遠大于其與5種近緣種的（表1）。

1）?表中左下數據為8個象甲COⅠ基因序列的平均遺傳距離，右上為8個象甲COⅠ基因序列的相似性（%）。

The?data?in?the?lower?left?half?of?the?table?are?the?average?genetic?distance?of?the?COⅠ?gene?sequences?of?eight?weevils.?The?data?in?the?upper?right?half?of?the?table?show?the?similarity?（%）?of?the?COⅠ?gene?sequences?of?eight?weevils.

采用NJ法對本研究中3條苜蓿葉象甲的COⅠ基因序列與NCBI數據庫中的4條苜蓿葉象甲COⅠ基因序列和5條近緣種COⅠ基因序列構建系統進化樹（圖4）。由系統進化樹可知，本研究的苜蓿葉象甲與同屬的近緣種明顯地區分開來，本研究的苜蓿葉象甲與其他學者提交的苜蓿葉象甲單獨聚為一大支，這進一步表明本研究的象甲為苜蓿葉象甲。此外，有趣的是本研究的3條苜蓿葉象甲序列聚在不同支上，說明本研究采集的苜蓿葉象甲可能存在明顯的種內分化（圖4）。

本研究中3條苜蓿葉象甲COⅠ基因的核苷酸序列比對結果顯示NL1、NL2、NL3三者間的相似性為98.08%，3條序列間共存在38個單核苷酸多態性（single?nucleotide?polymorphism，?SNP）位點，所有位點總突變數為25，其中發生轉換的位點數為20，發生顛換的位點數為5，轉換/顛換偏倚率為3.8，所有序列堿基平均含量分別為A?30.9%、G?15.6%、C?16.1%、T?37.4%（圖5）。

本研究中3條658?bp的苜蓿葉象甲COⅠ基因編碼的氨基酸序列比對結果顯示序列均編碼219個氨基酸，相似性高達99.85%，其中在第166個氨基酸位點出現了變異，NL1與NL3在該位點編碼蘇氨酸（threonine），NL2在該位點編碼丙氨酸（alanine）。

3?討論

3.1?警惕苜蓿葉象甲在我國進一步傳播為害

氣候變化顯著影響苜蓿葉象甲在我國的適生區變化［9］，2010年苜蓿葉象甲在我國適生區為西北、東北、華北、華中和西南等大部分地區，2020年其適生范圍已西擴至西藏中南部，高度適生范圍南擴至33°N，全國非適生區范圍減少5.02%。作物種植結構也能夠對害蟲種群分布產生巨大影響［10］。在國家綠肥產業技術體系的大力示范推廣下，南方稻田種植紫云英的面積逐年擴大，這在一定程度上為某些植食性昆蟲提供了食物資源［1112］。盡管周丹等［18］和浦杏琴等［19］分別報道了苜蓿葉象甲為害南方稻田紫云英及其防治方法，但均側重于防治藥劑的篩選，而忽視了害蟲的物種鑒定與種內分化。由于苜蓿葉象甲與同屬的H.temperei、H.postica、三葉草葉象甲等在形態特征上極為相似，易出現識別錯誤［1617］。特別是目前已有報道均指出我國苜蓿葉象甲主要分布在新疆、甘肅、內蒙古等西北牧區［7，9］。因此，明確南方稻田紫云英上相似物種十分必要。本研究通過形態學與分子鑒定相結合的方式首次明確了我國南方稻田紫云英重發害蟲為苜蓿葉象甲，確定了苜蓿葉象甲已經傳入我國南方并嚴重為害綠肥作物，拓展了對我國苜蓿葉象甲地理分布的認識，首次發現我國南方苜蓿葉象甲存在明顯的種內分化。

3.2?警惕苜蓿葉象甲對豆科綠肥作物造成危害與損失

苜蓿葉象甲是一種重要的畜牧業害蟲，主要為害苜蓿、紅三葉草Trifolium?pratense等豆科植物、也可取食禾本科、十字花科、菊科、薔薇科等植物，還能為害玉米Zea?mays和馬鈴薯Solanum?tuberosum等主糧作物［9］。歐洲和美國等西方國家主要指出了苜蓿葉象甲是苜蓿的重要害蟲，很少報道對紫云英的危害。而在日本，1982年發現苜蓿葉象甲為害紫云英，隨后迅速傳播成為紫云英的重要害蟲，嚴重威脅當地的蜂蜜產業［1，20］。根據浦杏琴等［19］的調查結果可知，2022年3月江蘇武進地區苜蓿葉象甲已嚴重為害紫云英和救荒野豌豆Vicia?sativa等。這恰好與同年3月作者在安徽南陵紫云英田觀察到的現象一致（圖1），表明苜蓿葉象甲已在我國南方綠肥作物田中廣泛分布并取食為害綠肥作物。這警示苜蓿葉象甲可能已成為豆科綠肥作物的重要害蟲，嚴重威脅綠肥生產及其應用，生產上需加以重視。

3.3?加強苜蓿葉象甲傳播途徑與監測預警研究

苜蓿葉象甲起源于歐洲、亞洲和非洲等舊大陸，而后通過多種方式引入美洲，現已遍布全球多個國家［2］。依據線粒體上兩段基因序列（COⅠCOⅡ、CyBND1）的差異，苜蓿葉象甲可以分為Western、Eastern、Egyptian、Xinjiang等4個品系，且品系間難以依靠形態特征區分［2122］。美國已分布有Western、Eastern和Egyptian品系，均由歐洲或亞洲引入;日本主要有Western和Egyptian品系，在這些國家中既有單一品系獨存的地域，也有兩個品系共存的地區［2324］。本研究的系統進化樹表明我國紫云英田苜蓿葉象甲存在明顯的種內分化，存在38個SNP位點，其中有25個為突變位點。通過對品系鑒定基因COⅠCOⅡ和CyBND1的測序與比對，我們發現本研究中NL1和NL3為Western品系，NL2為Egyptian品系（未發表），由于本次采樣的樣品較少和樣點單一，我國可能還存在未被發現的品系。值得注意的是，本研究在安徽南陵取樣的苜蓿葉象甲不是我國Xinjiang品系，表明其并非來源于新疆地區。由于苜蓿葉象甲在我國適生區廣袤，而這些適生區中是否存在苜蓿葉象甲及其品系組成等情況均不清楚，導致無法推測我國南方紫云英田中苜蓿葉象甲的來源地，可能源于國內其他地區也可能來源于境外。但依據Flanders［25］和李新芳等［26］的報道，并結合近年來我國苜蓿進口量逐年攀升等背景，推測本研究中NL2極大可能是由國外傳入。因此，探明全國適生區內苜蓿葉象甲的種群狀況對掌握該蟲的地理分布與擴散規律至關重要。同時要加強苜蓿葉象甲的監測預警，尤其在新疆、甘肅、內蒙古等高度適生區，需要進一步加強對其監測預警體系的建設。

3.4?加強苜蓿葉象甲的綜合防治

目前，我國南方紫云英已經出現苜蓿葉象甲局地暴發為害的趨勢，因此，豆科綠肥作物亟須進行害蟲監測與防治。具體防治方法可參考有關文獻報道。1）化學防治：在低齡幼蟲發生高峰期，每667?m2施用10%聯苯菊酯乳油20?mL，防治效果可達100%［1819］;或者采取2.5%高效氯氟氰菊酯乳油1?500倍、2.5%溴氰菊酯乳油2?000倍、48%毒死蜱乳油1?000倍、4.5%高效氯氰菊酯乳油1?500倍交替噴霧防治［27］。2）生物農藥防治：10%多殺霉素懸浮劑噴霧，施藥后3?d防效可達80%以上［28］。3）植物源藥劑防治：30%茶皂素水劑，施藥后3?d防效可達75%以上［28］。注意用藥時間，盡量提前施藥以減少對天敵昆蟲的負面影響［29］，藥劑應當交替使用，嚴禁在同一地塊連續使用同種農藥，以減緩抗藥性的產生［30］。

在生物防治方面，雖然有很多苜蓿葉象甲的寄生性天敵和病原菌，如短窄象甲姬蜂Bathyplectes?anurus［15］、苜蓿葉象姬蜂B.?curculionis［15］、姬蜂B.?stenostigma［15］、苜蓿嚙小蜂Oomyzus?incertus［31］、蟲瘟霉Zoophthora?phytonomi［32］、白僵菌Beauveria?bassiana［33］、蘇云金芽胞桿菌Bacillus?thuringiensis［34］等，但苜蓿葉象甲對這些生防因子的抵抗力因品系不同可能截然相反［35］。所以，探明全國苜蓿葉象甲的品系分布對其精準防治具有直接的現實意義。能夠依據當地苜蓿葉象甲的品系構成情況針對性地釋放生防因子，達到節本增效的目的。

參考文獻

［1］?OKUMURA?M.?Alfalfa?weevil?（Hypera?postica）??a?serious?pest?of?Chinese?milk?vetch?［J］.?Honeybee?Science，?1991，?12：?145150.

［2］?HSIAO?T?H.?Geographic?and?genetic?variation?among?alfalfa?weevil?strains?［M］∥?KIM?K?C，?MCPHERON?B?A.?Evolution?of?insect?pests：?pattern?of?variation.?New?York：?John?Wiley?&?Sons?Inc.，?1993：?311327.

［3］?TITUS?E?G.?The?alfalfa?weevil?［M］.?Bulletin?of?the?Utah?Agricultural?Experiment?Station，?1910，?110：?1772.

［4］?THOMASPATRICK?K.?Population?dynamics，?mortality?factors?and?pest?status?of?alfalfa?weevil?in?Virginia?［D］.?Virginia：?The?University?of?Virginia，?2000：?14.

［5］?IVAN?J?T，?GUTIERREZ?A?P，?LYONS?J?M.?Integrated?pest?management?for?alfalfa?hay?［M］.?California：?University?of?California，?1981：?56．

［6］?EDMINSTER?C，?MILLER?D，?MOUTRY?J.?American?alfalfa?［J］.?Animal?Science?Veterinary?Medicine，?1989，?18（4）：5861.

［7］?張學祖.?新疆苜蓿害蟲及其綜合防治［J］.?新疆農業科學，?1962，?5（4）：?160163.

［8］?張良，?張滋林，?趙莉.?苜蓿葉象甲的生活習性及防治［J］.?新疆農業科技，?2010（6）：?44.

［9］?吳志剛，?倪文龍，?張澤華，?等.?基于CLIMEX的苜蓿葉象甲在我國的適生區分析［J］.?中國農業大學學報，?2011，?11（6）：?99103.

［10］陸宴輝，?劉楊，?楊現明，?等.?中國農業害蟲綜合防治研究進展：2018年－2022年［J］.?植物保護，?2023，?49（5）：?145166.

［11］曹衛東，?包興國，?徐昌旭，?等.?中國綠肥科研60年回顧與未來展望［J］.?植物營養與肥料學報，?2017，?23（6）：?14501461.

［12］江幸福，?劉悅秋，?張蕾，?等.?綠肥害蟲發生與防控研究現狀與發展趨勢［J］.?植物保護，?2018，?44（5）：?6168.

［13］張澤華，?李彥忠，?涂雄兵，?等.?苜蓿病蟲害識別與防治［M］.?北京：?中國農業科學技術出版社，?2018.

［14］FOLMER?O，?BLACK?M，?HOEH?W，?et?al.?DNA?primers?for?amplification?of?mitochondrial?cytochrome?coxidase?subunit?Ⅰ?from?diverse?metazoan?invertebrates?［J］.?Molecular?Marine?Biology?and?Biotechnology，?1994，?3（5）：?294299.

［15］PELLISSIER?M?E，?NELSON?Z，?JABBOUR?R.?Ecology?and?management?of?the?alfalfa?weevil?（Coleoptera：?Curculionidae）?in?Western?United?States?alfalfa?［J/OL］.?Journal?of?Integrated?Pest?Management，?2017，?8（1）：?5.?DOI：?10.1093/jipm/pmw018.

［16］GERMANN?C.?Hypera?temperei?Hoffmann，?1958??first?discovery?of?the?western?alpine?element?in?the?Swiss?Alps?with?biological?details，?and?new?morphological?insights?（Coleoptera，?Curculionidae）?［J］.?Alpine?Entomology，?2021，?5：?512.

［17］Department?of?Crop?Sciences.?Insect?factsheets：?alfalfa?weevil?［EB/OL］.?（20150817）?［20231010］.?http：∥extension.cropsciences.illinois.edu/fieldcrops/insects/alfalfa_weevil/.

［18］周丹，?盛玉蓮，?朱龍粉，?等.?固氮作物紫云英苜蓿葉象甲藥劑篩選試驗初探［J］.?現代農藥，?2021，?20（2）：?5961.

［19］浦杏琴，?凃榮文，?朱龍粉.?武進地區苜蓿葉象甲的發生及防治藥劑篩選試驗初報［J］.?上海農業科技，?2022（6）：?137139.

［20］FAYASHIKAWA?S.?鹿児島県におけるアルファルファダコゾウムシの発生動向［J］.?植物防疫，?1999，?53（10）：?419422.

［21］ERNRY?S?J，?PRUESS?K?P，?DANIELSON?S?D，?et?al.?Molecular?differentiation?of?alfalfa?weevil?strains?（Coleoptera：?Curculionidae）?［J］.?Annals?of?the?Entomological?Society?of?America，?1996，?89（6）：?804811.

［22］BTTGER?J?A?A，?BUNDY?C?S，?OESTERLE?N，?et?al.?Phylogenetic?analysis?of?the?alfalfa?weevil?complex?（Coleoptera：?Curculionidae）?in?North?America?［J］.?Journal?of?Economic?Entomology，?2013，?106（1）：?426436.

［23］BUNDY?C?S，?SMITH?P?F，?ENGLISH?L?M，?et?al.?Strain?distribution?of?alfalfa?weevil?（Coleoptera：?Curculionidae）?in?an?intergrade?zone?［J］.?Journal?of?Economic?Entomology，?2005，?98（6）：?20282032.

［24］KUWATA?R，?TOLUDA?M，?YAMAGUCHI?D，?et?al.?Coexistence?of?two?mitochondrial?DNA?haplotypes?in?Japanese?populations?of?Hypera?postica?（Col.，?Curculionidae）?［J］.?Journal?of?Applied?Entomology，?2005，?129（4）：?191197.

［25］FLANDERS?K?L，?RADCLIFFE?B.?Alfalfa?IPM?［EB/OL］.?（20130304）?［20231010］.?http∥ipmworld.umn.edu/chapters/flanders.htm.