基于N-?；拾彼岜Ａ糁笖迪到y的代謝物色譜峰對齊方法

郝俊迪, 陳耀宇, 王彥真, 安 娜, 白沛蓉, 朱泉霏, 馮鈺锜,3*

(1. 武漢大學化學與分子科學學院, 湖北 武漢 430072; 2. 武漢大學公共衛生學院, 湖北 武漢 430071;3. 武漢大學免疫與代謝前沿科學中心, 湖北 武漢 430071)

代謝組學是生物醫學研究的重要工具,通過對生物體的代謝物分子表型進行表征,可以揭示生物體的生理狀態、代謝途徑的變化、調控機制以及與疾病之間的關聯性等[1-4]。液相色譜-質譜(LC-MS)具有高靈敏度、高選擇性和高覆蓋度等優點,是目前代謝組學分析研究的主流平臺[5-8]。然而,生物基質的復雜性以及實驗條件的微小變化,常常導致LC-MS分析數據中的保留時間(retention time, RT)和質譜響應出現漂移或波動,這可能會影響多批次代謝組學分析結果之間的可比性[9-12]。因此,在基于LC-MS的非靶向代謝組學工作流程中,色譜峰對齊是一個必不可少的步驟[13-15],其目的是將不同批次LC-MS分析得到的代謝物數據進行整合。準確的色譜峰對齊對于確保不同樣品之間代謝物數據的可比性和可靠性非常重要。

目前,已開發了多種峰對齊算法,其中應用較廣泛的有Correlation Optimized Warping算法[16]、Joint Aligner算法[17]和Kernel Estimation算法[18],這些算法可以有效地修正由于柱溫變化和生物樣品的微小差異引起的RT隨機偏移;然而,對于流動相組成、色譜柱和儀器條件變化等引起的RT系統偏移,現有峰對齊算法的修正能力有限[19-21]。在大規模代謝組學分析中,由于分析周期長、樣本量大,RT系統偏移的影響體現更加顯著。在這種情況下,如何有效修正RT的系統偏移,提高色譜峰對齊的準確率,是目前代謝組學分析研究面臨的一個重要問題[22-24]。

保留指數(retention index, RI)是針對一組參考校正物質而言的化合物相對保留時間值,已被廣泛應用于氣相色譜[25-27]。RI可以將不同色譜分析方法所得的RT歸一化,使得不同實驗室間RT數據具有可比性,有利于分析物的識別和鑒定[27-35]。本工作以一系列N-?；拾彼嵬滴?C2～C23)作為校正物,構建了適用于代謝組學分析的RI系統,以修正多批次LC-MS分析過程中RT的系統偏移?；诖?我們還建立了相應的色譜峰漂移校正模型(RI-based CPSC),以提高大規模代謝組學分析中峰對齊的準確性。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 6546 LC/Q-TOF液相色譜-質譜聯用系統(美國安捷倫科技公司),包括Agilent 1290 Infinity Ⅱ LC色譜系統和Agilent 6546 Q-TOF質譜儀;Thermo Fisher Scientific LTQ Orbitrap Elite液相色譜-質譜聯用系統(美國賽默飛世爾科技公司),包括UltiMate 3000 UHPLC色譜系統和Orbitrap Fusion Tribrid質譜儀。正構脂肪酸(C3～C23,附表S1, www.chrom-China.com)、分析物標準品(73種,附表S1)、甘氨酸(Gly)以及N-乙酰甘氨酸(Gly-C2)購自Sigma-Aldrich公司。氯甲酸甲酯、三乙胺(TEA)、四氫呋喃(THF)、氫氧化鈉(NaOH)、乙酸乙酯(EA)、鹽酸(HCl)、甲醇(MeOH)和甲酸購自國藥集團化學試劑公司。LC-MS級乙腈(ACN)購自武漢弗頓科技有限公司。人糞便樣品收集自5名健康男性,-80 ℃儲存。所有樣本采集均嚴格按照現行人體研究倫理準則進行,并經武漢大學倫理委員會批準(IRB2022001)。

1.2 樣品制備

糞便樣品的制備:將2.0 mL的MeOH加入到含有100 mg糞便的離心管中,渦旋3 min,超聲15 min后,10 000 g離心5 min,取上層清液,氮氣干燥。最后,使用200 μL ACN/H2O(1∶9, v/v)對干燥后的樣品進行復溶,進行LC-MS分析。

1.3 N-?；拾彼嵝Ｕ锏暮铣?/h3>

在100 mL圓底燒瓶中加入單個正構脂肪酸標準品(500 mg)和15 mL THF,并置于0 ℃低溫反應冷阱內。隨后,向圓底燒瓶中逐滴加入TEA(250 μL)和氯甲酸甲酯(250 μL),攪拌反應30 min后,加入10 mL的甘氨酸(200 mg)和NaOH(100 mg)混合水溶液,繼續反應30 min。反應結束后,使用旋轉蒸發儀去除THF,并滴加2 mol/L HCl水溶液(10 mL)使溶液呈酸性。對于N-?；拾彼?C8～C23)產物,加入HCl后有白色沉淀生成,通過過濾、洗滌(3 mL水)和干燥,即可獲得白色粉末狀固體產物;對于N-?；拾彼?C3～C7)產物,分別用EA(20 mL×3)進行萃取,合并萃取液,并旋蒸除去EA,得到白色粉末狀固體。將購買與合成所得的N-?；拾彼?C2～C23)配制為500 μg/L的ACN溶液,儲存于-20 ℃冰箱中。

圖 1 (a) N-?；拾彼嵬滴锏暮铣杉?b) 22種N-?；拾彼?C2～C23)混合液在LC-MS正、負離子模式下的提取離子流色譜圖Fig. 1 (a) Synthesis scheme of N-acyl glycine homologues and (b) overlapping extracted ion chromatograms of a mixture of 22 N-acyl glycine (C2-C23) standards analyzed by LC-MS in positive and negative ion modes THF: tetrahydrofuran; THF-aq: a mixture of tetrahydrofuran and water (3∶2, v/v); RT: retention time. Dashed line: linear gradient elution.

1.4 數據處理

LC-MS數據采集使用MassHunter Workstation Version B.06.01 SP1軟件(美國安捷倫科技公司)或Thermo Xcalibur 2.1軟件(美國賽默飛世爾科技公司)。使用Proteo Wizard msConvert軟件將原始數據轉換為mzML格式。數據采集時間點用自行開發的RI-based CPSC程序(https://github.com/WHU-Fenglab/RI-based-CPSC)校正后,用MS-DIAL軟件(版本4.70)[36]進行峰檢測、去卷積以及峰對齊(Joint Aligner算法)處理。峰對齊的標準參數設定為RT誤差范圍0.1 min,質荷比誤差(Δm/z)范圍0.005。

2 結果與討論

通過對甘氨酸與一系列正構脂肪酸進行酰胺化反應,合成了一系列N-?；拾彼嵬滴?圖1a)。為了評估這些N-?；拾彼嵬滴镌贚C-MS的分析性能,我們進行了色譜保留時間和質譜響應的測試。如圖1b所示,在一個固定的25 min色譜梯度條件下(圖1b, 虛線), 22個N-?；拾彼嵬滴锏谋Ａ魰r間覆蓋了0.8～24 min的時間窗口,相鄰同系物的保留時間差約為1 min。此外,質譜分析結果顯示,在正、負離子模式下,這些同系物均表現出較強的質譜響應,LC-Q-TOF MS分析的定量限(信噪比為10)分別為5.8～93.6 μg/L(正離子模式)和2.3～11.9 μg/L(負離子模式)。

以合成的N-?；拾彼嵬滴餅樾Ｕ?建立了N-acyl glycine RI系統。N-acyl glycine RI的計算方法如圖2a所示。以順式肉桂醛為例,在正離子模式下,其RT為8.9 min,位于Gly-C7和Gly-C8的保留區間內。通過計算,可得該化合物的RI值為781(圖2b(Ⅰ))。類似地,在負離子模式下檢測到的3-羥基十二烷酸的RI值也可以被計算為1 133(圖2b(Ⅱ))。

圖 2 (a)保留指數計算示意圖,(b)順式肉桂醛(Ⅰ)和3-羥基十二烷酸(Ⅱ)的RI計算示例Fig. 2 (a) Schematic diagram of RI calculation, (b) an example of RI calculation presented for (Ⅰ) cis-cinnamaldehyde and (Ⅱ) 3-hydroxydodecanoic acid RI: retention index. n, n+1: the carbon numbers of the fatty acid chain of the calibrants.

我們使用了包含73個標準品的混合溶液作為測試樣,并考察了在流動相流速、色譜梯度、色譜柱和儀器系統等色譜條件變化的情況下(附表S2),N-acyl glycine RI系統對RT系統偏移的校正能力。結果表明,N-acyl glycine RI系統可以較好地修正由于上述因素引起的RT偏移(附圖S1)。

基于N-acyl glycine RI,我們構建了一種新的色譜峰漂移校正模型(RI-based CPCS模型)。該模型使用RI策略對原始LC-MS數據中所有時間點進行修正,使得多次LC-MS分析所得的時間點可與參考樣品的時間點對齊,提高了峰對齊準確性(圖3)。其中,參考樣品指在實際分析過程中,某個被選擇作為參考的樣品。RI-based CPCS模型的具體工作流程和原理如下。

首先,使用公式(1)計算出色譜時間窗內所有采集時間點所對應的RI值:

(1)

其中,tGly-Cn和tGly-C(n+1)為實際樣品中添加的校正物保留時間;t為色譜時間窗口內的某一個給定時間點;RI為在該時間點下對應的保留指數;n和n+1為校正物脂肪酸鏈的碳數目。

隨后,使用公式(2)計算出修正后的時間點,以實現與參考樣品的對齊:

其中,t′表示校正后的時間點;tR(Gly-Cn)和tR(Gly-C(n+1))為參考樣品中添加的校正物保留時間。

最后,使用開源的代謝組學數據處理軟件MS-DIAL對修正后的LC-MS數據進行色譜峰對齊。

為了方便計算,我們還開發了一個基于Python語言的自動化修正程序,該程序可免費獲取于https://github.com/WHU-Fenglab/RI-based-CPSC。

圖 3 基于N-?；拾彼岜Ａ糁笖档纳V峰偏移校正原理圖Fig. 3 Schematic diagrams for the N-acyl glycine RI- based chromatographic peak-shift correction tGly-Cn and tGly-C(n+1): retention time of Gly-Cn and Gly-C(n+1) in a sample; t1, t2, and tn: time points in the chromatographic window; RIGly-Cn and RIGly-C(n+1): retention index of Gly-Cn and Gly-C(n+1) in a sample; RI1, RI2, and RIn: retention index for each time point in the chromatographic window; tR(Gly-Cn) and tR(Gly-C(n+1)): retention time of Gly-Cn and Gly-C(n+1) in reference; t′1, t′2, and t′n: adjusted time points in the chromatographic window.

我們對RI-based CPSC模型的峰對齊性能進行了考察。采用同一份人糞便樣品作為測試樣,分別在第1、49、104和157天進行LC-MS分析。采用隨機抽樣的方式,共從22 min的LC-MS分析時間窗口內選擇220個色譜峰,通過人工檢查這些色譜峰在4次LC-MS分析中的峰對齊結果,以評估峰對齊的準確性。結果表明,未經RI-based CPSC模型修正的峰對齊率僅為15.5%;而使用RI-based CPSC模型修正后,峰對齊率則可提高至80.9%。這說明RI-based CPSC模型在處理長時間分析數據時具有顯著的優勢,能有效提高峰對齊的準確性。該結果也表明RI-based CPSC模型在實際應用中具有可行性和有效性。

3 結論

本文提出了一種基于N-acyl glycine RI系統的色譜峰對齊新方法。該方法可以實現N-?；拾彼嵝Ｕ锼采w色譜時間窗內的所有時間點的校正,從而顯著提高多批次LC-MS分析所得結果的峰對齊準確度?？傊?該方法在大規模代謝組學研究中具有較大的應用潛力。